1、植物细胞培养制药,意义药用植物是天然药物的宝库植物细胞培养是生产的药物可能途径 目前采用植物细胞培养生产的药物主要包括（1）苷（甙）类：包括皂苷（人参皂苷、三七皂苷、柴胡皂苷、著芋皂苷等）、强心苷（强心醇苷、毛地黄毒配质衍生物等）、甘草甜苷、香豆精苷等。（2）甾醇：包括菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、胆甾醇、异岩藻甾醇等。,强心苷类（侧链为不饱和内酯环）,甾醇,（3）生物碱：吡啶、喹啉、异喹啉等。 （4）醌类：包括蒽醌、萘醌等。 （5）蛋白质类：胰岛素、氨基酸、蛋白酶抑制剂。植物病毒抑制剂、植物抗生素等。 （6）黄酮类：具有C6-C3-C6结构，生物合成前体是苯丙氨酸和丙二酸单酰辅酶A。多为治理心血
2、管疾病和高血压的药物成分。,小檗碱,蒽醌,黄酮,植物细胞培养制药进展,第一个专利： 1956年Routin和Nickell首次数提出利用植物细胞培养技术生产天然产物的第一个专利 工业植物生物技术 ：20世纪90年代明确提出 已经从 200余种药用植物获得了愈伤组织或细胞悬浮培养物（傅经国等，2004） 国际 日本 ：紫草 人参 红豆杉 欧美 ：美国红豆杉； 德国紫锥菊 国内：罗士韦 叶和春 郑光植 侯嵩生 丁家宜,技术路线,目标植物选择 愈伤组织诱导液体培养培养条件的优化反应器扩大培养 愈伤组织诱导固体、液体培养高产细胞系筛选生物合成途径的研究 器官分化（发状根）固体液体培养条件的优化反应器扩
3、大培养有效成分提取、分离,植物细胞培养,是指在离体条件下，将愈伤组织或其它易分散的组织置于液体培养基中进行振荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养增殖，获得大量细胞的一种技术。,植物细胞培养的特点:,大小; 细胞团的形式存在; 纤维素细胞壁和大液泡,易被剪切力损伤; 生长缓慢 培养基成分丰富而复杂,易被微生物污染; 需光氧二氧化碳,培养类型,按培养对象来说，可分为原生质体培养和单细胞培养； 按培养基类型可分为固体培养和液体培养； 按培养方式可分为悬浮细胞培养和固定化细胞培养 。,植物单细胞分离和初步培养,单细胞获得： 机械法；酶解法；愈伤组织法 单细胞培养： 看护培养法（nursing
4、 culture) 饲养层培养(feeding layer culture),固体培养,固体培养是在培养基中加入一定量的凝固剂，经加热溶解后，分别装人培养用的容器中，冷却后凝结成固体培养基。 优缺点 简便易行、所占空间小 生长的不平衡，易出现了极化现象 易堆积生长过程中排出的有害物质 有些生理生化指标测定不方便 常用的固化剂 琼脂、明胶（10%）等,液体培养,1成批培养法 batch culture 细胞和培养基一次性加入到培养容器或生物反应器内进行培养,在培养过程中培养液体积不变,不添加营养成分,待细胞增长和产物积累到适当的时间,一次性收获细胞产物和培养液的培养方法.,液体培养,1成批培养法
5、 batch culture 特点： 操作简单，培养周期短. 直接反映细胞生长代谢过程. 可直接放大 不能控制底物浓度细胞易老化生长周期短效率低. 两步成批培养法 即使用两个生物反应器，第一个反应器用于细胞生物量的累积，第二个反应器用于次级代谢产物的生产。,2. 半连续培养法 semi-continuous culture 重复分批式培养或换液培养.在细胞增长和产物形成过程中,每间隔一段时间从中取出部分培养液或细胞,剩余的细胞作为种子,再用新的培养液补足到原体积,使生物反应器内的总体积不变. 特点: 细胞可持续指数生长,并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平,培养过程中可延续很长时间. 可进行多
6、次收获. 操作简便,生产效率高.,3连续培养法(continuous culture),连续培养法是利用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时间后，以一定速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给新鲜培养基以使细胞生长环境长期维持恒定的方法。 该法的理论基础是根据Monod公式，即生长速度取决于基质的浓度。maxS/(Ks+S) =特定生长速度； max=特定最大生长速度；Ks=饱和系数；S=基质浓度 两阶段连续培养法 于第一反应器中投入生长培养基并连续加入该培养基，而于第二反应器中投入生产培养基。,3连续培养法(continuous culture),特点: 细胞能在近似恒定状态下生长、营养
