1、海洋来源真菌 Penicillium pinophilum次级代谢产物中 Azaphilones 类化合物的分离及抗菌活性 马洋洋 蔡卉 杜敏 曹飞 朱华结 药物化学与分子诊断教育部重点实验室河北省药物质量分析控制重点实验室河北大学药学院 摘 要： 采用硅胶、十八烷基硅烷键合硅胶填料 (ODS) 和 Sephadex LH-20 凝胶柱层析等手段从一株渤海来源真菌 Penicillium pinophilum 次级代谢产物中分离得到3 个 Azaphilones 类化合物:Pinophilin G (1) , Pinophilin B (2) 和 Sch 725680 (3) , 其中, 化合
2、物 1 为新化合物.通过核磁共振波谱 (1H NMR, 13C NMR) 、长程异核位移相关谱 (HMBC) 、NOSEY 谱、异核位移相关谱 (HSQC) 和高分辨电喷雾质谱 (HR-ESI-MS) 确定了化合物 1 的平面结构和相对构型.通过比较实际电子圆二色谱 (ECD) 和量子化学计算方法计算的 ECD 光谱确定了化合物 1 的绝对构型.活性测试结果表明, 化合物 1 和 3 均显示出不同程度的抗菌活性.关键词： 海洋真菌; Penicillium pinophilum; Azaphilone 类化合物; 绝对构型; 抗菌活性; 作者简介：曹飞, 男, 博士, 副教授, 主要从事海洋天
3、然药物研究.E-mail:作者简介：朱华结, 男, 博士, 教授, 主要从事手性药物化学研究.E-mail:收稿日期：2017-05-11基金：国家自然科学基金 (批准号:41606174) Fractionation of Azaphilones from Secondary Metabolites of Marine-Derived Fungus Penicillim pinophilum and Their Antibacterial ActivityMA Yangyang CAI Hui DU Min CAO Fei ZHU Huajie Key Laboratory of Medic
4、inal Chemistry and Molecular Diagnosis of Ministry Education, Key Laboratory of Pharmaceutical Quality Control of Hebei Province, College of Pharmaceutical Sciences, Hebei University; Abstract： Bioassay-guide fractionation of the marine-derived fungus Penicillim pinophilum led to the isolation of th
5、ree azaphilones derivatives: Pinophilins G (1) , Pinophilins B (2) and Sch 725680 (3) , which were separated by silica gel column chromatography, octadecylsilyl (ODS) column chromatography, Sephadex LH-20. Compound 1 is a new compound. The plane structure of compound 1 was determined based on HR-ESI
6、MS, 1H NMR, 13C NMR, heteronuclear multiple bond correlation (HMBC) , nuclear overhauser effect spectroscopy (NOSEY) and heteronuclear singular quantum correlation (HSQC) . The absolute configuration of compound 1 was determined by comparing its experimental electronic circular dichroism (ECD) with
7、the calculated ECD spectra using quantum methods. The results indicated that compounds 1 and 3 showed antibacterial activities against four spices of pathogenic bacteria.Keyword： Marine-derived fungus; Penicillium pinophilum; Azaphilone derivative; Absolute configuration; Antibacterial activity; Rec
