1、指纹图谱、多成分定量与模式识别相结合的大黄质量评价 窦志华 卞理 许波 孟萍 施忠 南通大学附属南通第三医院 南通市妇幼保健院 摘 要： 目的:建立指纹图谱、多成分定量与模式识别相结合的大黄质量评价方法。方法:高效液相色谱法测定 9 批饮片、2 批药材共计 11 批大黄样品指纹图谱, 建立指纹图谱共有模式, 并对 11 批样品指纹图谱进行相似度评价, 通过对照品比对指认部分成分, 并测定样品中量, 分别对指纹图谱及含量测定数据进行聚类分析和主成分分析。结果:11 批样品指纹图谱标定了 35 个共有峰, 指认了其中 11 个成分分别为 2 个鞣质单体 (没食子酸和儿茶素) 、4 个结合型蒽醌 (
2、芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素-1-O-葡萄糖苷、大黄酚-1-O-葡萄糖苷和大黄素-8-O-葡萄糖苷) 和 5 个游离型蒽醌 (芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚) ;饮片中游离型蒽醌量占总蒽醌量的比例明显高于药材, 指纹图谱相似度和聚类分析均可区分大黄饮片和药材;35 个共有峰可分为两类, 其中 5 个游离型蒽醌及没食子酸等 8 个成分为一类, 4 个结合型蒽醌及儿茶素等 27 个成分为另一类;9 批饮片主成分综合得分与含量测定结果明显相关。结论:所建立的方法直观、简便、准确、可行, 可用于全面评价大黄质量。关键词： 大黄; 质量评价; 指纹图谱; 多成分定量; 模式识别;
3、 聚类分析; 主成分分析; 作者简介：窦志华 (1966-) , 男, 江苏南通人, 主任中药师, 硕士研究生导师, 博士, 研究方向:中药药效物质基础及质量评价。作者简介：卞理 (1988-) , 女, 江苏南通人, 药师, 硕士, 研究方向:中药质量评价。收稿日期：2017-06-02基金：江苏省第四期“333 工程”科研项目 (BRA2013090) Quality Evaluation of Rhei Radix et Rhizoma Based on Combinative Method of Fingerprint, Assay of Multi-component and Pat
4、tern RecognitionDOU Zhihua BIAN Li XU Bo MENG Ping SHI Zhong Nantong Third Affiliated Hospital of Nantong University; Nantong Maternity and Child Health Hospital; Abstract： Objective: To establish a combinative method based on fingerprint, assay of multi-component and pattern recognition for quality
5、 evaluation of rhei radix et rhizoma ( RRR) . Methods: Nine batches decoction pieces and 2 batches materia medica of RRR were determined by HPLC and a common mode of fingerprint was established. The similarities between fingerprints of 11 batches samples and common mode were evaluated. Some componen
6、ts were identified by comparison with reference substances and their content in samples were determined. Data of fingerprints and assay were analyzed by hierarchical cluster analysis. Results: There were 35 common peaks in fingerprints of 11 batches RRR, 11 of them were identified as tannins ( galli
7、c acid and catechin) , 4 bound anthraquinones ( aloe-emodin-8-O-glucopyranoside, emodin-1-glucoside, chrysophanol-1-glucoside, and emodin-8-glucoside) and 5 free anthraquinones ( aloe-emodin, rhein, emodin, chrysophanol, and physcion) . The content of free anthraquinones in decoction pieces was sign
8、ificantly higher than that in materia medica. The similarity of fingerprints and hierarchical cluster analysis could be used to distinguish decoction pieces and materia medica. Thirty-five common peaks were classified into 2 categories. Eight components including 5 free anthraquinones and gallic aci