7、物质浓度、产物浓度、pH基本保持恒定，细胞浓度以及细胞比生长速率可基本维持不变，细胞维持持续指数增长。 稳定状态可有效地延长分批培养中的对数生长期。,3连续培养法(continuous culture),问题: 一直有细胞收获，浓度一般不高 细胞分裂快、易变异； 由于是开放式操作，加上培养周期较长，容易造成污染 对设备、仪器的控制技术要求较高。,悬浮培养（Suspension culture）,悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。特点 1. 培养细胞可不断增殖，且生长速度快。2. 液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交换，细胞状态可以相
8、对保持一致。,细胞悬浮培养的建立,愈伤组织的诱导,悬浮系的建立与继代培养,悬浮细胞的生长动态,悬浮细胞同步化,愈伤组织的诱导,选择适宜的外植体：幼胚、下胚轴、子叶。 选择适宜的培养基：较高激素浓度；必要的附加物质。,要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎,悬浮系的建立与培养,callus,150250ml flask,centrifuge isolation,subculture,1g/10ml medium,100120 rmp culture transfer 1 time/3d,80 rpm,成功的悬浮细胞培养体系特征,悬浮培养分
9、散性良好，细胞团较小，一般在3050个细胞以下。 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。 细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般23天便可增加一倍。,悬浮细胞的生长动态,悬浮细胞生长的衡量,根据不同培养时间的细胞数变化，或细胞质量变化。 生长速率(p)：不同时间细胞密度(x)的自然对数与起始密度(x0)的自然对数之差与培养时间(t)的比值p(lnx-lnx0)/t 鲜重：真空减压过滤后称重，反应细胞生长情况 干重：鲜细胞烘干至衡重，反应细胞质量,影响悬浮细胞生长的因素,起始愈伤组织的质量 接种细胞密度：悬浮细胞的起始密度
10、一般在0.52.5105个细胞/毫升。接种初期的细胞密度过低往往使延迟期加长。最低有效密度：即能使细胞分裂、增殖的最低接种量。 培养条件：培养基、方式、温度、继代周期。,影响悬浮细胞生长的因素,培养基 应用条件培养基（生长过愈伤组织或悬浮细胞的液体培养基）提供单细胞生长和分裂所需的特殊代谢物。 基本培养基成分的调节视不同的培养目的而定 培养基设计时,一般均以诱导愈伤组织形成的培养基为基础进行调整。常用的培养基有MS、B5、LS 、N6等。 植物激素和其他附加成分的应用。,影响悬浮细胞生长的因素,培养方式：摇瓶，反应器（气动式、搅拌式）；分批培养，半连续培养和连续培养 温度 25 继代周期 指具
11、有一定起始密度的细胞,从开始培养到细胞数目和总重量增长停止的一个过程。 培养周期的长短是由起始细胞密度、延迟期的长短、生长速率等决定。 继代培养（Subculture）：继初代培养之后的连续数代的扩繁殖培养过程。,悬浮培养细胞的同步化,细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。 植物细胞在悬浮培养中容易团聚并进入不同程度的分化状态，因此，要达到完全同步化是十分困难的。 同一培养体系的植物细胞经常不能处于同一细胞周期，这种差异使悬浮细胞分裂、代谢以及生理生化状态等复杂化。 通过一定的理化措施可以使同一体系中的细胞达到相对同步化。 什么措施？,细胞周期,饥饿法,饥饿导
