1、 基 础 研 究 氟 暴 露 下 细 胞 信 号 转 导 通 路 的 改 变邱 志 伟，高 峰，陈 从 山，张 远 洋，赵 乐，刘 艳 洁（十 堰 市 太 和 医 院 康 复 中 心，湖 北 十 堰；贵 州 医 科 大 学 临 床 医 学 院 病 理 学 教 研 室，贵 州 贵 阳）摘 要 目的 检 测 信 号通路 中 磷 酸 化 的 细 胞 外 信 号 调 节 激 酶（）及 在 氟 暴 露 下 细胞中 的 表 达，探 讨 信号通 路与氟暴 露 下 神 经 损 伤 机 制 的 关 系。方 法 用 不 同 剂 量 氟 化 钠（，.、.、.、.、.、.、.、.、.、.及.）处 理 细胞 及，采 用
2、 实 验 筛 选 出 低 和 高 剂 量 氟 中 毒 浓 度；再 以 正 常 组 细 胞 为 参 照，用 低、高 剂 量氟 化 钠 剂 量 分 别 处 理 细 胞 和，采 用 实 时 荧 光 定 量 检 测 处 理 时 各 组 细 胞 的 水 平，用 检 测、蛋 白 表 达 水 平。结 果 染 氟 处 理 后，.、.处 理 细 胞 及 细 胞 的 存 活 率 均 低 于 正 常 对 照 组（.），可 作 为 低 剂 量 组 和 高 剂 量 组 的 染氟 剂 量；染 氟 时，对 照 组、低 剂 量 组 和 高 剂 量 组 细 胞 中 的 表 达 水 平 分 别 为.、.、.，组 间 比 较 均
3、无 统 计 学 意 义。染 氟 时，蛋 白 高 氟 组 较 低 氟 组 和 正 常组 表 达 升 高，差 异 有 统 计 学 意 义（.），而 染 氟 时，染 氟 组 蛋 白 表 达 升 高，各 组 间 比 较 均 有 统计 学 意 义（.），染 氟 和 正 常 组、低 氟 组、高 氟 组 蛋 白 表 达 水 平 分 别 为（.、.、.）、（.、.、.）；染 氟 后，总 蛋 白 升 高，高 氟 组 较 低 氟组、正 常 组 有 意 义（.，.），而 染 氟 后，染 氟 组 较 正 常 组 升 高 有 统 计 学 意 义（.，.），染 氟 和 总 蛋 白 表 达 水 平 分 别 为（.、.、.）
4、，（.、.、.）。结 论 信 号 通 路 中 蛋 白 及 蛋 白 在 慢 性 氟 中 毒 时 被 激 活，随 着染 氟 时 间 与 染 氟 剂 量 增 加 其 表 达 水 平 出 现 逐 渐 升 高，其 可 能 参 与 代 偿 性 神 经 保 护 机 制 对 抗 氟 的 神 经 毒 性 作 用。关 键 词 氟；暴 露；信 号 转 导 通 路；改 变 中 图 分 类 号 文 献 标 识 码 文 章 编 号（）：，（，；，）（），（，.，）；第 卷 第 期 年 月 贵 州 医 科 大 学 学 报 基 金 项 目 国 家 自 然 科 学 基 金（）通 信 作 者：引 用 本 文：邱 志 伟，高 峰，
5、陈 从 山，等 氟 暴 露 下 细 胞 信 号 转 导 通 路 的 改 变 贵 州 医 科 大 学 学 报，（）：，；，（），（），（），（，；.，.，），；（，.）；，（，）；（，）（，），；（）；分 裂 原 激 活 蛋 白 激 酶（，）家 族 信 号 系 统 广 泛 存 在 于 多 种细 胞，与 神 经 退 行 性 疾 病 有 密 切 的 关 系，该 系统 可 将 细 胞 外 刺 激 信 号 转 导 至 细 胞 内、或 细 胞 核内，使 细 胞 发 生 增 殖、分 化、转 化 及 凋 亡，影 响 神 经突 触 的 传 递 和 神 经 元 的 重 塑 及 形 态 分 化，对 学 习 记忆 功