8、eived： 2017-05-11海洋来源真菌微生物因具有不受资源限制的特点, 已成为寻找现代药物先导化合物的重要来源1,2, 大量结构新颖、活性多样的次级代谢产物已被报道.其中, Azaphilones 类化合物是一类结构多样、生物活性显著的海洋真菌来源次级代谢产物.Gao 等6从中国南海沉积物来源真菌 Penicillim commune 发酵物中分离获得 6 个结构新颖的 Azaphilones 类化合物 Comazaphilones AF, 均具有较强的抗菌活性和细胞毒活性.Liu 等7从红树来源真菌中筛选出 3 个对-葡萄糖苷酶具有抑制活性的 Azaphilones 类化合物 Pin
9、azaphilones A, B和 Sch 1385568, 并通过旋光值 (OR) 和电子圆二色谱 (ECD) 的方法对其绝对构型进行了确定.本课题组8,9围绕海洋来源真菌活性次级代谢产物进行了研究, 获得了具有重要生物活性的系列 Azaphilones 化合物.本文从一株海洋真菌 Penicillium pinophilum 次级代谢产物中筛选出 1 个新的 Azaphilones 类化合物Pinophilin G (1) 和 2 个结构类似物Pinophilin B (2) , Sch 725680 (3) .生物活性测试结果表明, 化合物 1 和 3 均显示出不同程度的抗菌活性.1 实
10、验部分1.1 试剂与仪器色谱甲醇 (天津市科密欧化学试剂有限公司) .其它试剂均为分析纯.菌株来自渤海海底沉淀物中筛选出的一株真菌, 经 ITS 序列测序, 比对 NCBI 鉴定为 Penicillium pinophilum, 详见物种参考表, 菌株编号为:YMY-4 (表 S1, 见本文支持信息) , NCBI 基因 Bank 号为:KY979508.MOS450-SFM300 电子圆二色谱仪 (法国 Bio-logic 公司) ;AA-55 系列全自动旋光仪 (英国 Optical Activity 公司) ;Micromass Q-TOF ESI-MS 质谱仪 (美国Waters 公司
11、) ;Bruker Avance600 MHz 核磁共振波谱仪 (TMS 为内标, 德国Bruker 公司) ;紫外分光光度计 (北京恒通瑞利公司) ;Bruker Apex-Ultra7.0 T 质谱仪 (德国 Bruker 公司) ;LC-20A 循环半制备色谱仪 (日本岛津公司) ;C18反相填料 (日本 YMC 公司) ;凝胶 Sephadex LH-20 (美国 Pharmacia 公司) ;GF254 薄层色谱用硅胶 (烟台化学工业研究所) .1.2 实验过程1.2.1 真菌培养将大米 (100.0 g/瓶) 和高盐培养基 (120 m L/瓶) 配方:KH 2PO4 (1.0 g
12、/L) 、Mg SO 4 (1.0 g/L) 、蔗糖 (2.0 g/L) 、蛋白胨 (1.0 g/L) 及海盐 (33.0 g/L) 混合, 用蒸馏水定容至 1 L, 调节 p H=7.5.共发酵 6 瓶, 于 28120 r/min 摇床, 恒温培养 27 d.1.2.2 提取和分离发酵产物用 V (二氯甲烷) V (甲醇) =11 进行超声提取, 提取液通过旋转蒸发进行浓缩, 得到浓缩液 0.7 L, 然后用等体积的乙酸乙酯进行多次萃取, 直至浓缩液无色, 浓缩得浸膏 5.0 g.所得浸膏经硅胶柱层析, 以 V (二氯甲烷) V (甲醇) =10011100 的比例为流动相, 依次进行洗脱
13、, 共得 5 个组分 (Fr.1Fr.5) .Fr.3 组分通过 Sephadex-LH-20 (甲醇) , ODS 柱V (甲醇) V (水) =73, 得到化合物 1 (5.5 mg) .Fr.1 组分通过 Sephadex-LH-20 (甲醇) , 以 V (二氯甲烷) V (甲醇) =2111 比例为流动相, 再通过高效液相HPLC C18柱V (甲醇) V (水) =82, 得到化合物 2 (3.2 mg) .Fr.5 组分通过 Sephadex-LH-20 (甲醇) , 按 V (二氯甲烷) V (甲醇) =2111 比例为流动相, 再通过高效液相 HPLC C18柱V (甲醇)