12、致的细胞分裂受阻常常是使细胞不能合成DNA，即不能进入S期，或细胞分裂不能进行，即不能进入M期。因此，通过饥饿法可以获得处于G1和G2期的同步化细胞。 氮饥饿时，通常获得G1期的同步化细胞 磷和碳饥饿时，获得G1和G2期的同步化细胞。 将饥饿细胞转入完整培养基中继代培养时，细胞分裂又可重新恢复。,抑制剂法,通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期(G1)的同步化细胞。 常用抑制剂主要有5-氟脱氧尿苷(FudR)和羟基尿(HU)。 用羟基尿处理获得同步化细胞的方法在小麦、玉米、西芹等植物细胞培养中已有成功应用。 利用破坏微管的药物将细胞
13、阻断在中期，常用的药物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性较小。,分选法,依据：细胞体积大小 方法 常规分选方法是梯度离心 精细的分选可采用流式细胞仪 优点 操作简单 分选细胞维持了自然生长状态，不会有其它处理带来的副作用 缺点 分选精细度较差,低温处理,可以提高培养体系中细胞同步化的程度 Okamura等曾采用此方法使胡萝卜悬浮细胞较好地同步化。 梅兴国等（2001）采用6低温处理红豆杉细胞也获得较明显同步化效果。 可能的原因 不同的温度对细胞的有丝分裂有极明显的影响，在一定范围内，温度下降使细胞分裂速度减慢，细胞周期延长，从而相应地延长了分裂期的时间，使分裂指数提高，细胞同步化率升高。,单细胞
14、培养,意义 分离方法 机械法 酶解法 培养方法 平板培养 看护培养 微室培养 双层滤纸培养,单细胞分离方法,机械法 具体做法： 将叶片轻轻研碎、过滤离心、收集净化 从未分化的疏松易碎的愈伤组织，通过摇床振荡获得分散的单细胞或小细胞团 优点： 细胞不受酶伤害； 有利于进行细胞的生理和生化研究。,单细胞分离方法,酶解法 酶对细胞壁有一定的软化作用，所以采用酶法时，必须加入甘露醇等渗透压保护剂；可通过加入硫酸葡聚糖钾来提高游离细胞的产量。 酶解法的优点 可获得较多的叶肉游离细胞（但对禾本科植物叶片效果不好）。,细胞平板培养（plating culture),指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养
15、基中进行培养的技术。Bergman(1960)首创 单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不能超过6个细胞。 单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为5103个/毫升 植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平铺于培养皿中，其厚度为5mm左右。,细胞平板培养（plating culture),平板培养的效果一般用植板率来衡量。植板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞总和中所占的比例。每个平板形成的细胞团数 植板率每个平板接种的细胞总数,细胞平板培养（plating culture),优点：单细胞在培养基中分布均匀，便于在显微
16、镜下对细胞进行定点观察，是单细胞株筛选和突变体筛选的常用方法。由于它具有筛选效率高、筛选量大、操作简便等优点，被广泛应用于细胞分裂、分化、生理生化、遗传变异、次生代谢产物合成等。 缺点：通气状况不好，排泄物质易积累造成毒害或影响组织吸收。,细胞悬浮,过滤,与培养基混合,植板,培养,克隆愈 伤组织,看护培养（nurse culture）,Muir(1953)首创此法获得烟草单细胞体系。 优点：简便易行，效果好。 缺点：不能在显微镜下追踪细胞分裂、生长过程。,微室培养(microchamber culture),在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方
