1、研 究 论文 2023 年第 42 卷第 1 期 食品与生物技术学报邢 宇，等：变色栓 菌 来源 漆 酶的酶 学 性 质 及对 染 料 脱 色 性 能 的 研究 Study on Enzymatic Properties of Laccase Derived from Trametes versicolor and Its Decolorization of Dyes XING Yu，WANG Tianyu，CHEN Xiaoyi，LI Miao，WANG Shujing，LI Qian*，LI Xianzhen(School of Biological Engineering,Dalian
2、Polytechnic University,Dalian 116034，China)Abstract：Laccase is a copper-containing polyphenol oxidase,which can catalyze the oxidation ofvarious phenolic compounds and aromatic amines.It has wide application prospects in food,paper,energy,macromolecular compound synthesis and other fields.In recent
3、years,more and moreattention has been focused on the development and utilization of laccase.In this study,during thefermentation via Trametes versicolor in flasks,the morphology of mycelium was induced andregulated by adding farnesol,and the yield of laccase was increased.Besides,the activity of lac
4、casefermented fromTrametes versicolor and the mass concentration of protein reached(161.37 1.58)U/L and(29.19 1.30)mg/L,respectively,which was more than ten times higher than those of thecontrol group.In addition,the optimum reaction temperature was 40,the optimum pH was 4.0,and the laccase had good
5、 thermal stabilityin the range of2555.Furthermore,based on the studyof enzymatic reaction kinetics,it was found that laccase had a certain decolorization effect on evansblue,congo red,and eriochrome black T dyes,and the decolorization effect of evans blue was thestrongest,exhibitinggoodapplicationpo
6、tential.Keywords:laccase,Trametes versicolor,enzymaticproperties,dyedecolorization摘 要：漆 酶是一 种 含 铜 的多 酚氧 化酶，能催 化多 种 酚 类化 合 物 和 芳 香族胺氧 化，在 食品、造纸、能源、高 分子化 合 物 合 成 等 领域 有 着 广 阔 的 应用前 景。近年 对 于 漆 酶的 开发 利 用 逐渐受到 重 视，作 者 在 变色栓 菌 摇瓶 发 酵 过程 中，通 过 加 入 法 尼 醇 诱导调 控 菌 丝形 态以 提 高 漆 酶 产 量，结 果表 明，变色栓 菌 发 酵获得 的 漆 酶酶 活
