1、1实验安排实验一、ELISA 板包被，封闭；小鼠抗原免疫；补体结合实验实验二、小鼠脾细胞提取及计数实验三、流式（测小鼠血 T 细胞） ；NO 测定； 双扩；血型鉴定实验四：ELISA；妊娠反应（试纸法）实验一：ELISA 板包被，封闭小鼠抗原免疫 眼球取血（一）包被 、封闭 ELISA 反应板1. 实验步骤：a. 微量加样器的使用b. 包被 ELISA 反应板 ，37 孵育 1 小时。c. 封闭 ELISA 反应板 ，37 孵育 0.5 小时。2. 实验目的：检测小鼠抗绵羊红细胞抗体水平3. 试剂与器材：a. 包被稀释液（0.05mol/L Na2CO3NaHCO3 缓冲液， pH9.6）Na
2、2CO3 1.5g； NaHCO3 2.9g 加双蒸水至 1000mlb. 封闭液（5%小牛血清/PBS 溶液）小牛血清 50ml；PBS（pH7.4）950mlc. 洗涤液（PBST，pH7.4）NaCl 8.0g；KH2PO4 0.2g；Na2HPO4.12H2O 2.9g；KCl 0.2g；Tween 20 0.5ml 加双蒸水至 1000ml4. 操作方法：包被酶标反应板：a. 待测血清：绵羊红细胞（SRBC）免疫小鼠血清b. 用 pH9.6 的碳酸盐缓冲液 1：200 稀释的抗原 SRBC，用之包被聚乙烯塑料板。c. 每孔加 100ul， 37温箱孵育 1 小时2封闭酶标反应板d.
3、弃掉包被液，加入 200ul PBS 洗涤 3 次，每孔洗 3 遍，每遍 1min。e. 甩干后用 5%小牛血清/PBS 液封闭，每孔 200ul。放 370.5 小时。f. 封闭结束后，弃掉封闭液，加入 200ul PBS 洗板 3 次，并在滤纸上拍干，每孔洗 3 遍，每遍 1min。步骤说明：1. 酶联免疫吸附试验技术（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA） （定量、定性实验）：是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA 过程包括抗原 (抗体)吸附在固相载体上称为【包被
4、】 ，加待测抗体(抗原), 再加相应酶标记抗体(抗原), 生成【抗原(抗体)- 待测抗体( 抗原)- 酶标记抗体】的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。2. 【包被】：就是将已知抗原或抗体吸附于固相载体表面并保持其免疫原性。在 ELISA 板上加上抗原以后，因为电荷数与板不同，所以抗原吸附板上，但是吸附后固相载体表面尚有未被占据的空隙；3. 【封闭】：就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而防止在 ELISA 其后的步骤中干扰物质的再吸附原理：4. 抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面,可能是蛋白和聚
5、苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附,并保持其免疫学活性; 5. 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物,而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性; 6. 酶结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在,而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的,因此,可以按底物显色的程度显示试验结果. 注意事项：1. 量取样品时选择适当量程的加样器， （P20： 0.520.0 l；P200： 20200 l； P1000：2001000 l）2. 安装相应的枪头（白色 P20，黄色 P200，蓝色 P1000）（2）小鼠腹腔免疫1. 实验动物：昆明鼠 6-
