1、中国人类遗传资源 疾病石蜡包埋组织收集整理保存 技术规程 Technical Specification for the Paraffin Imbedding Tissue Collection and Trimming and Preservation of Chinese Disease Genetic Resources （讨论稿） 中国人类遗传资源平台项目组 2005 年 9 月 前 言 石蜡有适当硬度，包埋组织能够常规制备成 36 微米厚度的切片用于诊断和研究。由于石蜡包埋组织能够较长时间地保存组织内的蛋白质和核酸，用石蜡包埋固定好的人类疾病组织制作成切片，可用于 HE 染色分析（通
2、过镜下观察，做出临床病理诊断） 、D N A及 RNA 的原位杂交分析、蛋白质分析、核酸提取用于病原微生物的诊断或其它分子生物学诊断及研究等。故规范性地作好石蜡包埋组织、提供适宜的蜡块储存环境、严格培训蜡块保管人员，以及明确蜡块管理使用程序非常重要。 目前，我国尚无关于人类疾病石蜡包埋组织收集整理保存工作的国家标准，为使我国相关工作有章可循，规范操作和管理，我们根据目前的研究积累，参考国际相关做法，同时结合中国国情，制定本规程。 II目 次 前 言 II 1 范围 .1 2 规范性引用文件 .1 3 术语和定义 .1 4 固定后组织的取材、脱水、透明、浸蜡 .2 4.1 取材 .2 4.2 洗
3、涤 .2 4.3 脱水 .2 4.4 透明 .3 4.5 浸蜡 .4 5 组织包埋 .5 6 切片、展片及烤片 .6 7 染色 .7 8 封片 .8 9.1 蜡块存放环境 .8 9.2 蜡块存放温度 .8 10 保管人员的资格及要求 .9 11 蜡块使用的范围 .9 12 蜡块的医疗安全规范 .9 参 考 文 献 .11 III人类疾病石蜡包埋组织收集整理保存技术规程 1 范围 本规程适用于与人体疾病石蜡包埋组织标本相关的诊断、医学及司法鉴定、科研操作，因此在医院、司法机关和科研单位应规范执行。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本规程的引用而成为本规程的条款。凡是注日期的引用文件，其随
4、后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规程，然而，鼓励根据本规程达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规程。 GB/T 1.1-2000 标准的结构和编写规则 GB 19489-2004 生物安全通用要求 ISO 15189 医学实验室质量和能力的专用要求 ICD-10 WHO 国际疾病分类编码 CNAL AC23-2003 医学实验室认可准则 人类疾病固定组织的收集整理保存技术规程 人类遗传资源管理办法 赫尔辛基宣言 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 人类疾病石蜡包埋组织资源 是指可经过石蜡包埋保存的人体
5、各种疾病组织材料及相关信息资料。 3.2 标本 为了进行疾病的临床诊断、治疗及相关的研究工作，所切取或采集的人体各组织器官的样本。 3.3 固定 人体组织固定是采用适宜的固定液充分地固定组织，以便将组织细胞的固有形态结构保存下来，满足疾病诊断和相关研究的需要。固定液除了可以固定组织之外，还具有硬化组织细胞的作用。 4 固定后组织的取材、脱水、透明、浸蜡 人体新鲜组织的固定要根据后期不同的用途选用不同的固定剂，常规选用4%中性甲醛液（用缓冲液配制），经病理医师取材和标记后，将组织依次进行冲洗、脱水(用递升浓度的乙醇等)、透明(用二甲苯等)和浸蜡(用石蜡)处理，然后用石蜡将组织包埋成蜡块，再经切片
