1、细胞培养基础培训小实验，大学问小实验，大学问培训日程安排010203上午： 9:30-11:30 理论学习下午： 13:0015:00现场演示下午： 15:3016:30练习操作细胞培养相关设备细胞培养相关设备细胞培养技术细胞培养技术细胞培养主要试剂细胞培养主要试剂细胞培养常见问题细胞培养常见问题细胞培养相关设备配液培养灭菌贮存浸泡缸去离子水干燥箱超声破碎仪高压灭菌锅移动紫外灯超净 工作台 生物 安全柜CO2钢瓶 倒置显微镜台式 离心机 CO2培养箱血细胞计数 板 移 液 器电动 移液器普通冰箱超低温冰箱液氮罐干燥器程序 降温盒0.22m滤膜、滤器pH计天平磁力搅拌器蠕动泵4个功能区准备区：清
2、洗、消毒、准备工作制备区：培养基、试剂配制贮存区：细胞库、物品存放无菌区：更衣 +缓冲 +操作 +培养细胞培养相关设备超净 工作台 /生物安全柜二氧化碳培养箱显微镜液氮罐离心机超 净工作台细胞培养一般采用 垂直流 超净工作台紫 外照射实现 杀菌功能，紫外 杀菌（ 表面 ） +臭氧杀菌（死角，挡板关闭）每次紫外照射 20-30min后，鼓风 10min后使用（注意培养室换风），洁净度达到 百级紫外灯在 3000 小时後功率会降至原来 70%，及时更换上方的 粗滤布定期拆下 清洗正压状态，气体外泄，只保护操作对象，而 不保护工作人员 和实验室环境生物安全柜负压状态，气体不外泄，既保护样品，更侧重
3、于保护操作人员和 环境二 级 安全 细胞，携带病毒（ 如 hele、 KB）原代培养的临床人源样本慢病毒相关实验在通风橱中部开阔区域放置细胞培养容器移 液器置于右前方易于取用的地方试剂 和培养基置于右后方，便于吸取试管 架置于中后部，用于固定其他 试剂细胞培养瓶置于左前部75%酒精放于外部，用于消毒物品安全柜内物品布局中央区域才是严格的无菌区域，可进行无菌操作离心机离心离心 不离心不离心有有 机械损伤机械损伤去除去除 胰酶胰酶 残余活性残余活性去除去除 EDTA 残留残留增加增加 污染机会污染机会 减少减少去除去除 代谢产物代谢产物 残留残留？ 可能去除可能去除 死细胞、细死细胞、细 胞碎片胞
4、碎片 残留残留细胞培养中的离心 速率一般为 300xg (约 1,000rpm)， 5 -10 分钟，过高之转速，将造成细胞死亡CO2培养箱干式与湿 式之分CO2培养箱设置条件为 37 ， 5% CO2温度： 37气相： 95%空气和 5%CO2，CO2 的作用：细胞生长需要、代谢产物、维持 PH， ( CO2 ， PH?)水盘的水补充高温蒸发的水。水盘的水如何防止污染：无菌水 +定期 2周更换 +防腐剂（ 0.02%叠氮钠或者 2%硫酸铜）显微镜 -倒置常见 品牌 ：蔡司、莱卡、奥林巴斯、尼康条件允许，可配置 CCD摄像机 ,荧光系统观察细胞形态、状态、污染液氮罐液氮的温度：液相， -196
5、 ，气相 -110 左右。有数据表明， -70 ，细胞每年死亡 10%。通风、 阴凉及时补充，液氮报警装置，液氮到中间位置时需补充 。安全：护目镜 +防护服污染：冻存管存在泄漏的可能，细胞不能与菌种、组织样本共用一个液氮罐细胞培养主要试剂抗生素抗生素胰酶胰酶培养基培养基水水 /平衡盐平衡盐血清血清添加物添加物细胞的培养的试剂细胞的培养的试剂水细胞培养用水：超纯水、三 蒸 水、注射水贮存时间不能久，尽量少于外界接触。水中污染物：内毒素 、无机离子（重金属，如铅、锌等），或有机复合物 （单宁酸 ，杀虫剂等）自来水中 典型的杂质 和细胞培养用水的目标值平衡盐溶液作用：洗涤细胞，作为配制其他试剂（胰酶
6、）的基础液（渗透压、 pH适应细胞）常用： PBS、 Hanks、生理盐水培养基培养基作用：人工 模拟细胞体内生长的营养环境，维持细胞生长的营养物质 ,提供细胞营养和 促进 细胞生长增殖的物质基础。常见品牌： Gibco Hyclone常见形式：市售干粉 自己配制、 过滤除菌（水 ，无菌 器皿） 液体培养基 注意有效期有效期 干粉： 2年，液体： 10个月液体培养基液体培养基 干粉培养基干粉培养基干粉状形式、节省空间需要在超纯水中溶解、加入碳酸氢钠、调节 pH、用 0.22um的滤膜过滤 特性特性液体形式直接可以使用，不需要加入其他成分，不需调 pH，不需过滤节省空间、价格低 优点优点 什么东