7、 力 和 蛋白 质质 量 浓 度 分 别 达到（161.37 1.58）U/L 和（29.19 1.30）mg/L，均 比 对照 组 提 高 了 10倍 以 上，其 最 适 反应温度为 40，最 适 pH 为 4.0，且在 25 55 有 较 好 的 热 稳 定 性。进一 步 在酶 促 反应 动 力 学研究 基础 上，发 现 漆 酶对 伊 文 思 蓝、铬 黑 T、刚 果 红 3种染 料均 有 一定的 脱 色 效 果，其 中 对 伊 文 思 蓝 的 脱 色 能 力 最 强，具 有 较 好 的 应用 潜 力。关键词：漆 酶；变色栓 菌；酶 学 性 质；染 料 脱 色 性 能 中 图分类 号：Q 8
8、14.2 文 章 编号：1673-1689（2023）01-0075-08 DOI：10.3969/j.issn.1673-1689.2023.01.006变色栓菌来源漆酶的酶学性质及对染料脱色性能的研究邢 宇，王添誉，陈晓艺，李 苗，王 淑婧，李 佥*，李 宪臻（大 连 工 业 大 学生 物 工 程 学 院，辽 宁 大 连 116034）收 稿 日期：2022-04-08基金项目：国家 自 然 科 学基 金 青 年 基 金 项目（31601411,22108024）；辽 宁 省 教 育 厅 科 学研究 项目（J2020043）。*通 信 作者：李 佥（1982），女，博士，副 教授，硕 士
9、研究生 导师，主要从 事 食品酶的 发 酵、制备 和 酶学性质研究。E-mail：研究 论文 75R ESEARCH ARTICLEXING Yu，et al：Study on Enzymatic Properties of Laccase Derived from Trametes versicolor and Its Decolorization of DyesJOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 Issue 1 2023漆酶 是 降解多 酚 类 物 质的 关键 酶 之 一，其能 够 催 化 多 种 酚 类、芳 香 族 有 机 物
10、 形 成 自 由 基，形 成 的 自 由 基能 够 发 生聚合 或 解聚 等 非 酶 促 次 级 反 应，并 且 以 氧 原 子 为 最终受 体，产 物 为 水，无 其 他 有害 产 物。自 1883年 日 本 学 者 首 次 从 日 本 紫 胶漆 树 中 发 现漆酶 以 来 1，漆酶在食品、造 纸、纺 织、环 保 等 领域 逐渐 引 起 了 越 来 越 多的 关 注 2-3。目 前，已 发 现的漆 酶 种 类 众 多，按 照 来源 可以 分 为 植 物 漆酶、真菌漆 酶 和 细 菌漆酶 4。其中，对真菌来源漆酶的研究 数 量 最 多，真菌漆酶 主要 由 担 子菌 和 子 囊 菌产生，常 用
11、的菌 株 是 白 腐 菌 和 变色栓菌。变色栓菌 是 典 型的 担 子菌 门 真菌，分 布 在 全国 21个 省 份，分 泌 漆酶的能 力 较强，且 生 长 速 度 快，易 于 培 养，并 且 在降解木质素 和 染料脱色 方 面 表 现 出 优 异的性能，有 着 极大 的 工 业应用价 值 5。李 灵灵 等 筛选 分 离 了 一 种 高 效 降解木质素的菌 株 BYL-7，并 发 现 了 在 初 始 pH 6.7、温 度 25、接 种 量 8%（体 积 分 数）的 条 件 下 可明 显 提 高其木质素降解 率 6。Asgher 等 发 现 一 种 当 地白 腐 真菌 IBL-04，通 过 优
12、化 温 度 和 pH 等工 艺 参数，这 种 真菌 处 理 纺 织 工 业 废 水的脱色 率 在 3 d 内 显 著 提 高 到 了 84%7。法 尼 醇 是 一 种 低 水 溶 性的 非 环 状 半 萜 醇，被 广泛 用 作化 妆 品 和 抗 癌 药 物 的 原 料，是 目 前 发 现的真菌中研究 最 多 的 群 体 感 应 因 子 8-11。胡 建 华 在 5 L发 酵 罐 中 加 入 法 尼 醇 改 变 了 变色栓菌的菌 丝 形 态，提 高 了 漆酶的产 量，在 法 尼 醇 添加 浓 度 为 60 mol/L 时，漆酶产 量比 对 照 组 提 高 了 93%12。在 以 往 的研究中，尚