17、法。由Jones等在1960年设计的。 优点：可对培养细胞连续进行显微观察，了解一个细胞的生长、分裂、分化等过程 缺点：培养基少，营养和水分难以保持，pH变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。 细胞起始密度：3080个/室。,双层滤纸植板培养,Horsch等（1980）建立,培养皿,培养基,饲养细胞层,培养细胞,看护滤纸,转移滤纸,固定化培养法,将细胞限制或定位于特定空间位置的培养技术称为细胞固定化培养。 固定化培养采用的固定化反应器有网状多孔板、尼龙网套和中空纤维膜等多种类型，将细胞固定于尼龙网套内，或固定于中空纤维反应器的膜表面，或固定于网状多孔板上，放入培养液中进行培养，或连续流入新鲜培养液
18、，进行连续培养及连续收集培养产物，也可通入净化空气以代替搅拌。,与悬浮培养相比，固定化培养的优点： 提高了药物的合成、积累； 能长时间保持细胞活力； 可以反复使用； 抗剪切能力强； 耐受有毒前体物质的浓度高； 遗传性状较稳定； 后处理难度小。,固定化植物细胞培养技术要进入工业化生产有许多问题尚待解决。 首先，固定化培养要求代谢产物必须是分泌到细胞外的。 第二，植物细胞药物的积累是不连续的，这也限制了固定化细胞方法的应用。 第三，易污染。,Flash,植物细胞规模化培养,规模化培养体系的建立 生 物 反 应 器 规模化培养的技术问题,植物细胞大规模培养的技术要求,从工程的角度讲必须要进一步研究和
19、开发适宜于植物生长和生产的生物反应器，建立最佳的控制和调节系统； 从培养技术方面讲必须满足以下三个条件： 培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物。 细胞生长速度快，短时间内能生产较多产物 产物不被迅速降解，最好能分泌到培养基中,植物细胞规模化培养体系的建立,种子细胞选择 种子细胞增殖与放大培养 大规模培养体系建立,种子细胞选择,外植体选择 植物类型：遗传基础。在确定生产某一种化合物以后，首先必须准确选择那些能够产生目的化合物的植物种类及品种或单株。 组织器官：由于天然产物一般为次生代谢产物，而植物次生代谢产物的积累具有组织器官的特异性，因此，在起始细胞培养时尽量选择自然状态下产生天
20、然产物的器官、组织作为外植体。,种子细胞选择,高产细胞系的筛选 悬浮细胞系单细胞克隆种细胞增殖,种子细胞增殖与放大培养,目的 准备材料 提供技术参数 过程 摇瓶 反应器,大规模培养体系的建立,培养方式 成批培养、连续培养和半连续培养。 培养方式的选择 根据次生产物积累而定，通常还根据不同要求进行改进。如当细胞生长和产物合成需要不同的培养基时，就需要采用两步法培养，先在细胞生长培养基中培养大批量细胞，当细胞生长至合成产物的阶段后，将其转至产物合成培养基中培养，在产物合成阶段又可采用连续培养方式以延长细胞生产时间。,生物反应器类型及特点,是指用于高等生物细胞批量化培养的装置及其相应控制系统。 适合
21、植物细胞培养的反应器应该具有适宜的氧传递、良好的流动性和较低的剪切力。 搅拌式 气动式 固定化式 其它光照生物反应器，转鼓式,植物细胞培养生物反应器,搅拌式反应器,是根据植物细胞特性在微生物发酵罐基础上改进而成。 搅拌装置要减少剪切，一般改叶轮式为螺旋式。 必须设计加液装置 必须设计通气装置 适宜的取样口,气动式反应器,又称空气提升式反应器 特点：剪切力小，但搅拌不很均匀。,Flash,固定化反应器,特点： 较容易地控制培养系统的理化环境，可以研究特定的代谢途径，便于调节。 细胞位置的固定使其所处环境类似于在植物体中所处的状态，相互间接触密切，可形成一定的理化梯度，有利于次生产物合成。 可以从
22、培养基中提取产物，免除了培养基中因初级代谢产物积累造成对代谢的反馈抑制，延长生产周期，进行连续生产。,固定化反应器,种类： 主要有流化床、膜反应器和填充反应器 植物细胞固定化一般采取凝胶包埋、膜固定、网格和泡沫固定和表面吸附等。 包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐和聚丙烯酰胺等 附着式固定化培养系统：支持物多采用尼龙网、聚氨酯泡沫和中空纤维等。,Alfermann等(1983)用气升式系统，采用海藻钙固定细胞成功地用30 L和200 L的反应器生产地高辛。 Jose等(1983)进一步用中空纤维反应器培养胡萝卜和碧东茄生产代谢产物酚类物质 Mavituna等（1987）使用
