1、2013.4,细胞培养常规技术,细胞培养的定义是指在无菌条件下将活的离体细胞置于适宜的人工环境中进行培养的一门实验技术。 细胞培养技术在生命科学研究中的地位细胞培养技术作为科学研究的一种手段，已经渗入到生命科学研究的各个方面，成为必不可少的配套技术。,引言,1. 直接观察活细胞的形态结构和生命活动。用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学 等多种学科研究. 2. 直接观察细胞的变化可便于摄影。 3. 研究细胞种类如低等到高等到人类、胚胎到成体、正常组织到肿瘤。 4. 便于使用各种技术：相差、荧光、电镜、组化、同位素标记等方法观察和研究细胞状况。 5. 是分子生物学和基因工程学的研究对象，也
2、是其主要的组成部分。 6. 易于施用物理、化学生物的实验研究。 7. 易于提供大量生物性状相似的实验对象,耗资少比较经济。 8. 成为生物制品单克隆抗体生产和基因工程等的材料来源。,优点,无菌操作概念细胞培养中的基本技术是指用于防止微生物进入培养体系的操作技术。,First of all,实验室 准备室：用于进行培养器皿的清洗、包装、培养物质的准备和消毒以及供应物品的保藏等。 缓冲区： 培养室：用于进行细胞培养和各种无菌操作的实验室。（屏障系统、易清洁）,细胞培养设施与仪器,常用仪器生物安全柜、CO2培养箱、倒置显微镜、冷冻离心机、冰箱、电热干燥箱、超纯水装置、消毒锅、超声波清洗器、恒温水浴箱
3、、冷冻保存装置、天平、移液器等,常用实验耗材,缓冲液（平衡盐溶液）：组织细胞培养中常用的基本液体，可以维持渗透压、调节pH值、供给细胞生存所需的无机离子成分；用于洗涤组织、细胞等 培养液：就是人工模拟细胞在体内生长的营养环境，维持细胞生长的营养物质,它是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础 其它：,常用试剂,原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。传代培养：原代培养成功后，将培养细胞从培养器中取出，把一部分移至新的培养器中再进行培养。细胞株：通过纯系化或选择法从原代培养细胞或细胞系中分离出来的、具有特异性状或标志性状的细胞群体。,细胞培养,实验目的：运用
4、原代细胞培养技术，观察T淋巴细胞的体外增殖反应。实验原理：丝裂原刺激T淋巴细胞，诱导T淋巴细胞的体外增殖，并通过MTT法定量活细胞数量。,小鼠T淋巴细胞增殖实验,PBS缓冲液 RPMI-1640培养液 红细胞裂解液 台盼蓝 刀豆蛋白A（ConA） 噻唑蓝（MTT） 二甲基亚砜（DMSO）,实验试剂,取材 获得所需的组织器官分离细胞 将组织分离成为单个细胞纯化 分离所需细胞，去除其它细胞培养 对获得细胞进行培养与实验研究,原代细胞培养实验的通用步骤,取材：处死实验动物、消毒、取脾脏分离细胞：碾磨脾脏，释放脾脏细胞纯化：裂解红细胞培养：免疫细胞与丝裂原共培养,实验步骤,4个大方格体积： 长(1mm
5、)宽(1mm)厚(0.1mm)4=0.4mm3=0.4L实际细胞浓度： N/mL=n(4格总数)20(稀释倍数)1000/0.4(体积倍数)=n5104,细胞计数,细胞悬至适当体积 混匀细胞悬液 吸取中段液体 适当的台盼蓝稀释倍数 台盼蓝稀释后充分混匀 清洁的计数玻片 平顺加入细胞样本，无气泡无渗出 静置片刻 最佳焦距与最佳位置 一致的计数标准,细胞计数注意事项,加样,每组设3孔，每孔总体积200L，组间平行原则。,MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在595nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。,MTT法原理,计算各组OD值均数；计算ConA诱导增殖率；细胞增殖率=(增殖组-阴性对照)/(阴性对照-空白对照)100%计算各组CV%，考察加样误差；对ConA诱导与非诱导组进行t检验。,实验数据统计,实验动物福利 无菌操作 实验客观性与操作平行原则 实验记录完整,注意事项,