9、d were in one category. Twenty-seven components including 4 bound anthraquinones and catechin were in other category. The comprehensive principal component scores of 9 batches decoction pieces were significantly related with results of content determination. Conclusion: The developed method is simpl
10、e, accurate, feasible and can be used for overall quality evaluation of RRR.Keyword： Rhei radix et rhizoma (RRR) ; quality evaluation; fingerprint; assay of multi-component; pattern recognition; hierarchical cluster analysis; principal component analysis; Received： 2017-06-02中药质量评价是中药现代化的亟待解决的问题之一1。
11、指纹图谱能体现中药成分的整体性, 是目前符合中药特点的质量评价模式之一2。但指纹图谱各共有峰代表什么、含量多少, 难以说清。在指纹图谱基础上进行多成分定量分析可在一定程度上弥补此不足3。然而, 如何对现代分析手段引入中药复杂体系后产生的大量测量数据进行有效提取、分析, 去解决诸如质量控制等问题, 成为了一个新课题4。包括聚类分析、主成分分析等在内的模式识别是一种借助于计算机来揭示隐含于事物内部规律的综合技术5, 可以从复杂的化学测量数据出发, 进一步揭示复杂化合物之间的隐藏规律, 为中药整体研究提供十分有用的信息4。模式识别运用到中药化学测量数据的分析处理工作中, 使海量的信息充分整合、正确表
12、达, 能真实、形象地反映中药质量差异6。大黄为蓼科植物唐古特大黄 Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.、掌叶大黄Rheum palmatum L.或药用大黄 Rheum officinale Baill.的干燥根及根茎, 是一种传统常用中药, 其质量优劣关系到用药的安全性和有效性, 但当前市场上流通的大黄药材和饮片质量参差不齐7, 且质量控制方法存在一定局限性8。大黄中含有多种成分, 其中以蒽醌类、鞣质等研究最多9, 蒽醌类分包括芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚及其苷10, 大黄鞣质分水解型和缩合型两类, 单体分别为没食子酸、儿茶素11。本课题组先期建立
13、了指纹图谱与多成分定量相结合的大黄质量评价方法9, 也见有指纹图谱与模式识别相结合7,12-13、多成分定量与模式识别相结合14-15对大黄进行质量评价的文献, 但未见指纹图谱、多成分定量与模式识别相结合的研究报道。本研究在先期测定了大黄中 11 种成分含量16, 并建立了其 HPLC 指纹图谱9的基础上, 建立了指纹图谱、多成分定量与聚类分析、主成分分析等模式识别相结合的大黄质量评价方法, 为全面、客观、准确评价大黄质量提供了依据。1 仪器与试药Waters Alliance 高效液相色谱系统, 配备 e2695 分离单元、2998 二极管阵列检测器、Empower 色谱工作站 (美国 Wa
14、ters 公司) ;Sartorius BT 25S 型电子天平 (德国赛多利斯公司) 。对照品芦荟大黄素 (批号 110795-201007) 、大黄酸 (批号 110757-200206) 、大黄素 (批号 110756-200110) 、大黄酚 (批号 110796-201118) 、大黄素甲醚 (批号 110758-201013) 、没食子酸 (批号 110831-201204) 、儿茶素 (批号110877-201203) 购自中国食品药品检定研究院, 对照品芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷 (批号 2012072301) 、大黄素-1-O-葡萄糖苷 (批号 2012072301) 、大
15、黄酚-1-O-葡萄糖苷 (批号 2012072301) 、大黄素-8-O-葡萄糖苷 (批号2012072301) 购自鼎瑞化工 (上海) 有限公司。大黄饮片 (S1S9) 购自江苏省内 9 家医院中药房, 大黄药材 (S10, 批号130822) 购自南通三越中药饮片公司, 标准大黄药材 (S11, 批号 121249-201003) 购自中国食品药品检定研究院。经南通市食品药品监督检验中心龚旭东主任中药师鉴定, 以上样品均为蓼科植物掌叶大黄 Rheum palmatum L.的干燥根及根茎。甲醇为色谱纯 (国药集团化学试剂有限公司) , 纯净水 (杭州娃哈哈集团有限公司) 。2 方法与结果2
