1、玛咖提取物对运动耐力和脊神经元线粒体超微结构的影响 俞发荣 杨博 李作平 连秀珍 谢明仁 李登楼 张诗爽 甘肃政法学院甘肃省证据科学技术研究与应用重点实验室 甘肃政法学院体育教学部 摘 要： 目的:探索玛咖提取物对运动耐力和脊神经元线粒体超微结构的影响。方法:50只 Wistar 大鼠随机分为 5 组。对照组:不进行游泳, 灌胃等量蒸馏水;单纯游泳组:游泳, 灌胃等量蒸馏水, 玛咖提取物组 (设 4.0, 5.3, 8.0 g/kg 3 个剂量组) :游泳, 给予相应剂量的玛咖提取物。游泳大鼠在游泳池内循环水流自由游泳, 连续游泳并给药 15 d, 第 16 天游泳耐力测试后无痛处死大鼠, 用
2、投射电子显微镜观察脊髓神经元线粒体超微结构, 放免法测定肌肉肌糖元、检测肌肉中丙二醛 (MDA) 、超氧化物歧化酶 (SOD) 、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 和游离钙水平。结果:与单纯游泳组比, 沉下前游泳时间和游泳总时间分别延长了 (%) 19.83、60.28、77.55 和 55.34、73.91、94.47, 差异均有统计学意义 (P 均0.01) ;沉下次数分别减少了 (%) 34.35、51.18、57.96, 差异有统计学意义 (P0.01) ;MDA 和游离钙含量分别降低了 (%) 20.10、31.49、38.72, 差异有统计学意义 (P0.01) 和 6.42、
3、17.58、26.35;SOD、GSH-Px 和肌糖原含量分别升高了 (%) 5.12、22.74、52.53、44.22、77.79、98.45, 差异有统计学意义 (P0.01) 和 35.08、47.83、81.88, 差异有统计学意义 (P0.01) ;脊神经元线粒体的体密度 (Vd) 、面密度 (Sd) 和数密度 (Nd) 分别减小了 (%) 7.79、18.18、31.17, 16.95、27.34、43.31 和 13.51、23.19、43.15。结论:玛咖提取物具有保护脊髓神经元线粒体结构、抗氧化、增加肌糖原和提高运动能力等作用。关键词： 玛咖提取物; 运动耐力; 线粒体;
4、Wistar 大鼠; 作者简介：李作平 Tel:18189651683;E-mail:收稿日期：2016-07-28基金：甘肃省基础研究创新群体项目 (145RJIA333) Effects of the maca extract on the ultrastructures of mitochondria in the spinal nerve cell and exercise enduranceYU Fa-rong YANG Bo LI Zuo-ping LIAN Xiu-zhen XIE Ming-ren LI Deng-lou ZHANG Shi-shuang Key Laborat
5、ory of Evidence of Science and Technology Research and Application, Gansu Institute of Political Science and Law; Department of Physical Education, Gansu Institute of Political Science and Law; Abstract： Objective: To investigate the effects of maca extract on the ultrastructures of mitochondria in
6、the spinal nerve cell and exercise endurance. Methods: The Wistar rats were randomly divided into 5 groups, including the control group ( no swimming) , the swimming group ( free swimming) , and 3 treatment groups treated with the maca extract at the doses of 4. 0, 5. 3 and 8. 0 g/kg body weight. Th
7、e animals in swimming and treatment groups were then for free swimming in the circulating water flow daily for 15 days. On the 16 thday after swimming endurance, the spinal and muscular tissues were collected from all groups. The mitochondrial ultrastructures of the neurons of the spinal cells were
8、observed with the projection electron microscope, and the levels of the glycogen, malondialdehyde ( MDA) , superoxide dismutase ( SOD) , glutathione peroxidase ( GSH-Px) , and Ca2+ in muscle tissues were determined by the RIA method. Results: When rats were treated with maca extract ( at 4. 0, 5. 3,
9、 8. 0 g/kg body weight) , the total swimming time and the swimming duration before sinking were increased by 19. 83%, 60. 28%, 77. 55%, and 55. 34%, 73. 91%, 94. 47%, respectively, compared with the simple swimming group ( P 0. 01) , while the sinking times were decreased by 34. 35%, 51. 18% and 57.