23、板式反应器和循环床反应器培养固定化辣椒细胞，最大辣椒素生产速率（以干辣椒细胞计）达到0.5mggd，与成熟期辣椒合成辣椒素的速率相当。,规模化培养中有关工程技术问题,悬浮培养系统必须适应植物细胞特性 细胞体积大。其平均直径比细菌大几十倍 通常以2200个细胞，直径2mm大小的非均匀小细胞团形式存在。 抗剪切能力弱。 生长速度慢，周期长，培养基成分复杂，有利于微生物生长，因此在培养中维持无菌环境难度较大但又十分重要。,规模化培养中有关工程技术问题,培养液的流变特性粘度变化 是由细胞密度和细胞状态变化造成的 烟草细胞培养，当细胞密度低于7g/L时，培养液粘度基本不变，而高于此值时，培养液粘度增加。
24、 长春花细胞培养密度在10g/L时，培养液粘度有赖于细胞年龄、形态和细胞团大小。 在相同物质浓度下, 大细胞团的营养液表观粘度明显大于小细胞团的表观粘度。,规模化培养中有关工程技术问题,氧气含量调节 KLa（氧的传递系数， Nv=Kla(C*-C) ）：如在4L的气升式反应器中进行长春花细胞培养时，KLa在20h-1左右时。细胞生长与次生产物合成维持在良好状态；在15L通风式反应器中培养的烟草细胞，当KLa在510h-1的范围内，生物量和代谢产物随KLa增加而增加。 溶氧浓度：毛地黄细胞培养，当培养基氧浓度从10饱和度上升至30，细胞生长速率从0.15d-1上升至0.20d-1，如果继续上升至
25、 40，细胞生长速率反而下降至0.17d-1。,规模化培养中有关工程技术问题,CO2调节 在通气过程中，混入24的CO2能消除高通气速率对长春花细胞生长和次生代谢产物合成的不利影响。,规模化培养中有关工程技术问题,泡沫和表面黏附性 植物细胞培养中易产生泡沫，且覆盖蛋白质和粘多糖，细胞极易被包埋在其中从循环的培养液中带出来，形成非均相培养而影响培养系统的稳定性和生产率。 消除方法 化学消泡：天然油脂、高级醇类、聚醚类 机械消泡,提高植物细胞药物产量的途径,选择适宜的起始材料种类、部位 栀子（Gardenia jasminoides）胚轴 银杏 子叶 当归 根 红豆杉 幼嫩的茎 茜草 叶柄,高产细
26、胞株的筛选,直接筛选法 红豆杉 紫杉醇 玫瑰茄 花色苷（比对照提高14.5倍） 诱变育种法 伊贝母紫外光 黄连 60Co （小檗碱含量达6.12%） 红豆杉 苯丙氨酸,高产细胞株选择,梅兴国（2001）通过在培养基中添加1.6mM的L-Phe，筛选出了抗Phe的红豆杉细胞悬浮系，其紫杉醇含量高于原型细胞35倍。,产生等于或高于亲本植物药物含量的植物细胞培养系统,优化培养基,选择合适培养基种类及植物生长调节剂 桅子 藏红花酸心脏病 B5，MG-5利于细胞生长 M-9利于黄色素合成 （钟青平等1994） 高山红景天红景天苷抗疲劳、抗缺氧 NAA; BA好于2,4-D; IAA; KT（韩爱明等19
27、97） 胡萝卜黄酮 GA3 抑制（Hindere et al.1984） 桔叶鸡眼藤 蒽醌 1mg/L NAA促； 1mg/L 2,4-D抑 （Linus等1995） 烟草 尼古丁 IAA促；2,4-D抑（Furuya1987）,不同植物激素对长春花细胞的悬浮培养物中生物碱产量的影响,优化培养基(调节碳源 ),增加碳源可促进次生代谢物质的积累 彩叶草细胞 迷迭香叶宁酸 化妆品 长春花细胞 阿马里新、利血平高血压 红豆杉细胞 紫杉醇 葡萄细胞 花青素血管的守护神,优化培养基(添加有机物 ),在红花（Carthamus linctorius）培养细胞中加入0.1水解酪蛋白，可使维生素E的产量提高约
28、5倍（Yamamoto et al，1989）。 10%椰乳，能明显促进滇紫草愈伤组织紫草素的产生，其紫草素的含量是对照的24倍(周立刚等1991)。紫草素肝胆疾病辅助用药 甘烦远等（1997）研究表明，云南红豆杉悬浮细胞适宜的培养基为B5，当添加椰子汁(CM)、酪蛋白氨基酸(CA)和水解乳蛋白(LH)3种有机物时，均能提高培养细胞中紫杉醇的含量，而且CM和CA还能促进细胞的生长。,调节pH值及光照,控制pH培养基将有利于药物的生成。 南方红豆杉愈伤 pH 5.5 对愈伤组织生长最为有利 pH 7.0 对紫杉醇积累最为有利 大槭树(APsendoplatanus)细胞 降低pH将有利于烟碱的释
