1、意义(P005)，则排除支气管哮喘。见表l。 表1 BPT阳性、阴性者激发前后肺功能检测结果比较( ) 3讨论 本研究中，256例慢性咳嗽或(和)无明显原因 胸闷患者经常规肺功能检查、支气管舒张试验均正 常，难以确定支气管哮喘的诊断。但经过乙酰甲胆 碱BPT后，127例激发试验阳性，阳性患者激发试验 前后肺功能检测指标差异有统计学意义，故确定支 气管哮喘的诊断。对于检测结果为阴性排除支气管 哮喘的患者，分析其病因为嗜酸粒细胞性支气管炎、 胃一食管反流性咳嗽、慢性支气管炎、肿瘤早期、 ACEI类药物致药物性咳嗽、支气管扩张、支气管内 膜结核、心理性咳嗽、女性更年期等，与慢性支气管 炎等有时难以鉴
2、别、易误诊，是引起慢性咳嗽的主要 病因【2】。慢性支气管炎等亦为气道慢性非特异性 炎症，与哮喘气道以嗜酸细胞为主的支气管非特异 性炎症不同，慢性支气管炎是以中性粒细胞为主的 支气管慢性炎症，故气道反应性增高不明显，往往 BPT多为阴性 】。张铁栓等H 对慢性阻塞性肺疾 病进行气道反应性测定，结果显示155例患者BPT 仅22例阳性，阳性率143。该研究表明，乙酰甲 山东医药2010年第50卷第45期 胆碱BPT对于慢性咳嗽、不明原因反复发作的胸闷 患者具有积极的诊断作用。 乙酰甲胆碱BPT具有一定危险性。试验时吸 人激发物浓度应从小剂量开始，逐渐增加剂量，应备 有急救器械和药品，如氧气、雾化吸
3、入装置与输液设 备、吸人型B：受体兴奋剂、注射用肾上腺素等，以备 急用。基础阻抗高的患者不能对其进行该检查；对 于咳嗽较剧的患者，应减轻咳嗽症状之后再行此检 查；极少数患者直至吸人最高浓度时，呼吸阻力虽然 升高但未增加至起始阻力的2倍，再次检测肺功能， 而FEV 、PEF较基础值已下降20，对于这部分 患者是否再增加乙酰甲胆碱的浓度要认真分析；另 有部分患者在吸人最高浓度之前，呼吸阻力已经增 加至起始阻力的2倍，再次检测肺功能，而FEV 、 PEF较基础值下降20。故虽然乙酰甲胆碱 BPT不失为诊断不典型哮喘的有效手段，但是部分 患者还应该结合临床症状及对平喘类药物的治疗效 果来综合分析。 参
4、考文献： 1American Thoracic SocietyStandardization of Spirometry，1994 Up dateJAm J Respir Crit Care Med，1995，152(3)：11071136 2马洪明，朱礼显，赖克方，等不明原因慢性咳嗽的诊断的探讨 J中华结核和呼吸杂志，2003，26(7)：675-678 3金远林，汪莉，肖永久，等气道反应性测定在慢性咳嗽诊断中的 意义J西北国防医学杂志，2006，27(2)：110-111 4张铁栓，邵润霞，徐照珉，等慢性阻塞性肺疾病气道反应性测定 的意义J临床医学，2001，21(8)：2-3 (收稿日期
5、：2010-0812) 人硫氧还蛋白基因分子克隆及真核 表达载体的构建 苏伟 。高枫 ，龚少愚 ，魏慧渊 ，孙茂民 ，江家贵 (1南京中医药大学无锡附属医院，江苏无锡214001；2苏州大学 公共卫生与放射学院) 摘要：目的克隆人硫氧还蛋白(hTRX)eDNA序列并进行真核表达载体的构建。方法 应用RTPCR技术， 以胎肝组织细胞总RNA为模板，扩增出hTRX成熟蛋白的eDNA基因，并克隆至pUCm-T载体中；经PCR和测序鉴 定正确后，再构建重组真核表达载体pcDNA30-hTRX，采用PCR、双酶切和基因测序鉴定。结果将所得序列与 GenBank(J04026)提供的序列比较，其酶活性中心
6、(T叩一CysGlyProCys)和基序与已知序列一致；PCR、酶切及测序 鉴定表明真核表达载体构建正确。结论成功克隆编码hTRX成熟蛋白的eDNA基因，并构建其真核表达载体 pcDNA30-hTRX。 关键词：人硫氧还蛋白；基因克隆；真核表达载体 中图分类号：R34 文献标志码：B 文章编号：1002-266X(2010)45-0046-03 山东医药2010年第5O卷第45期 硫氧还蛋白(TRX)是分布广泛的小分子多功 能蛋白，可在细胞内行使各种不同的功能“ 。为 了探讨人硫氧还蛋白(hTRX)基因的生物学活性及 其在内皮细胞氧化应激过程中的作用，2002年7月 一2004年3月，我们拟克
7、隆并构建hTRX的真核表 达载体，以便为hTRX后续研究工作的开展提供基 础。 1材料与方法 11 材料RNA抽提试剂盒、TaqDNA聚合酶、限 制性核酸内切酶EcoR I、BamH I、dNTPs、MgC12均 购自大连宝生物工程公司。逆转录试剂、pcDNA30 质粒购自上海申能博彩生物科技制品有限公司。 DH5a菌株由本室保存；pUCmT Vecr载体试剂盒 购自Promega公司。正常人胎肝取自水囊引产之胎 儿(4月龄)。引物参考GenBank的hTRX基因序列 (J04026)设计由上海生物工程公司合成。 12方法 121 liTPCR扩增hTRX cDNA取胎儿肝组 织约150 mg