7、西都不需要自己准备、不需调 pH耗时、配置差异 缺点缺点 费空间、高价格培养基所有的培养基都必须在 2 8 ，避 光保存 ，不能冷冻，干粉培养基可在 室温 情况下运输。常见种类： RPMI （ Roswell Park Memorial Institute） 1640 、 DMEM（高糖）是最常用的DMEM or DME (Dulbeccos Modification of Eagles Medium)是 Dulbecco改进的 MEM. 氨基酸和维生素浓度是 BME的 4倍 .最先葡萄糖的浓度是 1g/L，称为低糖 DMEM,后来增加到4.5g/L，称为高糖 DMEM，广泛用于各种细胞培养
8、。RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute # 1640):是 McCoy s 5A 的改进版，含有高浓度的肌醇。广泛用于悬浮细胞的培养。如人类白细胞，骨髓瘤细胞，杂交瘤细胞等血液来源的 细胞 认真阅读说明书。说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有 NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、 HEPES 等。 这些 成分有些是必须添加的，如 NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。 配制是要保证充分溶解， NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要等培养基完全溶解之后才能添加。 配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于 4 度。培养基培养基Gibco商品化的培养基选
9、择合适的 RPMI-1640RPMI-1640配方31800系列是最基础的培养基 不完全培养基：直接购买或者配制的培养基完全培养基：不完全培养基 +血清 +双抗 +补充试剂氨基酸维生素无机盐水其它必须氨基酸非必须氨基酸特别的谷氨酰胺生物素叶酸维生素 B12维持渗透压酶活性pH 超纯水三蒸水注射水 . 葡萄糖 能量来源酚红 . 12345血清含有的维生素种类更齐全血清 血清的主要成分蛋白质：提供蛋白。与细胞培养相关功能贴壁：层粘连蛋白 (laminin,LN)、纤维连接蛋白 (fibronectin,FN)、胎球蛋白胰酶抑制剂：如 2-巨球蛋白， 1抗 胰蛋白酶白蛋白：携带脂类、转运脂肪酸、结合
10、类固醇和维生素进入细胞转铁蛋白：转运铁离子增加培养基的成泡性，减少吹打时的切力，缓冲 pH，血清粘性，离心减少机械损伤生长因子与激素：细胞增殖与分化必须，如血小板生长因子、胰岛素脂 类、碳水化合物、尿素、无机物、维生素血清成分复杂，大部分成分已为人知，但没有完全理解。血清存在批次差异，供体的个体差异、性别、年龄、生理条件、营养条件血清存在病毒或者致病因子的风险血清 中含有易变物质 ，可能是 “ 瓶中恶化 ” 的原因之一。血清 的 功能生长、分化必须的物质：生长因子、激素、基础培养基中没有的微量物质，小分子营养物；转运维生素、脂类、金属离子和微量元素等 白蛋白促进细胞贴壁、铺展起酸碱度缓冲液作用
11、提供蛋白酶抑制剂毒素灭火，蛋白质与有毒金属和热源物质结合123456血清FBS胎牛血清胎牛血清NBS新生新生 牛血清牛血清CS小牛血清小牛血清血清的分类胎 牛还未接触外界 ，免疫系统激活最少，血清 中所含的抗体、补体等 对外来物质排斥最小，对细胞 有害的成分最少 。血清八月龄胎牛心脏穿刺采血10至 14 天的小牛1年以内的小牛血清存在批次差异，多因素导致。每批次使用之前要验证 大部分实验室没有做到。血清如何使用-20 保存，可保存 3-5年 ， 4 不要超过一个月，短期内无法用完一瓶，分装 -20 保存。保存-20 4 室温 37 室温 ，过程不断摇晃，保持均一，可减少沉淀完全培养基添加 5-
12、10%的血清，一般 10%。有血清细胞可以增殖，无血清细胞不增殖但可生存使用56 水浴 30min，灭活补体（补体具有酶活性的蛋白质，不耐热，介导溶菌、溶血、炎症 ）灭活验证融解血清血清 血清使用常见问题1 血清是否需要灭活？灭活的目的是去除血清中的补体成分， 避免补体 对细胞产生毒性作用。血清经过灭活也会损失一些对细胞有利的成分，如生长因子 ，网络上最常见的说法正确 处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。研究 补体系统时，有人建议 ES细胞，平滑肌细胞时推荐 使用。个人建议，根据生产工艺和血来源，进口的胎牛血清不灭活，小牛、国产的胎牛灭活。2 为什么血清 会出现 沉淀？如何处理？沉