6、 能 发 生 影 响。有 研 究 发 现，信 号 转 导 通路 改 变 是 慢 性 氟 中 毒 性 脑 损 伤 机 制 中 的 重 要 参 与因 素。（）是 系 统 中 的 重 要 组 成 部 分，信 号 转导 通 路 也 是 信 号 转 导 通 路 中 较 新 的 一 条 通路。细 胞 外 调 节 蛋 白 激 酶，（，）作 为 家 族 的一 员，研 究 表 明 的 活 化 对 于 细 胞 增 殖、分化 等 生 理 过 程 是 必 需 的，亦 与 许 多 疾 病 的 发 生有 着 一 定 的 关 系。氟 离 子 可 以 通 过 血 脑 屏 障 在脑 组 织 中 蓄 积、并 造 成 中 枢 神
7、经 系 统 损 害，长 期 摄入 过 量 氟 会 影 响 神 经 细 胞 的 正 常 生 理 功 能，在 地 方性 氟 中 毒 病 区 的 患 者 常 出 现 记 忆 力 减 退、头 痛、头晕 及 共 济 失 调 等 神 经 系 统 症 状。关 于 慢 性 氟 中毒 对 神 经 损 伤，在 前 期 的 研 究 较 多，而 信号 转 导 通 路 在 氟 中 毒 方 面 尚 未 见 研 究，本 实 验 通 过复 制 及 细 胞 模 型，探 讨 信 号 通 路在 氟 中 毒 细 胞 中 被 激 活 的 相 关 机 制，报告 如 下。材 料 与 方 法.实 验 材 料.细 胞 及 主 要 试 剂 细
8、胞（德 国 公 司）；培 养 液（英 国 贵 州 医 科 大 学 学 报 卷 公 司），胎 牛 血 清（，美 国 公 司），二 甲基 亚 砜（），氟 化 钠（，美 国 公 司），培 养 细 胞 用 青 霉 素 链 霉 素（美 国 公 司），（日 本 同 仁 公 司）；电 泳 系 统（美 国 公 司），磷 酸 化（）、总 及 抗兔（与 辣 根 过 氧 化 物 酶 联，美 国 公 司），发 光 试 剂（瑞 典 公 司），总 蛋 白 提 取 试 剂、裂 解 液、二 喹 啉 甲 酸（）蛋 白 定 量 检 测 试 剂 盒（碧 云 天 生 物 技 术 研 究 所）。.主 要 仪 器 垂 直 电 泳 槽、电
9、 泳 仪（美 国 公 司），型冷 冻 离 心 机（美 国 公 司），型 脱 色摇 床（江 苏 海 门 市 其 林 贝 尔 仪 器 制 造 有 限 公 司），酶 标 仪（美 国 公 司）；总 提 取试 剂 盒（美 国 公 司），（上 海 捷 瑞生 物 工 程 有 限 公 司），合 成 试 剂 盒（美 国 公 司），核 酸 定 量 仪（美 国 公 司），仪（美 国 公 司）。.研 究 方 法.低、高 剂 量 氟 浓 度 筛 选 及 分 组 分 别 用 不同 剂 量 处 理 细 胞、，通 过 实 验 筛 选 出 氟 中 毒 实 验 浓 度；以 正 常 组 细 胞 为 参 照，用 低、高 剂 量 氟
10、分 别 处 理 细 胞、，用 实 时 荧 光 定 量 检 测 染氟 各 组 间 水 平，用 蛋 白 免 疫 印迹 法（）检 测 各 实 验 组、的 蛋 白 水 平。.细 胞 培 养 神 经 细 胞又 称 人 神 经 母 细 胞 瘤 细 胞，应 用 于 慢 性 氟 中 毒 神 经细 胞 模 型 的 研 究。将 冻 存 细 胞 株 复 苏，于 培 养 箱 中 培 养，后 换 培 养 基（含 胎 牛血 清、双 抗 的）继 续 培 养，观 察 细 胞 生长 状 态，待 细 胞 长 满 培 养 瓶 底 传 代 继 续 培 养。.法 筛 选 染 氟 中 毒 实 验 浓 度 收 集 对数 期 正 常 细 胞