8、，参照RNA抽提试剂盒手册进行总 RNA的提取。取3 l总RNA，将15 mmolL Oli go(dT)18加入2 l，65作用5 min；然后加人5 X RT缓冲液4 l，10 mmolL dNTPs 2 l和05 l RNA酶抑制剂，1 l MMLV逆转录酶，最后加双蒸 水至总体积为2O l，置37水浴1 h，90 oC处理1O min后，获得cDNA模板。取cDNA模板2 l，P1 1 l，P2 1 l，10 mmolL dNTP 2 l，10Reaction Buffer l，MgC12 3 l，TaqDNA聚合酶1 l，dd H2O 35 ，扩增体积为50 l，置PCR仪中扩增。首
9、先 94 oC 3 min预变性，然后进行下列循环：9445 S， 5845 S，721 min，共32个循环，最后72延 伸10 min。PCR产物用12琼脂糖凝胶电泳检 测。 122重组pUCmThTRX质粒的构建与鉴定 将hTRX eDNA与pUCmT载体进行体外连接(参照 Promega公司T载体系统说明书进行)，然后转化 DH5a感受态细菌，用抗性筛选法挑选阳性菌落并 进行测序，取测序正确的重组质粒进行扩增。制备 DH5a大肠杆菌感受态细胞并转化。 123 hTRX克隆基因序列分析 以阳性克隆重 组质粒cDNA为模板，选择，I7测序引物，双脱氧终 止法测定克隆基因序列。 124 pe
10、DNA30hTRX真核重组质粒的构建用 EcoR I和BamH I双酶切经测序验证的pUCmT hTRX质粒DNA，回收目的hTRX eDNA基因片段， 将其定向克隆至经EeoR I和BamH I双酶切的 pcDNA30真核表达质粒上，以常规氯化钙法转化 DH5a感受态细胞，用PCR和双酶切分析法鉴定重 组子。 2结果 21 PCR扩增hTRX基因PCR产物经l琼脂 糖凝胶电泳，可见PCR产物约为一335 bp的片段， 与理论预测结果相符。 22重组质粒pUCmThTRX的鉴定pUCmT hTRX质粒经PCR和双酶(EeoRI、BamHI)切法鉴定 均出现335 bp大小的条带，表明重组载体构
11、建正 确。 23 扩增hTRX基因测序与分析测序结果和已 发表的序列与基因库数据相比完全一致。 24重组真核表达载体pcDNA30hTRX的鉴定 pcDNA30hTRX经PCR和双酶切鉴定均出现了 335bp大小的条带，测序结果同克隆测序结果，表明 真核表达载体构建正确。 3讨论 Southern分析表明在人类基因组中存在几种 hTRX基因，但至少其中之一是无活性的假基因。 同植物和细菌的TRX一样，hTRX具有高度保守的 酶活性中心：TrpCysGlyProCys。活性中心的二巯 基能被可逆地氧化形成二硫键，并可通过这个过程 来控制靶蛋白中二硫键或二巯基的形成，调控靶蛋 白的活性与功能。研究
12、发现，其活性部位CXXC存 在于许多具有类似活性的蛋白质中 J，但是，hTRX 与大肠杆菌TRX的活性中心不同，其活性中心还有 另外的3个半胱氨酸，该结构赋予hTRX独特的生 物活性。已证实成人T白血病细胞的自分泌生长 因子成人T细胞衍生因子即为hTRX 。 因为mRNA编码hTRX在细胞分裂活跃的组织 中高表达，所以我们以胎肝细胞RNA为模板，根据 hTRX基因已知序列设计引物，用RTPCR方法扩增 出hTRX成熟蛋白基因片段。经克隆后测序分析比 较，结果与Gasdaska等从HT 29结肠癌肉瘤细胞、 Lalop EB病毒转换化的人淋巴母细胞和正常人肝组 织提取的hTRX eDNA序列完全
13、相同。克隆序列与 GenBank提供的hTRX cDNA序列完全相同。王应 等通过对从人胎肝细胞来源的hTRX eDNA序列分 析，发现其只包含了hTRX的第1、2、4、5个外显子， 第3个外显子(60 bp)被完整地剪切掉，其他核酸序 列及另外6种模板来源的hTRx eDNA序列与Gen Bank提供的相同 。真核表达载体是基因转导的 理想载体，阳离子脂质体介导法又以其转染效率高、 无免疫源性、整合和扩散性小、操作简便、容量大而 47 受到国内外学者关注。本实验中我们构建了hTRX 真核表达载体，经PCR、双酶切和基因测序结果均 表明重组载体pcDNA30hTRX构建正确，为进一 步pcDN
14、A30-hTRX转染内皮细胞，探讨hTRX基因 的生物学活性及其在内皮细胞氧化应激过程中的作 用奠定了基础。 参考文献： 1Hideaki K，Hajime HRedox regulation of celluar signallingJ Cell Signal，1999，11(1)：114 2Hirota K，Nlatsui M，Murata MNucle ore doxin，glutaredoxln， and thioredoxin differentially regulate NFkappaB，AP一1，and CREB activation in HEK293 cellsjBioch