10、96%, compared with those of the swimming group. Also, the levels of SOD, GSH-Px, and muscle glycogen in three treatment groups were enhanced by 5. 12%, 22. 74%, 52. 53%, 44. 22%, 77. 79%, 98. 45% ( P 0. 01) , and 35. 08%, 47. 83%, 81. 88% ( P 0. 01) respectively over the swimming rats without treatm
11、ent, but the MDA content and the Ca2 +levels were reduced by 20. 10%, 31.49% 38. 72%, and 6. 42%, 17. 58%, 26. 35%, compared with the simple swimming group ( P 0. 01) . In addition, compared to the swimming group, the mitochondrial densities of volume ( Vd) , surface ( Sd) and numbers ( Nd) of spina
12、l nerve cells in rats treated with maca extract ( 4. 0, 5. 3, 8. 0 g/kg body weight) were reduced by 7. 79%, 18. 18%, 31. 17%, 16. 95%, 27. 34%, 43. 31%and 13. 51%, 23. 19%, 43. 15%, respectively. Conclusion: Our results demonstrated the protective effects of maca extract on the mitochondria of spin
13、al cell and suggested that maca extract could improve the muscle antioxidant activity by increasing the levels of SOD, GSH-Px, and muscle glycogen.Keyword： maca extract; movement endurance; mitochondria; Wistar rats; Received： 2016-07-28玛咖 (Maca) , 十字花科 (Brassicaceae) 独行菜属 (Lepidium) 植物, 是一种药食两用植物资源
14、, 营养成份丰富, 有“南美人参”之誉。在中、南美洲国家、如厄瓜多尔、秘鲁、墨西哥等国玛咖作为民间药物用于增强精力、提高生育力、缓解更年期综合症、抑郁症、哮喘症和促进伤口愈合等。在美国、欧洲、日本、台湾、澳大利亚等国际科学研究者也加快了对玛咖化学成分、药效药理研究的步伐, 每年都在不断揭开产生玛咖神奇功效的神秘面纱, 这就给玛咖具有独特药效的医药产品的开发奠定了坚实的基础。为了探索玛咖抗疲劳、增加运动能力的机制, 本文以 Wistar 大鼠为实验对象, 给予玛咖提取物结合游泳, 观察玛咖提取物对大鼠游泳时间、抗氧化作用、脊神经元超微结构的影响, 为研究运动疲劳机制和玛咖的开发利用积累资料。1
15、材料与方法1.1 材料玛咖提取物:称取云南玉龙雪山产的玛咖块根 500 g, 加水 1500 ml, 得煎液900 ml, 再隔水加热浓缩为 200 ml (含生药 2.5 g/ml) , 实验时用蒸馏水稀释成所需浓度。实验动物及实验环境:SPF 级 Wistar 大鼠 (雄性) , 体重 180 g190 g, 购于甘肃省中医学院科研实验中心, 实验动物生产许可证号:SCXK (甘) 2011-0001。全部实验均在甘肃省证据科学技术研究与应用重点实验室 SPF 级动物实验室完成, 实验动物使用许可证号:SYXK (甘) 2015-0006。试剂:MDA、SOD、GSH-Px、Free Ca
16、 试剂盒购于南京建成生物工程研究所 (批号20150306) , 肌糖原检测试剂盒购于江苏晶美生物科技有限公司 (20150507) 。仪器:酶联免疫检测仪, 购于上海雷勃分析仪器有限公司 (MULTISKAN MK3) ;ZHJH-C1112B 型双人单面百级超净工作台, 上海智城分析仪器制造有限公司。TEM-1200EX/s 型投射电子显微镜, 日本, JEOL 公司。1.2 动物分组50 只 Wistar 大鼠 (雄性) 采用抓阄法随机分组。对照组 (C) :10 只, 正常饲养, 不进行游泳, 灌胃 (ig) 等量蒸馏水;单纯游泳组 (s) :10 只, 游泳, ig等量蒸馏水;玛咖提
17、取物组:30 只按玛咖最大耐受量 (320g/kg 体重) 的1/40、1/60、1/80 给药量分为低剂量组 (ML) 10 只、中剂量组 (MM) 10 只、高剂量组 (MH) 10 只:游泳, 分别 ig 玛咖提取物 4.0、5.3、8.0 g/kg 体重。每天 1 次, 连续 15 d。1.3 游泳训练实验游泳组动物每天游泳 1 次, 游泳水速 0.8 m/s, 水温 2224。首次游泳 30 min, 每天递增 5 min, 连续游泳 15 d。1.4 游泳耐力测试实验第 16 天, 进行游泳耐力测试。为了缩短测试时间, 每只大鼠尾部负重 10 g 砝码进行游泳, 以动物沉入水下停留
18、 10 s 为止。1.5 肌肉 MDA、SOD、GSH-Px 测定实验第 16 天, 乙醚吸入无痛死亡, 剥取左右后肢股四头肌, 置于冰冷生理盐水中洗净血液, 用滤纸吸干, 置于 EP 管内, 放于-80低温冰箱内冷藏, 备用。称取肌肉 120 mg, 放入盛有冰冷生理盐水的烧杯内, 用眼科剪碎肌肉组织, 倒入玻璃匀浆管中, 充分研碎, 使组织匀浆化, 将匀浆放入低温低速离心机 2 000 r/min, 离心 15 min。将离心好的匀浆取上清液于 Eppendorf 管中, 以丙二醛 (MDA) 含量作为 LPO 水平指标。分别按 MDA、SOD、GSH-Px 试剂盒操作说明测定其含量。1.