13、 未 有 关 于 以 法 尼 醇 作 为 信号 分子 诱 导 的变色栓菌 发 酵 体 系 所 产生的漆酶的酶学性质研究，并 且 对 该 体 系 中产 生的漆酶在染料脱色 方 面 的 探 索 较少。作 者 以 土 豆 培 养 基 为 基质，利 用变色栓菌进行漆酶的 发 酵 生产，发 酵 过 程 中 采 用 法 尼 醇 作 为 诱 导 剂 13，测 定 了 漆酶酶 活 力 和 蛋白 质质 量 浓 度，进 一 步 研究 了 漆酶的酶学性质 和 酶 促 反 应 动 力 学。研究其 对 伊 文 思 蓝、铬 黑 T、刚 果 红 3种 染料的脱色 效 果，为 揭 示 漆酶的 催 化 机 制 提 供 了 基
14、础 数 据，同时 也 为 进 一 步 深 入 探 索 漆酶的 催 化 机 制 和 对漆酶分子在 蛋白 质水 平 上 进行 改 造以 获 得 具有 工 业应用价 值 的漆酶 提 供 了 数 据 支 持。1.1 实验菌 株 变色栓菌（Trametes versicolor，编 号 CICC14001）：中 国 工 业 微 生 物 菌 种 保 藏 管 理 中 心 提 供。1.2 实验 试 剂 邻 苯 二 酚：上 海 阿拉 丁 试 剂 有 限 公 司 产品;酒 石 酸、酒 石 酸 钠：国 药 集 团 化 学 试 剂 有 限 公 司 产品;法 尼 醇：合 肥 博美 生 物科技 有 限 责 任 公 司 产
15、品;磷 酸 二 氢 钾、CaCl2 2H2O、MgSO4 7H2O、NH4H2PO4、FeSO4 7H2O、葡萄糖、CuSO4 5H2O：天 津市 科 密 欧化 学 试 剂 有 限 公 司 产品;CaCl2 2H2O、MgSO4 7H2O、NH4Cl：天 津市 大 茂 化 学 试 剂 厂 产品;考 马 斯 亮 蓝 G250：鼠 来 宝（武汉）生 物科技 有 限 公 司 产品;刚 果 红、铬 黑 T、伊 文 思 蓝：上 海源 叶 生 物科技 有 限 公 司 产品;以 上 试 剂 均为 分 析纯（AR）。1.3 主 要 设 备 电 子 天平：上 海 舜宇 恒 平 科 学 仪 器 有 限 公 司 产
16、 品；立 式 高 压 蒸汽 灭 菌 锅：浙 江 力 辰 仪 器 科技 有 限 公 司 产品；SpectraMax Plus384 酶 标 仪：上 海 仪 电 科 学 仪 器 股 份 有 限 公 司 产品；紫 外-可 见 分 光光 度 计：铂 金 埃 尔 默 仪 器 有 限 公 司 产品；微 生 物 培 养 箱：杭 州坤 天 科技 有 限 公 司 产品；BILON 超 声 波 清 洗 机：上 海 比 朗 仪 器 制 造有 限 公 司 产品；PHSJ-3F型 pH计：上 海 雷 磁 仪 器 有 限 公 司 产品；TDZ5-WS台 式 低 速 离 心 机：上 海 三 崴 医 疗 设 备 有 限 公
17、司 产品；热 风 循 环 烘 箱：吴 江 华 飞 电 热 设 备 有 限 公 司 产品；XY-SYG-11恒 温 水 浴 锅：上 海 昕 仪 恒 温 水 浴 锅 公 司 产 品；全 温 型多 振 幅 高 速 轨 道 摇 床：上 海 智城 分 析 仪 器厂 产品。1.4 菌 种培养 方 法 1.4.1 斜 面 活 化 配 制 土 豆 培 养 基，称 取 去 皮 土 豆 200 g，加 入 适 量去 离 子水，煮沸 30 min，纱 布过 滤 后 定 容 至 1 L，然 后 加 入 葡萄糖 20 g、琼 脂 粉 15 g，加 热 融 化 后 分 装 至 试 管 中，经 121、20 min 高 温
18、 灭 菌 后 制 成 斜 面，将 菌 接 种 在 斜 面 上 26 培 养 7 d。1.4.2 种 子 扩 培 配 制 土 豆 培 养 基，称 取 去 皮 土 豆 200 g，加 入 适 量去 离 子水，煮沸 30 min，纱 布过 滤 后 定 容 至 1 L，再 加 入 葡萄糖 20 g，搅拌 至 溶 解，分 装 至 250 mL 三 角 瓶 中（100 mL/瓶）。将 斜 面 菌 丝 体 接 种 到 种 子 培 养 基中，26、150 r/min 培 养 7 d，即形 成一 级 种 子 培 养 液；再 将 一 级 种 子 培 养 液 接 种 到 新 鲜 的 种 子 培 养 基中，接 种 量 为 10%（体 积 分 数），26 培 养 5 d，即形 成 二 级 种 子 培 养 液。1.4.3 摇瓶 发 酵 发 酵 培 养 设 置 两 组，分 别 为 常 规 发 酵 体 系（即 不 添加法 尼 醇 的对 照 组）与 以 法 尼 醇 材 料 与 方 法 176
