1、 中山大学博士学位论文人源性同种异体去细胞周围神经的制备方法学与结构组成成分的相关分析研究姓名：易建华申请学位级别：博士专业：外科学指导教师：刘小林20081010易建华师：刘小林教授外科学组织工程化周围神经位：中山大学附属第一医院骨显微外科摘近年来，随着组织工程学的兴起和发展，组织工程化周围神经已成为周围神经研究中的重要方向；它具有不受供体来源限制、根据需要随意塑形和手术时间短等优点。组织工程化周围神经中同种异体神经，由于其具有神经基底膜管架结构的特点，理论上是非常理想的移植修复材料；但也存在宿主免疫排斥的问题。宿主对同种异体神经的免疫排斥主要源于供体神经的雪旺细胞和髓鞘膜上携带的主要组织相
2、容性抗原复合物；而细胞外基质的基底膜管，由于分子量小，免疫性很低。利用化学试剂去除同种异体神经组织中的雪旺细胞、髓鞘以及可溶性糖胺等物质，减弱其抗原性后又保留其基底膜样结构，再应用于周围神经的修复，这方面的研究也越来越多。实了经过人源性同种异体去细胞神经材料的特殊性，故其制备方法的标准性必须列制备条件进行重新比较研究来予以确定，标准化的制备方法是进行临床生物安全性检测与临床验证之必不可少的路径。并且目前所研究的去细胞同种异体去细胞神经材料多是基于大鼠或猕猴的动物模型材料，对于人源性材料，究竟其内在结构、组织成分、超微结构有什么特点，其相应的生物学行为相关性有哪些均为研究空白；而这些研究空白的填
3、补，对于人体运用时其生物安全性、有效性的评估，甚至作用机制的阐明均有积极和不可缺少的意义。因此，本实验拟在本课题组以往实验和参考国内外相关文献的基础上，通过采指标比较分析第一组：神经组织号菹每次一蜒醯崮普竦次，每次一上述第二组：神经组织号菹竦次，每第五组：神经组织号菹竦次，每次竦次，每次上述步骤重复一次。第六组：未萃取的新鲜神经作为对照。均经过第一部分中确定的标准萃取流程处理，制备成人源性去细胞同种异体神经材人源性去细胞同种异体周围神经材料制备后清洗液量和次数对萃取剂残留浓度的比较。结果阳性尤其明显。突成分去除最彻底。经形态的完整性和雪旺细胞、轴突去除干净程度未见有明显统计学差异。甈清洗液与制
4、备萃取好的神经体积比比其比值为更能降低 和的残留浓度，两种体积比之间可见有明显统计学差异。结论与外科缝合条件下大致可满足临床修复的脱细胞支架材料。神经无菌号菹免疫组化蛋白电人源。同种异体之细胞周嗣神纾的制矫办法学与结构组成成分篔十父分析研究 ， 山大学博十学位论文 “ 猰簍 “ 叶 簍 ： 籥 篹 瑀 肐嗣芯闹票赴旆虢崽兆槌沙煞值呐父分析研究 ，甌甌 甌 ， ， 甇 一 ：缩略词缩写 羣日期：二零零八年十月十二日期：国年月谄日来源有限，有时供体神经可缝无法充分弓己椭谥嵬辉偕！供区出现功熊障碍，人源忭种异体上细胞用窬闹欺粆办法学与鲜与组成成分州十恕趂肼艽作用。的预先调控，具有良好的生物相容性，可
5、被人体吸收，目前被广泛的应用于人工神经。最常用的合成聚合物是及其共聚物。均属痪埘唷有三种异构体，、谔迥诮到馍扇樗幔翘堑拇徊铮籔在体内降解为羟基乙酸，易于参加体内代谢。聚合物中的酯健易于水解，属非酶性水解。共聚物的降解时间可通过改变两者的比例来调控，约为几周到几年。这类聚合物属热塑性塑料，可通过模塑、挤压、溶剂浇铸等技术加工成各种结构形状。因其降解产物无毒性及良好的生物相容性，已被美国食品与卫生管理局因此在设计、构建组织工程化周围神经的复杂过程中，神经支架是对细胞外基而生物型材料中制备的周围神经支架是指天然生物组织经过一系列物理或化学方法处理后，去掉细胞成分和抗原性，部分或完全去除无机质或有机质