6、8 周，雌性2. 实验药品：抗原：绵羊红细胞（SRBC）3. 腹腔注射：5%的 SRBC 注射 2ml4. 操作步骤：3免疫细胞的制备：准备适量的全血细胞：SRBC1500rpm*10min小心吸弃上清，留红细胞沉淀3mL 生理盐水，重悬细胞沉淀重复上述步骤，反复洗 3 次。第三次离心后：3mL 生理盐水，重悬细胞沉淀：制备好的 SRBC.腹腔注射：左手提起并固定小鼠，使鼠腹部朝上，鼠头略低于尾部。右手持注射器将针头在下腹部靠近腹白线的两侧进行穿刺，针头刺入皮肤后进针 3mm左右。使注射针头与皮肤呈 45角刺入腹肌，穿过腹肌进入腹膜腔，当针尖穿过腹肌进入腹膜腔后阻力消失，有落空感。固定针头，保
7、持针尖不动，回抽针栓，如无回血、肠液或尿液后即可注射。注射量为 2ml，标记小鼠。5. 注意事项：免疫之前排空注射器中的空气；SRBC 使用之前要混匀；.进针后的落空感。（3）小鼠眼球取血1. 实验目的：小鼠腹腔抗原（SRBC）免疫后，小鼠体内产生了抗体，抗体（抗 SRBC抗体）主要存在于血清内。眼球取血主要目的为收集血清。2. 实验药品：麻醉用药：4%水合氯醛；3. 实验步骤：a. 小鼠麻醉麻醉用药：4%水合氯醛；用量：每只小鼠 0.4ml，腹腔注射b. 眼球取血：1、抓取小鼠，使眼球突出2、用眼科【弯镊】深入眼球深部，带着结缔组织，慢速夹去眼球，用 1.5ml 微量离心管接住流出的血液，每
8、次采血量 0.5-1ml 3、实验台上静置 2h（11 点左右）4、离心 10000rpm，10min，收集血清，-20保存c. 把取完眼球血的小鼠泡在装有 70%酒精的烧杯中，接续【实验三】d. 将眼球血离心 10000rpm，10-15min， e. 使用 1000L 加样器收集血清 （4）4实验二：补体结合试验1. 实验试剂：2% sRBC；溶血素（血清中含有家兔 -抗-sRBC 抗体） ；补体（新鲜的豚鼠血清） ；生理盐水2. 实验器材：小试管、微量加样器、水浴箱3. 实验步骤：a. 标记 3 个清洁、干燥的试管b. 加样（加样顺序如图）c. 水浴，37，孵育 10m4. 注意事项：a
9、. 挑选干燥、洁净是试管。若有水的试管会导致红细胞不等渗溶血。b. 水浴箱不可关闭水浴箱的盖子。水浴箱的盖子上的水若调入试管中，会造成反应体系不等渗，进而导致红细胞因为渗透压的差异而破裂溶血。5. 实验结果：1 号管中试剂变澄清，2.3 号试管均浑浊实验三：小鼠脾细胞提取及计数1. 实验原理：脾脏是人类最大的免疫器官，捕获血源性抗原，储存血液。是动物体内最大的淋巴器官。深居于左侧肋弓之后，颜色暗红、质地柔软、呈内侧向内凹陷的扁椭圆形或条索状等。脾为表面有被膜覆盖的实体性器官。脾细胞主要成分：淋巴细胞，是执行免疫功能的重要细胞。为进一步了解和检测淋巴细胞的数量和功能，还需要制备脾细胞悬液。2.
10、实验试剂与器材：SRBC 免疫一周的小鼠（眼球取血后的死亡小鼠） ；PBS 液作用是等渗、平衡渗透压、维持离子强度和 PH；70%酒精作用是消毒红细胞裂解液2ml 冷 NH4Cl动物解剖器械平镊和齿镊、5ml 注射器、平皿、1.5ml 微量离心管、15ml 离心管、吸管、盖玻片。离心机，细胞计数板，显微镜3. 实验步骤：a. 取脾：将眼球取血后的小鼠颈椎脱位法处死；70%酒精皮毛全部浸湿 3-5 分钟，右侧卧位；左手持镊（尖头）提起皮肤，右手持剪刀于左侧肋骨最低点与髋关节间做一小切口 ；双手持镊子与切口垂直方向钝性分离皮肤，暴露腹膜；5左手持镊提起腹膜右手持剪刀于腹膜做一小切口，双手持镊子与切
11、口垂直方向钝性分离腹膜，充分暴露视野，于左侧肋缘下可见暗红色条索状脾脏；持【平镊】轻轻夹住脾脏，尽可能分离结缔组织和系膜（注意防止脾脏破裂） ；将取下的脾脏放入装有 5mlPBS 液的平皿中。b. 脾细胞提取：方法 冲洗法 研磨法优点 制备的细胞数比较少，细胞比较分散；能够保持细胞的完整性，细胞不易破损省时，便于大量操作缺点 不能保证细胞的完整性平镊轻轻夹住脾，用 5 毫升注射器吸取 5mlPBS 液，刺入脾脏冲洗脾细胞；拔掉针头用注射器吸取平皿中 PBS 液反复冲洗 2-4 次，直至脾脏由暗红色变为白色；把所获得的细胞悬液收集到 15 毫升离心管内，加 PBS 液至 10ml（方便离心时配平