16、.1 溶液的制备162.1.1 供试品溶液的制备取样品粉末 (过 3 号筛) 约 0.5g, 精密称定, 置 25 m L 量瓶中, 加入甲醇 24 m L, 超声提取 30 min, 放冷, 加甲醇至刻度, 摇匀, 滤过, 取续滤液过0.45m 滤膜, 即得。2.1.2 对照品溶液的制备精密称取对照品适量, 配成没食子酸、儿茶素、芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素-1-O-葡萄糖苷、大黄酚-1-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚质量浓度分别 0.062 4、0.18、0.041 2、0.030 6、0.051、0.028 8、0.019
17、8、0.050 5、0.063 7、0.098 和 0.163 mg/m L 的混合对照品溶液。2.2 指纹图谱的建立及分析9分别精密吸取 S1S11 供试品溶液 10L 进样, 按文献9色谱条件测定, 将 11批样品的指纹图谱导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件” (2004 版 A) , 生成指纹图谱共有模式, 标定共有峰 35 个。精密吸取混合对照品溶液 10L 进样测定, 通过对照品保留时间比对, 指认了大黄对照指纹图谱 35 个共有峰中的 11 个, 分别为 1 号峰 (没食子酸) 、2 号峰 (儿茶素) 、11 号峰 (芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷) 、18
18、 号峰 (大黄素-1-O-葡萄糖苷) 、23 号峰 (大黄酚-1-O-葡萄糖苷) 、24 号峰 (大黄素-8-O-葡萄糖苷) 、30 号峰 (芦荟大黄素) 、32 号峰 (大黄酸) 、33 号峰 (大黄素) 、34 号峰 (大黄酚) 、35 号峰 (大黄素甲醚) 。见图 1。以共有模式作为对照指纹图谱, 采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件” (2004 版 A) 对 11 批样品指纹图谱进行相似度评价, 结果 S1S9 (大黄饮片) 相似度良好, 分别为0.977、0.994、0.978、0.955、0.974、0.990、0.969、0.973 和 0.965, S10和 S11 (大
19、黄药材) 相似度明显偏低, 分别为 0.620 和 0.303。2.3 大黄中 11 种成分量的测定16分别精密吸取混合对照品溶液 1、5、10、15、20、25L, 按文献9色谱条件测定, 以没食子酸等 11 个成分峰面积 (Y) 对进样量 (X) 进行回归处理, 建立回归方程。分别精密吸取 S1S11 号供试品溶液 10L 进样测定, 将 11 个成分的峰面积代入回归方程计算其在样品中的含量。结果见表 1。2.4 聚类分析将指纹图谱共有峰峰面积相对于称样量量化17, 分别以量化后的共有峰面积和没食子酸等 11 个成分含量18为变量, 运用 SPSS 19.0 软件, 组间平均数联结法 (b
20、etweengroup linkage) , 以夹角余弦 (cosine) 作为样品相似度的距离公式, 对 11 批样品进行系统聚类分析 (hierarchical cluster analysis) , 结果均显示 11 批样品大致可分为两大类, S1S9 (大黄饮片) 为第一大类, S10和 S11 (大黄药材) 为第二大类。聚类分析得到的样品之间的相关性与指纹图谱相似度计算得到的样品之间的相关性一致。见图 2。由表 1 可知, S1S9 中 5 种游离型蒽醌含量占总蒽醌含量的比例均大于 70%, S10 和 S11 分别为 33.37%和 17.70%, 前者明显高于后者, 可能是引起指
21、纹图谱相似度差异和聚类分析结果的主要原因。图 1 大黄样品共有模式 (A) 和混合对照品 (B) 指纹图谱 下载原图1-没食子酸;2-儿茶素;11-芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷;18-大黄素-1-O-葡萄糖苷;23-大黄酚-1-O-葡萄糖苷;24-大黄素-8-O-葡萄糖苷;30-芦荟大黄素;32-.大黄酸;33-大黄素;34-大黄酚;35-大黄素甲醚表 1 11 批大黄样品中 11 种成分含量测定结果 (mg/g) 下载原表 图 2 11 批样品按指纹图谱共有峰 (A) 及 11 种成分含量 (B) 聚类分析结果 下载原图2.5 主成分分析2.5.1 所有样品主成分分析分别以量化后的指纹图谱共
22、有峰面积和没食子酸等 11 个成分含量为变量, 运用SPSS 19.0 软件对 11 批样品进行主成分分析, 以主成分的特征值及方差贡献率作为选择主成分的依据。以共有峰面积为变量, 特征值大于 1 的主成分有 4 个, 其中第一主成分特征值为 22.387, 方差贡献率为 63.964%;第二主成分特征值为 6.143, 方差贡献率为17.551%;第三主成分特征值为 3.481, 方差贡献率为 9.947%;第四主成分特征值为 1.300, 方差贡献率为 3.713%。前 3 个主成分的累计贡献率达到 91.462%, 为了以尽可能少的指标反映尽量多的信息15, 分别以第一、第二、第三主成分
23、建立坐标系, 进行投影即可得到所有样本的 PCA 三维投影图。见图 3。图中每个点对应 1 个共有峰, 35 个共有峰可分为两类, 其中 1 号峰 (没食子酸) 、30 号峰 (芦荟大黄素) 、32 号峰 (大黄酸) 、33 号峰 (大黄素) 、34 号峰 (大黄酚) 、35 号峰 (大黄素甲醚) 等 8 个为一类, 2 号峰 (儿茶素) 、11 号峰 (芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷) 、18 号峰 (大黄素-1-O-葡萄糖苷) 、23 号峰 (大黄酚-1-O-葡萄糖苷) 、24 号峰 (大黄素-8-O-葡萄糖苷) 等其余 27 个为另一类, 即 5 个游离型蒽醌及没食子酸等 8 个成分为一类