11、，调 整 细 胞 悬 液 浓 度，每 孔加 入，铺 板 使 待 测 细 胞 密 度 达 个 孔 边 缘 孔 用 无 菌 磷 酸 缓 冲 液（）填充，孵 育，至 细 胞 单 层 铺 满 孔 底（孔 平 底 板），设 置 调 零 孔（包 括 培 养 液、）、对 照 孔（包 括 细 胞 培 养 液、），进 而加 入 氟 化 钠（，浓 度 梯 度 为.、.、.、.、.、.、.、.、.、.及.），设 个 复 孔；分 别 培 养、后，每 孔 加 入 溶 液，继 续 培 养，终 止 培 养，用 酶 标 仪 在 波 长 处 测 量 各孔 的 吸 光 度（）值，计 算 各 实 验 组 细 胞 存 活 率，参 照
12、 实 验 步 骤，正 常 细 胞 染 氟 后筛 选 合 适 的 浓 度。.细 胞 染 氟 时 表 达 采 用 实 时 荧 光 定 量 检 测 细 胞 中 信 号 通 路 中 表 达。用 一 步 法 提取 细 胞 总，将 逆 转 录 反 应 成，以逆 转 录 模 板 进 行 实 时 荧 光 定 量。的 上游 引 物 为，下 游 引物 为，扩 增 产 物长 度；内 参 照 的 上 游 引 物 为，下 游 引 物 为，扩 增 产 物 长 度 为。体 系 为 上 下 游 引 物 各.，.，.），循 环条 件 为 反 应 条 件 为，、，个 循 环。用 作 为 内 参，采 用 法 计 算 反 应 结 果
13、。.细 胞 中 磷 酸 化（）、总 蛋 白 水 平 检 测 采 用 法 检测，提 取 细 胞 总 蛋 白，将 细 胞 沉 淀 加 入 细 胞裂 解 液，漩 涡 震 荡 次，每 次，冰 上 静 置，反 复 次，离 心，取 上 清 液 进 行 蛋 白 定 量 检 测。经 聚 丙 烯 酰 胺凝 胶 电 泳 分 离 蛋 白，再 用 转 膜 装 置 将 胶 上 的 蛋 白 转到 聚 偏 二 氟 乙 烯 膜（）膜 上，先 分 别 用 蛋 白、总 蛋 白（）与 转 蛋 白 膜孵 育 过 夜，再 与 辣 根 过 氧 化 物 酶 联 结 的 抗 兔 室 温 孵 育。将 膜 与 发 光 试 剂 反 应，用 显 影
14、 胶 片 曝 光，冲 洗 胶 片 后 用 图 像分 析 仪 处 理，用 作 为 内 参，计 算 反 应 结 果。.统 计 学 分 析数 据 采 用.软 件 处 理，计 量 资 料 采 用均 数 标 准 差（）表 示，组 间 比 较 采 用 单 因 素 方差 分 析，两 两 比 较 采 用 检 验，以.为差 异 有 统 计 学 意 义。结 果.染 氟 浓 度 的 筛 选染 氟 时，.处 理 组 细 胞 存活 率 较 对 照 组（.）升 高，.期 邱 志 伟 等 氟 暴 露 下 细 胞 信 号 转 导 通 路 的 改 变.处 理 组 的 细 胞 存 活 率 较 对 照 组降 低，差 异 有 统 计
15、 学 意 义（.）；染 氟 时，.处 理 组 细 胞 存 活 率 较 对 照（.）组 升 高，.处 理 组 的 细 胞 存 活 率 较 对 照 组 降 低，差 异 有统 计 学 意 义（.）。综 合 选 择.实 验 组 作 为 低 剂 量 染 氟 组、染 氟.实 验 组 作 为 高 剂 量 染 氟 组，复 制 神 经 细 胞 慢 性 氟 中毒 模 型。见 表。表 氟 化 钠 对 细 胞 活 力 的 影 响（，）（，）组 别（）染 氟 细 胞 存 活 率 染 氟 细 胞 存 活 率.（）.（）.（）.（）.（）.（）.（）.（）.（）.（）.（）.（）.（）.（）.（）.（）.注：与 组 比 较