14、V (水) =41, 得到化合物 3 (2.8 mg) .1.2.3 抗菌活性测试采用 96 孔板 2 倍稀释法10分别测试了化合物 13 的抗菌活性, 环丙沙星作为阳性对照, 测定最小抑菌浓度 (MIC, mol/L) .6 株致病菌株分别为溶壁微球菌 (Micrococcus lysodeikticus) 、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 、蜡状芽孢杆菌 (Bacillus cereus) 、鳗弧菌 (Vibrio anguillarum) 、普通变形杆菌 (Proteusbacillm vulgaris) 和副溶血性弧菌 (Vibrio parahemolyticu
15、s) .2 结果与讨论2.1 化合物结构解析化合物 1, 黄色油状, 易溶于甲醇, D=+142.3 (c 0.26, CH3OH) .UV, /nm:216, 268, 349;HRESI-MS (Positive, C 21H21O9计算值) , m/z:417.1180 (417.1170) M+H, 确定分子式为 C21H20O9, 计算其不饱和度为 12.进一步分析H NMR 谱发现, 该化合物含有 6 个烯基氢 (4-H, H6.20;5-H, H6.13;10-H, H7.06;11-H, H6.37;4-H, H6.20;6-H, H6.27) 、3 个连氧氢 (1-H, H3
16、.90 和 H4.52;8-H, H5.31) 和 2 个甲基氢 (9-H, H1.32;8-H, H2.58) .由 C NMR 谱可知, 化合物 1 存在 1 个酮羰基碳 (C6, C197.3) 、2个酯羰基碳 (C12, C169.7;C1, C171.9) .12 个烯基碳 (C3, C158.9;C4, C110.8;C4a, C151.2;C5, C120.3;C10, C137.9;C11, C124.8;C2, C105.6;C3, C166.0;C4, C101.9;C5, C164.2;C6, C112.8;C7, C145.0) 、3 个连氧碳 (C1, C69.5;C
17、7, C75.1;C8, C76.5) 、1 个次甲基碳 (C8a, C36.2) 和 2 个甲基碳 (C9, C19.6;C8, C24.6) .化合物 1 的氢谱、碳谱数据及 HMBC 谱列于表 1 中.分析表 1 中的数据可见, 5-H/C7 存在相关信号, 8-H/C7 和 8-H/C9 存在相关信号, 结合 9-H/C6 和 9-H/C7相关信号可推出片段;1-H/C3, 1-H/C4a 和 1-H/C8a 存在相关信号, 结合 4-H/C3, 4-H/C4a 和 4-H/C8a 相关信号可推出片段;10-H/C11 和 10-H/C12 存在相关信号, 结合 11-H/C10 和
18、11-H/C12 相关信号, 可推出片段;4-H/C1, 4-H/C2, 4-H/C3和 4-H/C6存在相关信号, 6-H/C1, 6-H/C2, 6-H/C4和 6-H/C8存在相关信号, 结合 8-H/C1, 8-H/C2, 8-H/C3, 8-H/C6和 8-H/C7相关信号可推出片段;由 1-H/C8 存在相关信号, 4-H/C5 存在相关信号, 5-H/C4 和 5-H/C8a 存在相关信号, 8-H/C4a 和 8-H/C8a 存在相关信号, 结合 COSY 谱可以推出片段和相连;4-H/C10 存在相关信号, 10-H/C3和 10-H/C4 存在相关信号, 11-H/C3 存
19、在相关信号, 结合 COSY 谱可推出片段和相连;8-H/C1存在相关信号, 可以推出片段和相连;由以上分析可推出化合物 1 的平面结构 (如图 1 所示) .Table 1H NMR, C NMR and HMBC of compound 1 下载原表 Fig.1 Structure of compounds 13 and key HMBC, COSY and NOESY of compound 1 下载原图(A) Key1H-1H cosy and HMBC for compound 1; (B) NOESY for compound 1; (C) structure for compou
20、nds 13.化合物 1 的立体构型通过 NMR 和量子化学计算的方法来确定.化合物 1 的 NOESY谱中 8-H 与 9-H 之间存在相关信号, 表明 8-H 和 9-H 处于化合物平面的同侧;由 J8, 8a=9.9 Hz 可知 8-H 与 8a-H 处于化合物平面的异侧3,11, 且 NOESY 谱中 8-H 与 8a-H 之间不存在相关信号, 也表明了 8-H 与 8a-H 处于化合物平面两侧, 因此化合物 1 的相对构型为 (7S, 8S, 8a S) -1.此构型分子用于电子圆二色谱 (ECD) 的计算.首先利用分子力场 MMFF94S17对化合物 (7S, 8S, 8a S)