15、em Biophys Res Com mun，2000，274(1)：177182 3Yong CKHeroin induced activation of the thioredoxin gene by NF一 山东医药2010年第5O卷第45期 KBJJJ Biol Chem，2001，276(21)：1839918406 4Sano HThioredoxin is associated with endotoxin tolerance in mice JCfit Care Med，2002，30(1)：190194 5Nigam SK，Goldberg AL，Ho s，et a1A se
16、t ofendoplasmie reticulum proteins possessing properties of molecular chaperones includes C binbing proteins and members of the thioredoxin superfiunily JJ Bio Chem。1994，269(3)：17441749 6Gasdaska PY，Oblong JE，Cotgreave IA，et 81The predicted amino acid seqoeoce of human thioredoxln is identical c0 th
17、at of the auto- crlne growth factor human adult Tcell derived factor(ADF)：thi oredoxin mRNA is elevated in some human tumor8f J1Biochim Bio- phys Acta，1994，121(8)：292-296 7王应，王玉刚，张颖妹，等人硫氧还蛋白存在不同的选择性剪 切形式J科学通报，1998，43(1)：63-67 (收稿日期：2010-0912) 炎症反应、胰岛素抵抗与多囊卵巢 综合征的关系 钱铁镛 (无锡市第二人民医院，江苏无锡214002) 摘要：目的探讨
18、多囊卵巢综合征(PCOS)患者内分泌代谢特点及与炎症反应的关系。方法选择5l例P COS患者按BM1分为超体质量组35例和正常体质量组16例，并采用达英一35和二甲双胍联合治疗；另择20例BMI 正常的非PCOS患者为对照组。测定PCOS患者治疗前后内分泌及代谢相关指标变化并与对照组比较。结果治 疗前PCOS超体质量组CRP、胰岛素、HOMAIR均高于对照组，差异有统计学意义(P均001)。治疗后PCOS患 者促黄体素、总睾酮、雄烯二酮、泌乳素、CRP、胰岛素、HOMAIR均较治疗前明显下降，差异有统计学意义(P均 005)。结论炎症反应、胰岛素抵抗与PCOS发病有关，达英-35与二甲双胍联合
19、应用能改善COS患者的IR和 炎症反应。 关键词：多囊卵巢综合征；胰岛素抵抗；C反应蛋白类 中图分类号：R71175 文献标志码：B 文章编号：1002-266X(2010)45-0048-02 多囊卵巢综合征(PCOS)是女性常见的生殖内 分泌和代谢紊乱性疾病，PCOS患者尤其是肥胖者 易发生动脉粥样硬化、2型糖尿病、高血压、冠心病 等远期并发症。因此，本文对胰岛素抵抗(IR)及炎 症反应在PCOS发病中的作用进行了探讨。 1资料与方法 11 临床资料收集2008年1月一2010年5月于 我院门诊就诊的部分PCOS患者51例(PCOS组)， PCOS诊断符合2003年鹿特丹国际会议制定的标
20、准，并排除迟发型先天性肾上腺皮质增生、柯兴综合 征、高泌乳素血症和肾上腺肿瘤等其他类似疾病。 患者均无肝肾功能异常，无心血管系统及其他内分 泌代谢紊乱疾病，3个月内未服用激素类药物。P一 48 COS组以体质量指数(BMI)23 kgm。为界限分为超 体质量组35例和正常体质量组16例。另选择BMI 正常的同期体检育龄妇女2O例为对照组。 12方法 121治疗方法PCOS患者于月经周期(自然周 期或孕激素撤退性出血)的第5天开始口服达英一 35，1 d，21 d为1个周期，共用3个周期。同时 加二甲双胍05 g次，2次d，5 d后如患者能耐受， 加至05 g次，3次d。 122检测方法性腺激素指标：有月经者于月 经第24日、闭经者于闭经3个月8：oo(禁饮食10 h 后)采肘静脉血测定促卵泡素(FSH)、促黄体素 (LH)、泌乳素(PRL)、雌二醇(E：)、总睾酮(T)、雄