29、放 光对于药物的积累具有重要的作用 玫瑰茄悬浮细胞花青素合成 蓝光促进；红光和橙光无效 长春花愈伤组织生物碱合成 蓝光促进；绿光抑制,调节矿质元素,氮和磷的作用 氮源 促进长春花细胞的生长 抑制长春花生物碱的合成 (Knobloch1982） 适当的NH4+NO3-比例有助于葡萄细胞花青素的积累 高浓度NH4+抑制云南红豆杉愈伤生长，但显著提高紫杉醇的含量。 （陈永勤等2000） 磷 促进长春花细胞生长 抑制吲哚生物碱合成 (周立刚等，1991）,其它元素 高浓度的Co2+和Fe2+有利于花青素的积累（杜金华等，1997） CaCl2和MgSO4，能明显提高萝芙木咖啡碱的含量 在紫草细胞培养中
30、，紫草素的含量明显受到Ca2+浓度的影响（Fujita et al. 1981） Cu2+可能对栀子黄色素的产生有促进作用，（钟青萍等，1994）,提高植物细胞药物产量的途径,前体（precursor）的应用 作用：提高目的产物产量。 选择 对某一目的产物来讲可能有多种前体物质 同一种前体物质又可能有多条代谢路径从而形成不同的代谢产物。 针对其合成的关键生化过程进行前体物质添加。 多数前体物质对细胞生长本身并不十分有力 注意前体浓度。过量也可能产生反馈抑制。,人参皂甙的生物合成途径乙酰辅酶A甲羟戊酸（MVA）反式角鲨烯（C30）2,3-氧化鲨烯 环阿屯醇 达玛烯二醇 香树素植物甾醇 人参皂甙R
31、g1 人参皂甙Ro,外源L-苯丙氨酸 槲皮素，玫瑰茄细胞花青苷产量提高1.3倍 异丁子香酚 提高番椒的香兰素、香草酸和阿魏酸的产量 苯丙氨酸、苯甲酸、丝氨酸和甘氨酸 能使东北红豆杉中紫杉醇含量高出l4倍 亮氨酸或BaccataIII 能提高紫杉醇的含量(30%-100%) 苯丙氨酸、肉桂酸和乙酸钠，在水母雪莲细胞培养中，在培养6d时，细胞进入快速生长期，此时加入前体物质有利于细胞的生长和黄酮合成。肉桂酸可提高约1倍。,提高植物细胞药物产量的途径,激发子（elicitor）的应用 也称诱导子，是指能够诱导植物细胞中某些反应，并形成细胞特征性自身反应的分子。 非生物激发子，如辐射、金属离子、茉莉酸
32、类似物（茉莉酸甲酯，M-JA）等。 生物激发子 外源激发子：菌丝、微生物机体提取物及微生物产生的多糖、蛋白和脂肪酸等 内源性激发子：来源于植物结构的化合物。如降解细胞壁的酶、细胞壁碎片、寡聚糖等有机分子。,生物激发子 蜜环菌发酵液在延胡索植物细胞培养中显著促进了原鸦片碱的合成 在丹参毛状根细胞培养中发现，加入蜜环菌发酵液培养34d后，细胞丹参酮的含量可提高至接近活体植物细胞的水平。 寡糖素有利于人参和西洋参的细胞生长和皂甙的积累 酵母提取物促进生物碱、黄酮类合成 在长春花、葛和茶等多种植物细胞培养中已成功应用,提高植物细胞药物产量的途径,提高植物细胞药物产量的途径,非生物激发子 激发子对南方红
33、豆杉细胞培养合成紫杉醇的影响,M-JA Mg/L,0.0,0.1,10.0,1.0,提高植物细胞药物产量的途径,抑制剂的使用 双氯苯咪唑和氯化胆碱固醇生物合成抑制剂 可使青蒿素合成量明显提高。 可达到与黄花蒿叶中所含的青蒿素处于同一个数量级 嘧啶醇甾体合成代谢抑制剂 可提高云南红豆杉紫杉醇的含量 矮壮素（CCC）赤霉素的生物合成抑制剂 质量浓度为 5.0 mgL的 CCC可使紫杉醇含量提高60以上。,提高植物细胞药物产量的途径,培养技术的选择 包括反应器的选择和培养方式的选择 培养技术的选择不仅要考虑细胞生长和产物积累的效率，同时还应考虑技术基础和生产成本。,提高植物细胞药物产量的途径,两相培
34、养 指在植物细胞培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机化合物，或者是具有吸附作用的多聚化合物，使培养体系由于分配系数不同而形成上、下两相，细胞在其中一相中生长并合成次生代谢物，这些次生代谢物又通过主动或被动运输的方式释放到胞外，并被另一相所吸附。,提高植物细胞药物产量的途径,两相培养 组成：培养相和提取相组成 类型：液-液系统和液-固系统 液-液系统：分离相主要使用液体石蜡、烷类化合物。分离相和培养基的化学性质和比重不同。 液-固系统：是指提取相以固态形式存在于系统中，主要通过吸附分离目的产物，目前使用的主要有活性炭、硅酸镁载体、沸石、蚕丝以及树脂。,红豆杉细胞两相培养生产紫杉醇,实验材料：东北红