6、和染色，制成切片。 4.1 取材 由具有一定经验的病理医师进行组织标本的取材。该医师应熟悉正常和异常组织大体结构，必须切取到病变组织、正常组 织及二者交界组织，大小各为 2cm1.5cm0.3cm，同时完成相关的记录，如病理号、取材部位、组织大小和大体描写等。 4.2 洗涤 洗涤的目的是把渗入组织中的固定液洗去，以利于脱水及透明，并防止染色过程中福尔马林色素的产生。经常规固定液固定的组织须流水冲洗约 30 分钟，具体时间依固定时间长短而稍有不同。 4.3 脱水 脱水的目的是去除组织内固有的水分和组织经过固定及洗涤后含有的大量水分，以利于透明剂和石蜡渗入组织。可使用脱水剂逐步将组织块内的水分置换
7、出来。脱水剂必须是易溶于水的有机溶剂，常规使用的有乙醇、丙酮等。由于脱水剂穿透组织的速度很快，常导致组织过度收缩及变脆，因此必须采用梯度脱水的处理方法，从低浓度开始，依次递增，直至纯脱水剂，最终组织内部的水分将被高浓度脱水剂所取代。目前，脱水过程已全部实现了自动化，各公司生产的脱水机型号和基本原理一样，具体操作方法及条件设定请参照脱水机使用说明。整个脱水过程在常温下进行： a) 乙醇甲醛（AF）液固定：60120 分钟； b) 80%乙醇：60120 分钟； c) 95%乙醇 I：60120 分钟； d) 95%乙醇 II：60120 分钟； e) 无水乙醇 I：3060 分钟； f) 无水乙
8、醇 II：3060 分钟； g) 无水乙醇 III：3060 分钟； 4.3.1 注意事项 a) 未经充分固定的组织不得进入脱水程序， 用于脱水的试剂容积应为组织块总体积的 510 倍以上； b) 组织脱水必须由低浓度向高浓度逐步过渡，若组织含水量过多(如胚胎组织)，则脱水剂浓度应由更低级(如 30%40%乙醇)开始； c) 组织脱水要彻底干净，只有把水分脱去，才能使组织块在二甲苯中透明，石蜡才能渗透到脂肪细胞和组织中去，若脱水不彻底，则切片后组织与空气接触即干燥收缩，蜡块切面组织会出现凹陷现象。即使勉强切片，染色效果也很差，且组织于染色时易脱落。因此脱水彻底与否是制片质量好坏的一个重要环节；
9、 d) 脱水时间要适当，若时间太短则脱水不彻 底；时间过长则会促使组织收缩变硬。脱水时间要根据组织块大小、厚度、脱水剂的新旧程度等适当增减调节； e) 脱水必须在有盖瓶子内进行。因高浓度乙 醇很易吸收空气中的水分，阴雨天空气中湿度较大也会影响乙醇的浓度； f) 必须保持无水乙醇的绝对无水。纯乙醇中 如含有水分，可加入无水硫酸铜吸收水分。无水硫酸铜遇水变成蓝色，用后的无水硫酸铜，经高温干燥后，仍可重复使用。另一方法是采用磺酸钾型阳离子交换树脂吸收水分。把吸满了水的树脂，加温到 150左右变成干燥的树脂，也可重复使用。 4.4 透明 乙醇等脱水剂不能溶解石蜡，所以在浸蜡之前需要一个既能与乙醇混合又
10、能溶解石蜡的媒剂，称为透明剂，以便使石蜡渗入到组织中去。当组织中全部为透明剂占有时，光线可以透过，组织可呈现不同程度的透明状态，此种现象称为透明。如果组织不能透明，表明脱水不彻底，必须重新脱水补救，否则将影响到浸蜡的进行，但重新脱水后的效果往往不好。 4.4.1 透明效果判定 肉眼观察组织块呈半透明或透明状态即可。 4.4.2 透明剂 常用的透明剂有二甲苯(xylene)、甲苯 (toluene)、苯(benzene)、氯仿(chloroform)和 TO 型生物制片透明剂等，各类透明剂各有其优缺点。 对于人体组织宜使用二甲苯进行透明： a) 二甲苯 I：20 分钟； b) 二甲苯 II：20