21、-1 进行构象搜索, 得到 59 个稳定构象 (E=013.60 k J/mol) , 并在B3LYP/6-311+G (d) 基组18上优化计算这些构象.得到 43 个相对能量在02.5 k J/mol 范围内的稳定构象.所有 43 个构象用于 ECD 计算.该计算采用B3LYP/6-311+G (2d, p) 基组进行.利用玻尔兹曼加合方法拟合得到 ECD 图谱, 将计算得到的 ECD 谱 (表 S2, 见本文支持信息) 与实验得到的 ECD 谱 (表 S3, 见本文支持信息) 进行对比 (图 2) , 结果表明, 计算得到的 ECD 光谱曲线与实验得到的 ECD 光谱曲线基本吻合.因此化
22、合物 1 的绝对构型为 (7S, 8S, 8a S) .Fig.2 Comparison of predicted ECD (a) and experimental ECD (b) for compound 1 下载原图2.2 抗菌活性分别测试了化合物 13 对 6 株致病细菌的抗菌活性.结果表明, 化合物 1 对副溶血性弧菌 (V.panahemalyticus) 具有一定的抗菌活性, MIC 值为 25.0mol/L, 而环丙沙星对副溶血性孤菌 (V.parahemolyticus) 的 MIC 值为 1.25mol/L;化合物 2 对 6 株致病细菌均不具有抑制作用;化合物 3 对枯草芽
23、孢杆菌 (B.subtilis) 、蜡状芽孢杆菌 (B.cereus) 、鳗弧菌 (V.anguillarum) 和副溶血性弧菌 (V.parahemolyticus) 均有一定的抗菌活性, MIC 值分别为 12.5, 6.5, 12.5 和 12.5mol/L, 而环丙沙星对以上几种致病细菌的 MIC 值分别为0.625, 0.313, 0.625 和 1.25mol/L.3 结论从一株海洋真菌 P.pinophilum 的次级代谢产物中提取分离得到 3 个Azaphilones 类化合物.通过比较实验 ECD 光谱与量子计算得到的 ECD 光谱, 确定化合物 1 的绝对构型为 (7S,
24、8S, 8a S) .化合物 1 和 3 均显示出一定的抗菌活性.支持信息见 http:/ X.L., Wang J.F., Yao H., Chem.J.Chinese Universities, 2013, 34 (2) , 381385 (时晓磊, 王加付, 姚华.高等学校化学学报, 2013, 34 (2) , 381385) 2Sami S., Mohamed B., Tahar M., Chem.Res.Chinese Universities, 2015, 31 (4) , 693698 3Wang W., Lee T.G., Patil R.S., Mun B., Yang I
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26、 11071111 (徐燕, 田沙沙, 俞和, 杨文智, 朱华结.高等学校化学学报, 2015, 36 (6) , 11071111) 6Gao S.S., Li X.M., Zhang Y., Li C.S., Cui C.M., Wang B.G., J.Nat.Prod., 2011, 74, 256261 7Liu Y.Y., Yang Q., Xia G.P., Huang H.B., Li H.X., Ma L., Lu Y.J., He L., Xia X.K., She Z.G., J.Nat.Prod., 2015, 78, 18161822 8Zhang C.C., Din
27、g S.S., Shi W.S., Cao F., Zhu H.J., Wen M.L., Nat.Prod.Res., 2017, 31, 99103 9Gao T., Cai S.Y., Xu L.L., Cao F., Zhu H.J., Chem.J.Chinese Universities, 2016, 37 (7) , 12821286 (高彤, 蔡思源, 许兰兰, 曹飞, 朱华结.高等学校化学学报, 2016, 37 (7) , 12821286) 10Zhang N., Chen Y., Jiang R., Li E., Chen X., Xi Z., Jiang X., Au
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