12、） ；c. 三次离心目的 操作获得脾细胞 收集离心管配平，1500rpm 离心 10min。去上清（沉淀贴壁面朝上倾倒上清）裂解红细胞 使用吸管（每吸一次大约 1ml）吸取 2ml 冷 NH4Cl 裂解 RBC。 【混匀】细胞后放置约 5min。加 PBS 液至 10ml；1500r/min 再离心 5min，去上清洗涤细胞 加 PBS 液 5ml 洗涤（上下吹打） ，1500r/min 离心 10min 去上清 。悬浮细胞于 1ml 的 PBS 液中【混匀】 。d. 弃上清，向离心管中加入 1ml PBS 液，充分混匀，得混匀液e. 计数液 100 倍稀释：先在 EP 管里加入 990 微升
13、 PBS 液，从混匀液中吸取 10 微升加入到 1.5ml 微量离心管中涮一下枪头，反复抽吸几次，充分混匀。f. 显微镜计数：10物镜找到细胞层和计数室；40物镜找到白细胞计数区域。原则是从左到右 S 形计数，数上不数下，数左不数右实验四：抗原抗体反应1. 实验原理：a. 概念：体内外发生的高度特异性结合反应，其结构基础为抗原表位与抗体超变区抗原结合位点的结构互补。b. 特点：特异性；非共价键结合；比例要适当c. 影响抗原-抗体反应的因素：电解质：0.85%氯化钠溶液；温度：37；酸碱度：pH6-8。抗原抗体复合物可在一定条件下解离，而免疫学特性不变。6d. 凝集反应：在颗粒性抗原或吸附于颗粒
14、上的可溶性抗原（或抗体）中加入相应的抗体（或抗原） ，在电解质存在的条件下出现凝集物的现象，称凝集反应。参与反应的抗原如细菌，细胞等，称凝集原，抗体称为凝集素。包括直接凝集反应（玻片反应、试管反应）和间接凝集反应。本次实验为玻片反应。e. 凝集反应分类：直接凝集反应：试管法和玻片法（反应界面）间接凝集反应间接凝集抑制试验协同凝集反应抗球蛋白试验玻片法简便，快速，为定性试验，可做为半定量检测前的筛查试验，因该反应在玻片上进行而被命名玻片法 ，主要用于临床的血型鉴定，菌种鉴定 2. 实验器材：人外周血；抗 A、抗 B 标准血清；（蓝色的为抗 A，黄色的为抗 B） ；玻片（两种） ，采血针，棉签，酒
15、精等3. 实验步骤：a. 准备玻片：取清洁载物玻片一张，于玻片左侧和右侧各加一滴抗 A 及抗 B 标准血清b. 采血：用无菌采血针刺破指尖或耳垂，用灭菌玻片的四个角（取 2 个即可）分别取血，加入含有抗 A 及抗 B 标准血清的液体中c. 反应：经 12 分钟后用肉眼观察结果，出现红细胞凝集颗粒者即为阳性反应；仍为均匀混悬液者为阴性反应。实验五：双向免疫扩散实验1. 实验原理：在含有电解质的凝胶中，可溶性抗原和相应抗体辐射扩散，形成浓度梯度，在比例适合处形成肉眼可见的白色沉淀线。一条沉淀线为一组特异性抗原抗体复合物。2. 结果分析：a. 沉淀线数量：对抗原抗体复合物只形成一条沉淀线；b. 沉淀
16、线形状：沉淀线对于相应的抗原抗体是不可以通透的，对无关的抗原抗体是可以通透的；沉淀线的外形与反应物的分子量有关，通常趋向分子量较大的一方 c. 沉淀线位置：与反应物的相对浓度有关，通常靠近浓度小的一方3. 实验目的：检测病人血清中的甲胎蛋白（AFP）4. 实验试剂与器材：待测病人血清：待测 1，待测 2；阳性对照血清（p） ；抗 AFP 诊断血清；1.5食盐琼脂；琼脂板、打孔器，微量加样器，湿盒5. 实验步骤：a. 第一步：铺板将 4ml 琼脂倒入琼脂板中。b. 第二步：打孔打 7 个小孔,约 7mm 间距。c. 第三步：加样每空加样约 1015l。7d. 第四步：孵育放入 37温箱孵育约 2
17、4 小时。6. 注意事项：倒胶要快速；打孔无裂缝；孔勿靠近琼脂边缘；加样不溢出；加样无气泡；清洗加样器7. 结果分析：阳性对照孔和样品孔分别与 SRBC 小孔之间出现白色沉淀线。两条沉淀线相会后融合在一起，说明样品孔与阳性对照孔为相同成分。实验六：小鼠巨噬细胞 NO 的测定1. 实验试剂与材料：NaNO2 标准品（100M） ；1640 培养液；待测样品（1，2） ； Griess 试剂：使用之前两液等量混合 【NED 0.2% (0.02g 2.5H3PO4 10ml )用超声波溶解，SA 2%(0.2g 2.5% H3PO4 10ml ) 】 ；微量加样器、枪头、板条。2. 实验原理：a.