13、淀产生原因：血清 中的各种 蛋白特别是脂蛋白 （如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的 混浊。如何处理： 1 离心去除，不能过滤 2 吸取上层的血清使用，不吸到沉淀，最后的沉淀弃去3 添加了血清的培养基可长期保存吗？血清的某些成分在培养基中会 降解，添加了血清的 培养基建议 1周内使用。4 细胞因子 、胆固醇诱导细胞的实验，细胞要先撤去血清饥饿湿度95%温度37 ，耐低不耐高，代谢与温度成正比pH耐酸不耐碱， 7.2-7.4，干粉配时调制7.0-7.2，经过滤膜过滤会增加 0.2渗透压人血浆渗透压 ，290mmol/L，医学上规定在 280 320范围内的为等渗 ,培
14、养基一般略为低渗，如 RMPI-1640为 260-270模拟的理化环境模拟的营养环境水蛋白质与氨基酸：生长因子与激素碳水化合物与单糖无机离子与微量元素胰酶胰酶：胰脏中 分离，择地水解蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链， 最佳作用温度 37 ,Ph 8.0，常用浓度 0.1%-0.25%， 一般用不含 Ca2+、 Mg2+的平衡盐缓冲液配制（ PBS或 Hanks），可用含有血清 培养液终止 胰酶对细胞的 作用EDTA：化学螯合剂，螯合 Ca2+、 Mg2+，一般用不含 Ca2+、 Mg2+的平衡盐缓冲液配制（ PBS或Hanks）， 不能被血清中和 ，常用浓度为 0.02%小提示：1
15、、 Ca2+ 、 Mg2+ 和 血清降低 胰酶的 活性2、血清 中有 胰蛋白酶抑制剂（如 2-巨球蛋白）， 另外 胰蛋白酶的效价有限，血清中的大量蛋白质也使胰酶消化能力消耗掉 了3、每次 进行传代消化前，一定要用 D-Hanks液或 PBS液反复冲洗细胞培养瓶，以便于将含血清的培养基冲洗干净，这样就能大大提高消化液的消化能力 。4、胰蛋白酶对细胞的分离作用与细胞的 类型 关系密切 ，其他影响因素有胰 酶溶液的活性（配制条件、冻存或4 保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等）、消化时的温度（气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度）以及所加胰酶溶液的多少 等。5、细胞贴壁与层粘连蛋白 (la
16、minin,LN)、纤维连接蛋白 (fibronectin,FN)有关，而这些蛋白石钙依赖性蛋白，EDTA能与这些蛋白 竞争性结合 Ca2+、 Mg2+6、胰酶细胞消化液消化细胞时间不宜过长，否则细胞铺板后生长状况会较差 。 1-2ml， 1-5min内消化完成。常用 .2 胰蛋白酶 . 抗生素1 、常用 抗生素，青霉素加上链霉素，俗称 “ 双抗 ”2 、初学者或者环境较差者可使用抗生素，如条件允许， 尽量不使用，是 药三分毒抗生素危害：促进抗药性有机体生长，掩盖了隐蔽性、低水平的污染，一定程度掩盖轻度支原体污染3 、双抗一般配制成 100X的贮存液，使用时添加至培养基 中。将双抗配制好，最好
17、滤菌后再分装到 EP管中，保存到 -20度以下的冰箱。用时取一支，若一支没用完，可以立即保存到 -20度继续再用，但反复冻融的次数不宜过多。4、预防细菌污染，降低 污染率，但是不能完全依赖双 抗，培养细胞最关键的无菌技术酚红 作用：指示剂 pH 7.4 红色， pH 7.0 橘红色， pH 6.5 黄色，低于 pH 6.5 柠檬黄，高于 pH 7.6 红色 ，桃红，高于 pH 7.8 紫色 研究雌激素特别是固醇类，酚红会有 干扰。有些资料建议流式检测时酚红会干扰检测，实际上这种干扰时忽略不计的。液体培养基放置较 久，随着 CO2挥发， pH逐步增高；细胞培养时，细胞消耗营养，不断产生代谢产物，产物偏酸， pH降低，可以间接判断培养基的营养成分的消耗（有数据表明 95%的葡萄糖是通过糖酵解产生乳酸，降低了培养基的 PH和增高了渗透压）培养基常见添加物