11、 分钟； c) 二甲苯 III：20 分钟。 4.4.2.1 注意事项: a) 二甲苯的容积应为组织块总体积的 510 倍以上； b) 组织块在二甲苯中透明的时间不宜过长,以防组织变硬、变脆，具体时间依不同类组织类型和大小而定，一般组织块呈现棕黄色或暗红色透明即可； c) 二甲苯应及时过滤、更换； d) 组织块经二甲苯处理后不显现透明时，常提示该组织固定或脱水不充分，应查找原因并妥善处理。 4.5 浸蜡 组织经过透明后，移入溶化的石蜡溶液内，这一步骤称浸蜡(infiltration)，其目的是以石蜡置换出组织块中的二甲苯，使较软的组织块变成有一定硬度的组织蜡块，以便切成薄片。浸蜡的方法是将组织
12、块经过二甲苯透明后，立即投入到溶化的石蜡中去。在浸蜡时组织必须经过数次纯石蜡处理(石蜡 I、II、III)，使剩余透明剂完全除尽，否则将影响切片质量。根据熔点的不同，石蜡分为软蜡和硬蜡。软蜡熔点低，硬蜡熔点高。一般切片所用的软蜡熔点为 4245或 4550，硬蜡熔点为 5254或 5660，现在也有 6264的硬蜡，适用于南方夏天或较坚硬的组织。组织较硬时，用硬蜡，反之，用软蜡。浸蜡在温箱中进行，箱内温度略高于石蜡熔点 23即可。若箱内温度偏低，石蜡会凝固，则达不到浸蜡目的。温度过高，浸蜡的组织会出现收缩变硬，同时组织中的抗原易受到破坏，不利于免疫组织化学等蛋白质分析。在更换蜡杯时，要有一定的
13、间隔时间，尽量减少组织内含有的二甲苯被带入最后的纯石蜡杯中，而影响浸蜡程度。 人体组织的浸蜡操作宜采用以下步骤： a) 石蜡 I（4550）：60 分钟； b) 石蜡 II（5658）：60 分钟； c) 石蜡 III（5658）：60 分钟。 4.5.1 注意事项 a) 熔化的石蜡必须有专人负责，必须在熔蜡 箱内或水浴中（70）进行，不得用明火加温； b) 熔蜡的容积应为组织块总体积的 510 倍以上； c) 组织块经二甲苯适度透明后方可转入浸蜡 过程，应尽可能减少将透明后组织块表面的二甲苯带入熔化的蜡中； d) 浸蜡时间要适当。时间过短，浸蜡不充分 ，组织将过软；过长时间则组织变硬、变脆；
14、 e) 熔蜡应定期过滤、更换。 5 组织包埋 包埋(embedding)是组 织经过固定、脱水、透明、浸蜡后，再用石蜡铸成蜡块的过程。包埋用的石蜡熔点要和浸蜡用的石蜡熔点相一致；包埋用的石蜡温度要稍高于浸蜡的温度。先将熔化的石蜡倾入包埋模具中，再用加热的弯曲的钝头镊子轻轻夹取已经浸过蜡的组织块，使组织块的最大面或特别指定处的组织面向下埋入熔蜡中。要将组织块平整地置放于包埋模具底面的中央处。一般切面方向朝下放置；管状、囊壁、皮肤及层次清楚的黏膜应立埋；包埋于同一蜡块内的多块细小组织应彼此靠近；包埋时应使组织急速均匀地凝固，以免石蜡产生白色结晶导致切片破碎。 注意事项 a) 应将组织块严格分件包埋
15、，发 生包埋差错时，必须立即与取材本人取得联系，及时处理。 b) 必须严防各种异物污染，勿将无关组织埋入蜡块内。 c) 包埋过程要操作迅速，以免组织块于尚未埋妥前熔蜡凝固。 d) 包埋用的熔蜡使用前应先静置 沉淀、过滤，做到纯净；熔蜡时不得使用明火，以防燃烧。 6 切片、展片及烤片 将预先冷却的组织蜡块装在切片机固定器上，注意调节组织块切面，使之保持垂直，并与刀刃平行。校正切片机的切片厚度标尺，一般 46m 为宜。调节机身的运转部分，使组织块与刀刃接触，修出组织切面。左手平持毛笔，右手均匀摇转切片机机把，切片带出来之后，用毛笔轻轻托起，再用眼科镊子轻摄蜡片，以正面放入展片箱(40左右热水)中，