24、, 4 个结合型蒽醌及儿茶素等其余 27 个成分为另一类。图 3 11 批样品共有峰主成分分析得分图 下载原图以没食子酸等 11 种成分含量为变量, 特征值大于 1 的主成分有 2 个, 其中第一主成分特征值为 8.270, 方差贡献率为 75.184%;第二主成分特征值为 1.544, 方差贡献率为 14.033%。两个主成分的累计贡献率为 89.217%, 分别以第一、第二主成分来建立坐标系, 进行投影即可得到所有样本的 PCA 投影图。见图 4。图中每个点对应 1 个成分, 11 个成分可分为两类, 芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚 5 个游离型蒽醌及没食子酸为一类, 芦荟
25、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素-1-O-葡萄糖苷、大黄酚-1-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷 4 个结合型蒽醌及儿茶素为另一类, 该结果与以共有峰为变量的分析结果一致, 提示所测定的 11 种成分可作为代表性成分对大黄进行质量控制。2.5.2 大黄饮片主成分分析以没食子酸等 11 个成分含量为变量, 进一步对大黄饮片 (S1S9) 进行主成分分析, 特征值大于 1 的主成分有 3 个, 其中第一主成分特征值为 5.793, 方差贡献率为 52.661%;第二主成分特征值为 3.882, 方差贡献率为 35.293%;第三主成分特征值为 1.010, 方差贡献率为 9.184%。前两个
26、主成分的累计贡献率为87.954%, 提取第一主成分和第二主成分进行分析, 主成分分析公共因子载荷矩阵见表 2。图 4 11 批样品中 11 种成分含量主成分分析得分图 下载原图因子负荷能反映各指标对主成分贡献的大小19。表 3 显示, 第一主成分中 5个游离型蒽醌及没食子酸因子负荷较大, 表明对第一主成分中贡献大;第二主成分中 4 个结合型蒽醌及儿茶素因子负荷较大, 表明对第二主成分中贡献大。表 2 S1S9 因子负荷矩阵结果 下载原表 综合得分可判别样品质量优劣15,20。计算各样品主成分一和主成分二得分21, 并计算综合得分 F (F=0.526 6F1+0.352 9F2, F1、F
27、2分别为主成分一、主成分二得分, 0.526 6、0.352 9 分别为主成分一、主成分二方差贡献率20) , 结果见表 3。将 S1S9 中没食子酸等 11 个成分总量乘以 0.1, 从成分含量角度对样品进行打分, 发现各样品含量得分与主成分综合得分明显相关, 见图 5, 两者的相关系数为 0.989 7, 再次提示所测定的 11 种成分可作为代表性成分对大黄进行质量控制, 含量越高质量越好。3 讨论(1) 本研究表明, 大黄药材与饮片质量存在明显差异, 主要表现为药材中游离型蒽醌占总蒽醌的比例明显低于饮片, 与文献报道一致7, 其原因可能是饮片生产特别是浸润过程中导致部分结合型蒽醌水解为游
28、离型22。有研究表明, 与生大黄相比, 熟大黄游离型蒽醌明显提高23;本课题组前期研究也发现, 分别以大黄药材和饮片组成的茵陈蒿汤中, 前者游离型蒽醌的含量明显低于后者24。游离型蒽醌极性较小, 难溶于水, 而中药基本采用水煎煮的汤剂形式, 在总蒽醌含量相近的情况下, 游离型蒽醌占比高会导致该类成分溶出相对偏少而影响疗效。可能也是基于以上原因, 2015 版中华人民共和国药典对大黄的质量控制在测定总蒽醌含量的同时增加了游离型蒽醌的含量测定25。表 3 S1S9 主成分综合得分及排名 下载原表 图 5 S1S9 主成分综合得分及 11 种成分含量测定结果比较 下载原图(2) 市售药材 (S10)
29、 、标准药材 (S11) 与共有模式对照指纹图谱的相似度分别为 0.620 和 0.303, 也存在一定差异, 可能是由于采收后产地加工方法不同引起7。(3) 由于大黄药材与饮片质量差异较大, 且临床用药形式为饮片, 故单独对 9批大黄饮片 (S1S9) 进行了主成分综合得分计算并与没食子酸等 11 种成分含量测定之和进行了比较, 发现两者存在明显相关性。在测定的 9 批饮片中 S1 质量最好, 总蒽醌 (5 种游离型蒽醌加 4 种结合型蒽醌) 含量为 31.557 mg/g, 没食子酸与儿茶素含量之和为 15.654 mg/g;S6 质量其次, 总蒽醌及没食子酸与儿茶素含量之和分别为 29.
30、669 和为 15.076 mg/g;S7 质量最差, 其总蒽醌及没食子酸与儿茶素含量之和均最低, 总蒽醌含量为 11.856 mg/g, 2015 版中华人民共和国药典规定, 大黄药材和饮片中总蒽醌含量均应分别不低于 1.5% (15 mgg) , 游离蒽醌应分别不低于 0.2%和 0.35%24, 按此标准, 该样品应判为不合格。参考文献1陈东东, 周萍, 白钢钢, 等.基于 HPLC 中药指纹图谱技术延胡索药材及其制剂的质量控制探讨J.中国中药杂志, 2015, 40 (12) :2470-2473. 2姜华, 高原, 杨景明, 等.源于“整体观”思想的中药质量评价方法研究概述J.中国中
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