16、，（）.，（）.。.表 达 水 平 实 时 荧 光 定 量 采 用 法 计 算，染 氟.、.、.后，正 常 组、低氟 组、高 氟 组 表 达 水 平 任 意 组 间 比 较无 统 计 学 意 义（.，），其 中 和 基 因 的 溶 解 曲 线 和 扩 增 曲 线 良 好，见 表 和 图。表 细 胞 染 氟 时 表 达 水 平（）（）分 组 动 物 数 值 值 对 照 组.低 氟 组.（）高 氟 组.（）.注：（）与 对 照 组 比 较，.。图 细 胞 染 氟 时 的 扩 增 曲 线 图 细 胞 染 氟 时 的 溶 解 曲 线 图 细 胞 染 氟 时 基 因 的 扩 增 曲 线 贵 州 医 科
17、大 学 学 报 卷 图 细 胞 染 氟 时 的 溶 解 曲 线.蛋 白 表 达 检 测 结 果染 氟，高 氟 组 蛋 白 水 平 较 低 氟组、正 常 组 表 达 升 高（.，.），而 总 蛋 白 表 达 水 平 高 氟 组 升 高 较 低 氟 组、对 照 组有 意 义（.，.）。见 表 和 图。染氟 后，染 氟 组 表 达 逐 渐 升 高，各 组 间比 较 均 有 统 计 学 意 义（.，.），且 总 蛋 白 表 达 水 平 也 逐 渐 增 加，染 氟 组 较 正 常 组有 统 计 学 意 义（.，.）。见 表 和图。表 细 胞 中、蛋 白表 达 水 平（）（）分 组 细 胞 蛋 白 细 胞
18、 蛋 白比 值 对 照 组.低 氟 组.高 氟 组.（）（）.（）（）.对 照 组.低 氟 组.（）.（）.高 氟 组.（）（）.（）.注：（）与 对 照 组 比 较，.；（）与 低 氟 组 相 比 较，.。注：、分 别 表 示 对 照 组、低 氟 组、高 氟 组，为 相 对 分 子 质 量，为，为。图 细 胞 染 氟 时、激 酶 表 达 注：、分 别 表 示 对 照 组、低 氟 组、高 氟 组，为 相 对 分 子 质 量，为，为。图 细 胞 染 氟 时、激 酶 表 达 讨 论地 方 性 氟 中 毒（）是 由 于 一 定地 区 的 环 境 中 氟 元 素 过 多，而 致 生 活 在 该 环 境
19、 中 的居 民 经 饮 水、食 物 和 空 气 等 途 径 长 期 摄 入 过 量 氟 所引 起 的 以 氟 骨 症（）和 氟 斑 牙（）为 主 要 特 征 的 一 种 慢 性 全 身 性 疾 病，高 氟 对 人 体 神 经、肌 肉 骨 骼 等 系 统 造 成 慢 性 损 害，危 害 较 大。研 究 表 明，慢 性 氟 中 毒 动 物 的 神 经 细 胞 存 在 退行 性 改 变，而 长 期 摄 入 高 氟 可 造 成 过 量 氟 在 脑 内 储留，可 能 导 致 神 经 细 胞 发 育 分 化 异 常，影 响 脑 细 胞的 正 常 生 理 功 能，从 而 引 起 大 脑 皮 质 及 海 马
20、神 经 元病 理 改 变。人 体 的 大 脑 皮 质 枕 叶 区 和 额 叶 区、海 马 期 邱 志 伟 等 氟 暴 露 下 细 胞 信 号 转 导 通 路 的 改 变区 都 是 参 与 学 习 记 忆 和 智 力 功 能 的 重 要 结 构，海 马区 的 作 用 不 仅 仅 是 制 造 记 忆，而 是 记 忆“存 储器”，已 有 研 究 表 明 慢 性 氟 中 毒 大 鼠 学 习 记 忆 能力 降 低，其 与 神 经 细 胞 的 改 变 关 系 密 切。慢 性 氟 中 毒 时 术 检 测 表 明，大 脑 皮 层 及海 马 神 经 细 胞 凋 亡 率 升 高，明 显 影 响 细 胞 周 期 期
21、（合 成 期），进 入 期 的 神 经 元 数 量 显 著 减少，可 以 抑 制 凋 亡，这 也 是 在 正 常 情 况 下 的 主 要 生 理 功 能，实 验 也 证 明 介 导 了 的 抗 凋 亡 作 用，的 激 活 可 抑 制 脑 缺 血损 伤 时 的 神 经 细 胞 凋 亡、产 生 神 经 保 护 作 用。研 究表 明，阻 断 会 下 调 细 胞 周 期 蛋 白、细 胞 周期 蛋 白 和 等 的 表 达，导 致 细 胞 周 期 停 滞 于 期 和 生 长 抑 期，信 号 转 导 通 路 在 中 枢神 经 系 统 广 泛 表 达，各 种 细 胞 外 刺 激 信 号 可 通 过 这条 通