19、6 肌糖原测定取肌肉 120 mg, 剪碎肌肉组织, 加缓冲液 (210mmol/L 蔗糖, 2 mmol/L EGTA, 40 mmol/L Na Cl, 30mmol/L hpes, p H 7.4, 蛋白酶抑制剂) 3 ml, 置试管内冰水浴中, 用玻璃匀浆器制成匀浆, 3 000 r/min 离心 5 min, 取上清液 1 ml加入试管中, 放于-80低温冰箱内冷藏, 备用。按肌糖原试剂盒操作说明测定其含量。1.7 脊神经元线粒体超微结构测定剥取大鼠脊髓腰膨大段放入含 4%多聚甲醛-1.25%戊二醛 0.1 mol/L 磷酸缓冲液 (p H 7.4) 固定液固定 24 h, 切片,
20、经锇化, 梯度酒精脱水, Epon812 平板包埋, 超薄切片, 经醋酸铀-枸橼酸铅双重染色, TEM-1200EX/s 型透射电镜观察照相。采用 Weibel 点计数法, 计算脊髓运动神经元线粒体的体密度 (volume density, Vd) :注:体密度 (Vd) , 是单位细胞质内线粒体所占的体积;pxi 为第 i 张照片中待测线粒体内的测试点数;pri 为 i 张照片中参照系的测试点数。数密度 (numeral density, Nd) :注:数密度 (Nd) , 是单位胞质体积中线粒体的数目;K 为大小分布系数;N A是线粒体截面数目和细胞质截面面积的比值。面密度 (superf
21、icial density, Sd) :注:面密度 (Sd) , 是单位胞质体积中线粒体外膜面积的数量;Ix 是线粒体外膜截线与测试线的交点数 Pr 是参照系平面内的测试点数 Z 是测试格中一个测试点所代表的测试线长。1.8 统计学处理实验数据用均数标准差 (s) 表示, 采用 SPSS 17.0 软件进行统计学处理。玛咖提取物对游泳大鼠生理指标的影响用单因素方差分析 (one way, ANOVA) 。2 结果2.1 玛咖提取物对大鼠游泳时间的影响游泳耐力实验结果表明, 分别 ig 玛咖提取物 4.0、5.3、8.0 g/kg 体重, 沉下前游泳时间比单纯游泳组分别延长了 19.83%、60
22、.28%、77.55%, 游泳总时间分别延长了 55.34%、73.91%、94.47%, 随给药剂量的增加而延长;沉下次数比单纯游泳组分别减少了 34.35%、51.18%、57.96%, 随给药剂量的增加而减少;差异均有统计学意义 (P 均0.01, 表 1) 。Tab.1 Effects of the maca extract on swimming time of rats (s, n=10) 下载原表 2.2 玛咖提取物对游泳大鼠肌肉 MDA、SOD、GSH-Px、游离钙和肌糖原水平的影响分别 ig 玛咖提取物 4.0、5.3、8.0 g/kg 体重, 游泳耐力检测, 大鼠肌肉 MD
23、A含量比单纯游泳组分别降低了 20.10%、31.49%、38.72%, 游离钙分别降低了6.42%、17.58%、26.35%;随给药剂量的增加而降低;大鼠肌肉 SOD 含量分别升高了 5.12%, 22.74%、52.53%;GSH-px 分别升高了 44.22%, 77.79%、98.45%, 肌糖原分别升高了 35.08%、47.83%、81.88%, 随给药剂量的增加而升高;差异均有统计学意义 (P 均0.01, 表 2) 。Tab.2 Effects of maca extract on the levels of muscle MDA, SOD, GSH-Px, Caand mu