18、 巨噬细胞功能：强大的吞噬杀伤病原微生物的能力；重要的抗原提呈细胞，可摄取、加工处理及提呈抗原，激发适应性免疫应答；活化的巨噬细胞分泌大量细胞因子、补体成分及 NO 等，调控免疫应答。b. 诱导型 NO 合成酶（iNOS）系统为巨噬细胞活化后所产生的反应性氮中间物。iNOS属胞浆酶，在还原型辅酶 II 或四氢生物蝶呤存在下，可催化 L-精氨酸与氧分子反应，生成胍氨酸和 NO。NO 与吞噬细胞氧化酶所产生的过氧化氢或过氧化物酶结合，在体内酸性环境中产生可杀伤细菌的过（氧化）亚硝酸盐基，其在酸性环境中与 Griess 试剂中的磺胺和 N-奈基乙二胺双氯化物进行重氮、偶氮反应，产生鲜艳橙红色产物。因
19、此通过 Griess 法检测 NO 的水平来反映巨噬细胞的活化程度。3. 实验步骤：a. 于孔 28 中每孔加入 100l 1640 培养液b. 于孔 1 中加入 200l NaNO2 标准品c. 从孔 1 中吸出 100l 加入 2 中，吹吸 3 次，再从 2 中吸出 100l 加入 3 中，吹吸 3次，再从 3 中吸出 100l 加入 4 中，吹吸 3 次，以此类推，直至第 7 孔，混匀后吸取100l 弃掉。1P2Ab12P7mm8d. 于 9 和 10 中加入待测 1，11 和 12 中加入待测 2，每孔 100l e. Griess 试剂，每孔 100 l，室温 10 分钟，观测结果实
20、验七：小鼠外周血 T 细胞亚群的鉴定流式细胞术1. 实验原理：a. 流式细胞术：（FlowCytometry，FCM）利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。b. 流式细胞仪特点：特异性好；灵敏度高（一般能测出单个细胞上600 个荧光分子,两个细胞间的荧光差5% 即可区分） ；多参数分析（细胞大小，胞内颗粒丰富程度，荧光强弱） ；快速采集分析（每秒可检测 1000-5000 细胞，甚至上万个细胞） ；客观性；流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度1000 个/秒，分选细胞纯度可达99%以上c. 流式细
21、胞仪工作原理：将待测标本制备成单细胞悬液,经荧光标记抗体染色后由气压装置送入流动室。流动室由样品管和鞘液管组成,鞘液管充满流动的鞘液,鞘液流与样品流压力不等,当两者压力差达到一定程度时,鞘液裹挟着样品流迫使细胞有序地排列成单列,逐个进入激光聚焦区经激光束激发,产生散射光和荧光信号；通过一些波长选择通透性滤光片,即可将不同波长的散射光和荧光信号区分开来。散射光和荧光信号接收后转换成数字信号送计算机处理,可在计算机上直观地统计染上各种荧光染料的细胞各自的百分率。d. 流式细胞仪应用： 分选细胞（严格无菌操作） ；分析细胞大小和内部复杂程度 （颗粒性） ；检测细胞表面表型: 抗细胞表面抗原抗体 ,
22、MHC 四聚体等；透化细胞后细胞内蛋白染色；追踪细胞和 增殖 (CFSE)；分析细胞内离子浓度；分析氧化还原 (redox)电位；分析细胞周期 (用结合 DNA 的染料) ；凋亡分析 (annexin V, TUNEL etc)；细胞因子分泌实验 (以及其后的分离 )；多重蛋白分析实验e. 设立阴性对照管的意义：去除自发荧光，调节电压f. 设立单标管的意义：不同荧光之间会有叠加，必需通过调节补偿来校对。g. 设立同种型对照管的意义：用于消除由于抗体非特异性与细胞结合而产生的背景染色h. 同种型对照：是使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗
23、体非特异性与细胞结合而产生的背景染色。同种型对照是真正意思上的阴性对照。2. 实验试剂与器材：a. 昆明鼠b. 肝素（抗凝）c. 同种型对照抗体：CD3-FITC；CD4-PE；CD8-PerCPd. 荧光抗体：CD3-FITC；CD4-PE；CD8-PerCP9e. 红细胞裂解液：0.17 mol NH4Cl，PBS 液f. 眼科镊、微量加样器、微量离心管、枪头、流式管、离心机等。3. 实验步骤：a. 小鼠眼球取血后加肝素抗凝（100ul/管）b. 将血液分装到 2 支不同试管中，1 号管加同种型对照的三个抗体，每个 10ul; 2 号管加三种荧光抗体各 10ul。加荧光抗体后，室温静置 5minc. 每管加红细胞裂解液 1ml ，室温孵育 5 分钟d. 每管加 2ml PBS，起到终止裂解，清洗作用e. 离心 1500rpm, 6minf. 弃上清，加 500ulPBS 混匀，上样，待检4.