22、路 影 响 突 触 传 递、神 经 元 的 重 塑、形 态 分 化等，同 时 的 活 化 对 细 胞 增 殖、分 化 等 生理 过 程 是 必 需 的。有 研 究 发 现 可 以 被 激 活，调 控 介 导 的 促 凋 亡 蛋 白 的磷 酸 化，增 加 抗 凋 亡 蛋 白 的 表 达，可 以促 进 细 胞 生 存，抑 制 凋 亡，这 也 是 其 正 常 情 况下 的 主 要 功 能。本 研 究 通 过 复 制 神 经 细 胞 慢 性 氟 中 毒 模 型，随着 染 氟 剂 量 和 染 氟 时 间 的 延 长，的 基 因 水 平未 发 现 改 变，而 发 现 染 氟 组 中 磷 酸 化 的 表 达
23、水 平 逐 渐 增 高，而 激 酶 的 表 达 水 平 也 慢 慢 增加，且 的 激 活 较 明 显，表 明 激 酶对 慢 性 氟 中 毒 神 经 细 胞 损 伤 中 起 到 关 键 的 代 偿 性作 用，提 示 信 号 通 路 很 可 能 在 氟 中 毒 脑 损 伤过 程 中 起 到 一 定 的 抗 凋 亡 作 用。此 外，自 由 基 损 伤 是 氟 中 毒 神 经 性 脑 损 伤 中 的重 要 机 制，中 枢 神 经 系 统 神 经 元 的 氧 化 应 激 级 联 与大 量 的 自 由 基 释 放 有 关，而 是 氧 化 应 激激 酶，也 是 毒 性 物 质 通 过 通 路，作 为 中 间
24、 环节，与 信 息 传 递、细 胞 的 正 常 功 能 有 关。研 究 表 明，激 活 与 自 由 基 密 切 相 关，随 着 染 氟 时 间 延长，和 代 偿 性 增 高，参 与 和 调 节 神 经系 统 功 能，表 明 和 有 可 能 参与 了 氟 中 毒 引 起 的 神 经 损 伤，但 和 的 激 活 对 自 由 基 引 起 的 组 织 或 细 胞 损 伤 起 到 保 护作 用，起 到 正 向 性 调 节 代 偿 作 用，且 的 代偿 作 用 更 为 及 时 更 为 主 要，它 们 有 可 能 是 氟 中 毒 神经 细 胞 损 伤 过 程 中 的 重 要 参 与 因 素，这 些 改 变
25、可能 仅 仅 是 过 量 氟 导 致 细 胞 信 息 传 递 变 化 的 部 分环 节。近 几 年 关 于 氟 中 毒 学 习 记 忆 力 降 低 的 报 道 较多，是 多 种 属 动 物 多 种 学 习 记 忆 形 式 的 主 要分 子，而 信 号 通 路 在 氟 中 毒 神 经 细 胞中 被 激 活，虽 然 科 学 家 目 前 对 于 记 忆 的 运 作 机制 的 了 解 还 不 够，而 神 经 细 胞 突 触 的 形 成 也 与 记 忆相 关 联（这 一 机 制 对 于 理 解 我 们 自 身 是 非 常 重 要的），信 号 通 路 参 与 神 经 突 触 的 形 成，故 信 号 通 路
26、 很 可 能 与 维 持 细 胞 正 常 生 理 功 能及 学 习 记 忆 能 力 的 关 系 较 为 密 切。细 胞 在 地 方 性 氟 中 毒 模 型 的 应 用 中较 多，本 实 验 表 明 信 号 通 路 很 可 能 介导 了 慢 性 氟 中 毒 神 经 细 胞 损 伤 的 保 护 作 用，与 大 脑学 习 记 忆 能 力 可 能 有 重 要 的 相 关 关 系，信 号通 路 在 慢 性 氟 中 毒 脑 损 伤 被 激 活，其 很 可 能 是 慢 性氟 中 毒 性 神 经 性 脑 损 伤 机 制 中 的 重 要 参 与 因 素，其与 慢 性 氟 中 毒 神 经 兴 奋 性 毒 性 的