6、，同时保存原来组织网架结构的一种生物材料，包括维持组织原有构型，仅消除其免疫排斥反应的较轻微处理过的组织。虽然它也有上述所说的一些不足，但随着处理方法的不断改进，其优越性不断加强；该种材料非人工合成，而是来源于同种或异种天然生物组织，所以具有最接近人体的网架结构、生物力学性能和部分活性因子，与细胞亲和性强，能为细胞生长、增殖、分化及产生和维持各种功能提供近似体内组织发料本身所保留的成分不仅具有引导或诱导组织再生的能力，而且移植后很快与受体是组织功能恢复所必需的虼怂哂薪洗蟮氖导视眉壑怠。生物型异体周围神经支架的制备物理方法：主要包括反复冻融、冷冻干燥、加热等。山大学博十学位沦文轴突再生能力介于两
7、者之间。等分别将大鼠坐骨神经和臀肌在山人学博十学位沦文山大学博十学位沦文察神经内的细胞成分消失，纤维性支架结构与未经萃取的神经相仿；电镜下可见萃取后的神经由空的神经基底膜管及其之间的胶原纤维构成，故作者认为此法可能是制备具有仿生结构的人类组织工程化神经支架较为理想的方法。与朱庆棠的方法不同，取先将人类周围神经个月，然后用处理得到的神经支架由空的神经内膜管及存留的细胞外基质结构组成，无细胞和髓鞘；并且具有与正常神经相似的力学特性。但是后者费时较长，同时所用化学试剂较多，有的具有较大毒性，可能不利于在组织工程周围神经产业化中的临床应用。刘小林等【肧萃取神经的方法处理大鼠后肢股二头肌，移植修复同种异
8、体鼠坐骨神经缺损，术前组织化学观察见化学处理消除了肌纤维和其中的大部分蛋白质，形成中空的支架结构；术后免疫组化的结果显示化学萃取制备的材料的轴突长入和雪旺细胞迁移较冻融组迅速，说明化学萃取骨骼肌可以用于修复神经缺损，而且在有些方面要优于冻融骨骼肌。和 把盐酸利多卡因经皮注射至鼠胫前肌内，小时后人源件籨种异体去细胞用用神经的捌衍力；去学与结构组成陂葜萑，缺损。由于人体神经与大鼠、猕猴相对粗大乇鹗亲巧窬稚窬，并且神经大小差异悬殊；经过化学处理的时间和程序也可能需要相应改变；目前文献与本课题组研究均未涉及到人源性同种异体去细胞神经材料的特殊性，故其制备方法的标准性必须对制备条件进行重新比较研究来予以
9、确定，标准化的制备方法是进行临床生物安全性检测与临床验证之必不可少的路径。并且目前所研究的去细胞同种异体去细胞神经材料多是基于大鼠或猕猴的动物模型材料，对于人源性材料，山大学牌十学何论文人源忡同科异体去细胞用用芯闹平冒旆 虢峁棺槌沙煞值呐父分析研究第一部分周围神经纤维可以有髓鞘，也可无髓鞘。无髓鞘的或仅有稀疏髓鞘的纤维，数个轴突被一个雪旺细胞包绕。而髓鞘较厚的纤维，雪旺细胞旋转形成一个多层结构的髓鞘，包裹一条轴突。一个雪旺细胞包绕的一段有髓神经纤维称为一个结间段，长度为“，有髓纤维的髓鞘越厚，结認段就越长。一个雪旺细胞的末端和另一个雪旺细胞的起点汇合处髓鞘相对稀疏，称为结问隙或郎飞氏结【。轴突
10、及其雪旺细胞和髓鞘又被一薄层称为神经内膜的稀薄纤维组织所包绕。纵向看，神经内膜形成一个管分别包绕一些雪旺细胞，上述结构集合在一起形直未见有后续报道，值得进一步研究证实。材料和方法山一院提供。肢体捐献同意书模板如下：本人因患肢受伤严重，有以下六点中之其一：豢尚薷吹难现厮鹕耍人源悱同种片休太细胞周耒闹平冒旆虢崽兆槌沙煞值母蒆火分析研究修复的神经损伤。根据现有医学水平确实无法修复存活；或者存活后无实用功能，给本人生活和工作会带来不良影响；并且还不如截肢后安装假肢的功研究及临床实验，为科学技术进步提供帮助，特此证明。家属月 日青霉素和链霉素自浦埔高压灭菌蒸汽锅阒菀搅粕璞赋显微外科手术器械谐珊拖晕餍党恒温水浴箱瓺泄恒温振荡器瓹型战鸪枪笛橐瞧鞒定氮蒸馏装置瘴浣人源件同种异体去细胞周窬闹品虢峁棺槌沙煞值哪闔天分忻研究人源性去细胞同种异体周围神经支架材料的制备：实验一共分为六组：在 水浴箱中速振荡狿冲洗椋勘辉俜湃胧脱氧胆酸钠冲洗椋勘辉俜湃胧在 水浴箱中速振荡狿冲洗椋勘俜湃胧脱氧胆酸钠