16、待摊平整后，手持清洗好的载玻片之一端，投向水中附贴切片，待切片被接引附贴于载玻片上后，再移至玻片下 23 处；切片附贴后，放在空气中稍晾干，即可进行烤片(常规 60温箱中烤 3060min)。血块组织、皮肤组织须及时烤片；脑组织及较大组织须完全晾干后，才能进行烤片。 6.1 注意事项 a) 蜡块四周在切片时应修切整齐，尤其是上 下线，要求平行，否则切片弯曲不直，无法连成带状。 b) 切片刀要锋利，刀口无缺损，才能切出完 整薄片。若切片刀不够锋利，则不能顺利连续切片；切片刀如有缺口，则切片易断裂、破碎或不完整。 c) 切片刀及蜡块都要固定牢靠，组织切片机 各个零件和螺丝应旋紧，否则将会产生震动，
17、以致切片厚薄不均。 d) 摇动切片机时，用力不能过猛，应保持机 身平稳，防止震动，否则将导致切片厚薄不均。 e) 切片刀倾角不宜过大或过小，以 2030 度为佳，角度过大则切片上卷。过小则切片皱起。 f) 石蜡过软或室温过高，切片易粘于切片刀 上，或发生皱缩，此时可将蜡块置于水槽内冷冻后再切。反之，如室温低或石蜡过硬，致切不成片时，可在蜡块切面上哈气加温。 7 染色 染色是利用染色剂使组织和细胞染上不同的颜色，便于显微镜观察。根据不同的需要可以分成许多种染色，如 HE 染色、各类特殊的组织化学染色、免疫组化染色等；石蜡切片还可以用于分子病理学诊断或研究的原位杂交、FISH 等。无论后续将进行哪
18、一种分析，都必须有一张 HE 染色的片子，用于常规观察基本病变并核对组织取材正确。目前许多公司都有各种型号的染色机，其基本原理一样，可根据具体实验需要设定操作程序。在此仅介绍石蜡切片的苏木精-伊红（HE）染色方法。 7.1 HE 染色过程： a) 二甲苯 I：510 分钟； b) 二甲苯 II：510 分钟； c) 无水乙醇 I：13 分钟； d) 无水乙醇 II：13 分钟； e) 95%乙醇 I：13 分钟； f) 95%乙醇 II：13 分钟； g) 80%乙醇 I：1 分钟； h) 蒸馏水：1 分钟； i) 苏木精液染色：510 分钟； j) 流水洗去苏木精液：1 分钟； k) 1%盐
19、酸乙醇：13 秒； l) 水洗：12 秒； m) 返蓝（温水或 1%氨水）：510 秒； n) 流水冲洗：12 分钟； o) 蒸馏水：12 分钟； p) 0.5%伊红染液染色：13 分钟； q) 蒸馏水稍洗：12 秒； r) 80%乙醇：12 秒； s) 95%乙醇 I：23 分钟； t) 95%乙醇 II：23 分钟； u) 无水乙醇 I：35 分钟; v) 无水乙醇 II：35 分钟; w) 无水乙醇 III：35 分钟 x) 二甲苯 I：35 分钟; y) 二甲苯 II：35 分钟; z) 二甲苯 II：35 分钟 8 封片 切片染色后用胶类物质将其封固，以利于长期保存。常规 HE 染色
20、用中性树胶封固；其它染色或特殊的分析，按照相关操作要求进行。 9 蜡块储存的环境及条件 9.1 蜡块存放环境 蜡块应当存放在地上（避免在地下室）有通风设施、能承重、空间较大的房间内，至少能保证 50100 年的蜡块存放。应用专门设计的密集柜，蜡块和相应的 HE 切片要相邻存放，便于查找与核实。该空间应放有登记簿、显微镜、灭火设备、除虫试剂和相关设施。 9.2 蜡块存放温度 由于包埋组织的石蜡有一定的熔点，当储存温度接近该熔点温度时，蜡块就会变形，从而影响包埋组织。故存放石蜡组织块的地方，温度应远低于包埋石蜡的温度。但若温度过低，石蜡与组织块之间也容易产生裂隙。一般的蜡块的储存温度应在 040。