27、代 偿 性 保 护机 制 值 得 进 一 步 深 入 研 究。参 考 文 献 黄 蒙，郭 洁 洁 信 号 转 导 通 路 在 神 经 退 行 性 疾 病中 的 研 究 进 展 现 代 实 用 医 学，（）：郝 雪 洁，张 海 东，孔 令 敏，等 的 生 物 学 特 性 及 其相 关 疾 病 的 研 究 进 展 职 业 与 健 康，（）：，官 志 忠，刘 艳 洁，冉 龙 艳，等 信 号 转 导 通 路 改变 在 慢 性 氟 中 毒 脑 损 伤 机 制 中 的 作 用 中 国 地 方病 学 杂 志，：盛 晓 赞，夏 亚 一 家 族 信 号 通 路 的 研 究 进展 医 学 综 述，（）：，（），（
28、）：，（）：张 一 彤，张 忠 玲 氟 中 毒 性 神 经 损 伤 与 拮 抗 保 护 的 研 究进 展 中 华 地 方 病 学 杂 志，（）：孙 洪 娜，姜 宇 婷，赵 丽 军，等 我 国 地 方 病 学“十 四 五”学 科 发 展 战 略 中 华 地 方 病 学 志，（）：官 志 忠 燃 煤 污 染 型 地 方 性 氟 中 毒 北 京：人 民 卫生 出 版 社，贵 州 医 科 大 学 学 报 卷 邱 志 伟，刘 艳 洁，官 志 忠，等 细 胞 外 信 号 调 节 蛋 白 激酶 在 慢 性 氟 中 毒 大 鼠 脑 组 织 中 的 表 达 及 其 与 大 鼠记 忆 力 的 改 变 的 关 系
29、中 国 地 方 病 学 杂 志，（）：陈 军，陈 学 敏，杨 克 敌，等 氟 对 大 鼠 脑 细 胞 的 损伤 及 诱 导 凋 亡 的 作 用 中 华 预 防 医 学 杂 志，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（），（）：，：，（）：，（），（）：房 亚 兰，尹 洁，刘 克 建，等 脑 缺 血 再 灌 注 损 伤 中 自 由基 与 锌 离 子 的 相 互 作 用 首 都 医 科 大 学 学 报，（）：，（）：谭 诗 文，魏 玮，孙 殿 军 氟 中 毒 对 神 经 系 统 的 损 伤 及 与内 质 网 应 激 潜 在 因 素 的 联 系 中 华 地 方 病 学 杂 志，（）：魏 娜 氟 中 毒
30、 所 致 神 经 系 统 损 伤 机 制 研 究 中 华 地方 病 学 杂 志，（）：扈 丽，王 正 蓉，喻 茂 娟，等 燃 煤 型 氟 中 毒 对 仔 鼠 学 习记 忆 及 海 马 区 胶 质 纤 维 酸 性 蛋 白 表 达 的 影 响 环境 与 健 康 杂 志，（）：陈 丹，刘 仙 红，曾 晓 晓，等 慢 性 氟 中 毒 大 鼠 脑 组 织 沉默 信 息 调 节 因 子 的 表 达 及 其 与 学 习 记 忆 能 力 的 关 系 中 华 地 方 病 学 杂 志，（）：，（）：，（）：王 梅 子 创 伤 后 应 激 障 碍 样 大 鼠 记 忆 损 害 及 海 马 组 织 的 差 异 性 表 达 石 河 子：石 河 子 大 学，万 珑，杨 文 秀，魏 娜 实 验 性 氟 中 毒 对 细 胞 受 体、（）及 凋 亡 的 影 响 中 国 地 方 病防 治 杂 志，（）：，潘 际 刚，吴 昌 学，齐 晓 岚，等 外 源 性 硫 化 氢 对 氟 诱 导损 伤 细 胞 的 作 用 及 机 制 贵 州 医 科 大 学学 报，（）：，：，（）：（收 稿，修 回）中 文 编 辑 吴 昌 学 英 文 编 辑 赵 毅 期 邱 志 伟 等 氟 暴 露 下 细 胞 信 号 转 导 通 路 的 改 变