35、豆杉细胞系 培养基： 第一相：B5培养基， 第二相：5(v/v)的松油醇， 产物释放剂：5(v/v)二甲基亚砜。 接种量:10g (鲜重)/100ml培养基/250mL 三角烧瓶。 培养条件：25，120rpm，黑暗培养。,细胞干重；紫杉醇产量；两相系统 ；单相系统,第二相的加入，使得紫杉醇产量提高到30.19mg/L，比对照增加103%；63的紫杉醇从胞内的释放出来，其中有75转移至有机相。,提高植物细胞药物产量的途径,两步培养 在生长培养基中培养细胞 在生产培养基中积累产物,提高植物细胞药物产量的途径,器官组织的培养 培养材料的分化程度，常常影响到药物的含量。如在条叶龙胆愈伤组织中，龙胆着
36、含量较低，而根的分化可以提高龙胆苦苷的含量 发状根（毛状根，hairy root）培养生产次生产物，已在人参、丹参、紫草、颠茄和黄芪等植物中进行了探索性研究，并取得良好进展。 体细胞胚规模化培养用于次生产物的生产在少数植物中开展了研究。,毛状根,毛状根(hairy roots)是发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）感染双子叶植物后，其Ri质粒上的T-DNA片断整合进植物细胞核基因组中诱导产生的一种特殊表现型。 毛状根可以不依赖激素快速生长，根多丛生，多分枝，多根毛，无向地性。,1934年，Hildebrand 报道了发根农杆菌感染苹果树产生发根,生物反应器培养青蒿毛状
37、根生产青蒿素,青蒿：为双子叶植物药菊科植物 青蒿素：,倍半萜内酯类化合物 功效：治疗疟疾,1.Bioreactor, 2.Concentric draught cylinder, 3.Stainless stell mesh, 4.Air outlet, 5.Timer, 6.Mist nozzle, 7.Medium, 8.Air inlet, 9.Air filter, 10.Flowmeter, 11. Holes on draught cylinder, 12.Electromagnetic valve, 13.Air storage tank, 14.Nebulizing devic
38、e, 15. 40W fluorescent lamp,生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素,Growth feature of Artemisia annua adventitious shoot in the mist bioreactor (a) 0 d ; (b) 10 d ;,10cm,30cm,生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素,实验材料 青蒿毛状根：由发根农杆菌R1601诱导青蒿叶片产生 培养方法及条件 1. 固体培养 2030 mm青蒿毛状根根尖 MS固体培养基(添加30 g/L蔗糖) 继代时同为15d,生物反应器培养青蒿毛状根生产青蒿素,培养方法及条件2. 液体振荡培养（三角瓶
39、） 接种量：每L培养液（MS）5 g 毛状根培养物（分支多且细长的毛状根） 120-130 rpm，251 ，12 hd光照 液体培养的继代时间为10 d。 3. 反应器培养 12 hd培养，25I 。 雾化间隔30 min，雾化2min。 通气量为0.5 Lmin，通气时间为15 mln。,最大生物量10.3g/L，青蒿素产量达到179.1mg/L，青蒿素的含量为1.74。,植物细胞培养作为工业化和商业化生产药物条件尚不成熟 需：,（1）深入掌握植物细胞复杂的调控机制，从而在反应器的大环境内调控细胞培养过程中的微环境，使其朝着有利细胞生长的方向发展。 （2）把生物学知识和工程技术（包括生化工
40、程、控制工程和机械工程等）领域的知识两方面紧密配合，提高反应器的空间利用率及细胞培养过程中的自动化程度。 （3）从生命科学和植物细胞的本质上思考和进行植物细胞反应器的研究，在用于植物细胞培养的生物反应器的研制工作中取得根本的突破。,小结,细胞规模化培养有可能成为新型生化工业的重要途径，细胞悬浮培养是细胞规模化培养的基础。 各种单细胞培养技术是细胞克隆的基础技术，也适用于植物花粉培养和原生质体培养。 高等生物细胞规模化培养体系的建立必须于生物反应器的研制相匹配。 根据目的产物建立包括培养基、种细胞、培养方式等在内的一系列配套技术是商业化的前体。,思考题,1一个好的悬浮细胞系有哪些特征？用于建立悬