21、 蜡块存放地应专人负责，保证其卫生、安全，特别是要防火、防虫咬、防盗；蜡块每次切片后均要将切面用蜡封盖，避免组织与空气直接接触。 10 保管人员的资格及要求 由于蜡块是人类疾病的个体不可再生资源，承载着患者疾病形态学信息及其组织的蛋白质和基因信息，因此蜡块的保管非常重要，对保管人员要有相当高的要求。 蜡块保管人员应该是熟悉医学知识（至少医学相关中专以上毕业生） ，懂得医学资料管理，能做好蜡块的资料汇编和索引工作，熟悉蜡块的制作过程，蜡块保存和借阅注意事项，同时要有非常强的医学责任心，并能严格遵守规章制度，不向外透露任何患者信息，没有经过严格的审批，不能外借任何切片和蜡块，做好完整的蜡块保管记录
22、，对可能发生的任何相关事故都有防范措施。 11 蜡块使用的范围 由于蜡块带有患者的私人信息，故有一定 的私密性，严格来说，未经患者同意不能随意使用，更不能用于出售或其他商业目的，合理地使用请参见人类遗传资源共享原则。 11.1 蜡块的使用范围包括： a) 在医疗机构，用于患者本人疾病的诊断，如用于 HE 切片进行形态学观察并做出病理诊断；切片做免疫组化和原位杂交、FISH、提取核酸等辅助诊断和协助临床治疗； b) 经相关机构批准，用于科学研究，如寻找病因和探索发病机制等； c) 少见和罕见疾病，或对未来医学发展有研 究价值，纳入国家的资源保存等相关项目； d) 在患者同意或要求下，经蜡块保存单
23、位批准，可进行其他合理的使用。 12 蜡块的医疗安全规范 患者的病情等文字资料(含电子信息资料)、非文字资料(组织的石蜡包埋块、切片等)以及其他相关资料均为有价值的医学资料，皆由受理病理学检查的病理科按照相关规定的期限妥善保存。管理单位必须设立病理档案资料室、制定病理档案资料管理制度(包括病理检查资料的归档 、借用和归还手续等)并由专人管理，蜡块的管理尤为重要。因为蜡块是不可再生的资源，即可有限地复制切片而进行组织化学、蛋白质和核酸研究。蜡块的丢失将不可避免地造成医患矛盾、医疗纠纷、不同程度的医疗事故等。为了避免出现医疗安全问题，提出如下蜡块安全规范： a) 医生完成诊断、发出病理报告后，切片
24、及相关资料应及时送档案室归档。负责资料管理的技术员应与医生认真清点切片及相关资料，做好交接工作，并做出详细的书面记录。 b) 蜡块统一存放，专人管理，做好登记和索引工作； c) 为了避免蜡块中的组织被切光，原则上蜡 块不外借；若有特殊需要，经过严格的审批后，可采用外借切片、限期内归还并仅切白片的办法，解决会诊等问题。 d) 特殊情况必须外借蜡块时，需经蜡块保存单位医疗安全管理部门的批准，经病理诊断部门医师将其对应的 HE 切片进行核实，并在交纳了归还保证金后方可进行； e) 随着科学的发展，对疾病有不同的、更加深刻的认识，作为普通资料（特殊病例除外）需要定时清理，以避免人力、物力及空间等有限资
25、源的浪费。一般规定门诊患者的蜡块查询时间为送检后 15 年，住院患者为送检后 30 年。蜡块保存单位有权根据自己单位的具体情况在相应时限之后对蜡块进行清理。 参 考 文 献 1 (英)C.F.A.卡林著， 孔庆雷译. 组织病理学与组织化学技术手册. 北京： 科学出版社. 1982 2 李学农主编. 现代病理与实验诊断技术. 北京：人民军医出版社. 2003 3 中华医学会编著. 临床技术操作规范：病理学分册 北京：人民军医出版社. 2003 4 徐思行，余心如主编. 病理诊断与技术规范. 浙江：浙江大学出版社. 2003 5 Juan Rosai. Surgical Pathology. Ninth edition. Mosby. 2004 6 Weidner, Cote, Suste，Weiss. Modern Surgical Pathology. Saunders .2003 11