24、scle glycogen in swimming rat (s, n=10) 下载原表 2.3 玛咖提取物对大鼠脊神经元线粒体超微结构的影响分别 ig 玛咖提取物 4.0、5.3、8.0 g/kg 体重, 游泳耐力检测, 大鼠脊神经元线粒体的体密度 (Vd) 比单纯游泳组分别减小了 7.79%、18.18%、31.17%, 面密度 (Sd) 分别减小了 16.95%、27.34%、43.31%, 数密度 (Nd) 分别减小了13.51%、23.19%、43.15%, 随给药剂量的增加而减小;游泳组大鼠脊神经元线粒体的各项参数均大于对照组;差异均有统计学意义 (P 均0.01, 表 3) 。3
25、 讨论适量的体育运动对人们的身心健康是有益的1, 耐力训练能使机体抗氧化酶和线粒体产生适应性变化2, 降低心肌凋亡水平3, 增强主动脉血管抗炎能力, 从而发挥抗疲劳的作用4, 缓减衰老骨骼肌的氧化应激5。过度运动将引起心脏生物电改变6, 诱发心肌损伤7, 引起肌肉运动能力下降, 导致运动性疲劳。近年来, 研究人员从不同的角度对运动性疲劳进行了大量的实验研究, 提出运动应激性代谢产物是运动性疲劳发生的根本原因之一8。如脂质过氧化 (LPO) 水平增高使代谢产物丙二醛 (MDA) 9和 Ca2+10的堆积, 超氧化物歧化酶 (SOD) 和谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 活性下降, 能源物质减
26、少11, 神经系统12、心血管系统13功能的改变, 导致运动肌肉收缩和舒张功能障碍、运动能力下降, 即发生疲劳。为了寻求抗疲劳药物, 将参杞制剂14或杜仲多糖15给予游泳小鼠, 均能明显提高肝糖原、肝脏 SOD 和 GSH-Px 含量, 延长小鼠力竭游泳时间, 并具有较强的抗疲劳与抗氧化作用。张静等16将玛咖粉给予训练小鼠, 显著缓解了疲劳, 延长了小鼠爬杆的时间 (P0.01) 和力竭游泳时间 (P0.01) 17。本文实验结果发现, 力竭运动, 使骨骼肌细胞脂质过氧化 (LPO) 水平增高, LPO 不仅调节 Ca-ATP 酶产生影响, 造成细胞浆中 Ca的堆积, 影响骨骼肌纤维的兴奋收缩
27、偶联;骨骼肌 MDA 含量升高, 使 SOD、GSH-Px 活性降低, 脊神经元线粒体超微结构发生变化甚至损伤, 影响线粒体呼吸链ATP 的释放, 导致骨骼肌肉的工作能力下降而产生疲劳。给予玛咖提取物游泳组大鼠骨骼肌 MDA 和游离钙明显降低, 骨骼肌糖原含量、SOD 和 GSH-Px 活性明显升高, 大鼠脊神经元线粒体参数明显改善, 运动耐力显著增强。实验结果提示, 玛咖提取物能降低骨骼肌 MDA 的生成, 提高骨骼肌 SOD、GSH-Px 活性, 保护脊神经元线粒体结构和增强运动能力的作用。实验结果为进一步研究探索运动疲劳机制提供了参考依据。Tab.3 Effects of maca ex
28、tract on mitochondrial ultrastructure of rat spinal nerve cells (s, n=10) 下载原表 参考文献1郭峰.长期练习太极拳对老年人自主神经系统调节功能的影响J.中国应用生理学杂志, 2015, 31 (2) :158-163. 2刘绍东, 张彦秋, 曹江.有氧耐力训练对大鼠骨骼肌线粒体功能及 PI3K-Akt蛋白的表达影响J.中国应用生理学杂志, 2016, 32 (1) :55-58. 3赵永才.运动训练对小鼠心肌线粒体 miR-499-Ca NDrp-1 凋亡通路的影响J.中国应用生理学杂志, 2015, 31 (3) :2
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