41、浮细胞系的愈伤组织有何要求？ 2建立悬浮细胞系的关键技术有哪些？ 3悬浮细胞系在继代培养中其群体生长规律 4细胞大规模培养有哪些培养系统？ 5植物细胞规模培养与次生产物生产前景及需要研究解决的问题。,例1. 培养水母雪莲细胞产生黄酮类化合物,材料： 水母雪莲愈伤组织红色系细胞系 培养基： MS培养基，附加0.5mgL 6BA、2mgL NAA、30gL蔗糖、10gL葡萄糖，pH5.8。 种子培养： 愈伤组织在 500ml三角瓶中（装瓶量 150ml）培养一段时间，作为生物反应器的接种液（种子）。培养期间采用日光灯连续照射，培养温度为25，摇床转速 100rmin。,细胞大量培养,反应器：2L
42、机械搅拌式，工作体积 l.4L 。 通气：空气由空气泵通过转子流量计经由空气过滤器进入反应器。 灭菌：操作前反应器在121 下高压灭菌35 min，培养基在121 单独灭菌18 min。 接种：待反应器冷却至室温，种子和培养液由顶部接口倾倒入反应器内。 培养条件：设置好通气速率和搅拌转速，温度自动控制在（252）。在反应器外用荧光灯和白炽灯照明。,重要的影响因子及相关参数,1搅拌速度 不同搅拌转速下细胞生长和黄酮产量的比较,2接种量（以干细胞计）,在低密度(l.5g/L)培养时细胞增长几乎停止 在4-5 g /L，黄酮产量随密度增大明显增加 大于 6gL，细胞出现褐化死亡，黄酮产量出现下降。
43、反应器内细胞的最适接种量高于摇瓶的最适接种量（摇瓶一般为2.54.0g干重/L)。,3. 细胞生长和黄酮生物合成动态变化过程,水母雪莲在培养期间，搅拌转速和通气量分别维持在 75rpm和 7001000 Lmin。细胞经过4d的延迟期后，第49d为对数生长期，12d时细胞生长达到高峰，最大细胞浓度（以干重计）达到 13.8 gL，随后进入静止期，黄酮在细胞中的积累与细胞生长基本平行，可见，黄酮积累与细胞生长正相关，这与紫草宁的生物合成发生在细胞生长的静止期不同（董教望等，1993）。在反应器培养中，黄酮产量在培养的第 12 d达到最高，为416 mgL。,4 糖利用动态变化过程,在培养的当天，
44、初始蔗糖浓度有所降低，这是因为小部分初始蔗糖经过高温灭菌能分解为葡萄糖和果糖。培养开始后蔗糖浓度迅速下降，到第 3 d只有约 5 gL，第 5 d后培养基中已检测不到蔗糖，葡萄糖在3d后才得到快速利用。培养基中蔗糖浓度的迅速降低在许多植物中被观测到，如白莲草（Thalictrm rugosum）（Kim，1991）。Enaksha根据对红豆杉细胞培养的研究认为，细胞在其表面分泌或含有过多的转化酶（invertase），导致蔗糖分解产生了大量的单糖。,5 聚集体分布,反应器内聚集体分布随培养进程而发生变化 1-2mm的聚集体含量在培养后期明显增加，而2-3mm的聚集体含量却相应减少。 细胞聚集体
45、分布集中在较小尺寸 通过比较12 d时摇瓶和反应器细胞聚集体分布发现，摇瓶中 1-2mm的聚集体含量低于反应器，其他部分则高于反应器。 聚集体大小与黄酮合成密切相关，2-3mm和3-4mm的聚集体中黄酮含量较其他部分高。,例2. 植物细胞悬浮培养生产小蘗碱,1材料 小蘗的愈伤组织细胞 2. 培养基B5，MS培养基 3培养过程培养条件：转速为250r/min, 温度25。培养一段时间细胞浓度增加后，进行继代培养。,培养基影响 小蘗的愈伤组织细胞在B5培养基中的生长要好于MS培养基。 激素的影响 生长激素对细胞生长的作用效果顺序为2,4-DIAANAA 对小蘗碱合成的影响顺序则是NAA2,4-DIAA KT对于细胞生长和小蘗碱合成的作用均优于BA,影响因素分析,影响因素分析,碳源影响 蔗糖对小蘗碱合成具有促进作用，最佳浓度为3 果糖和葡萄糖虽能促进细胞生长，但是对于小蘗碱的合成有抑制作用 氮源影响 提高培养基中铵离子的浓度有利于原小蘗碱型生物碱的产生,提高铜离子的浓度也能显著促进小蘗碱的合成 物理因子也会对细胞生长和小蘗碱的合成产生影响。 如光照会抑制小蘗碱的生成 较高的通气量有助于细胞生长和小蘗碱的积累,影响因素分析,
