1、rDNA 序列在多种蔬果类植物染色体上的定位 牛凯 陈成彬 刘慧静 古瑜 王春国 孙德岭 宋文芹 南开大学生命科学学院 天津科润蔬菜研究所 摘 要： 利用改进的 rDNA 序列标记荧光原位杂交方法, 将 18S-5S rDNA 探针序列直接在5端进行荧光修饰, 并成功将其应用到多种植物染色体上, 该方法比常规方法具有省时、经济、快速、信号强等特点, 使 rDNAFISH 杂交更为简单, 更易操作.首次利用该技术成功地对 30 种蔬果类植物中期染色体进行 18S-5S rDNA 的物理定位, 初步了解了 rDNA 序列在这些蔬果类植物基因组中位点数目和分布特点, 其中大蒜、大葱、蚕豆、萝卜 (3
2、 种) 茴香、红菜苔、空心菜、芥兰、莴苣、乌塌菜、雪里蕻、茼蒿、油菜、辣椒、茄子、芹菜、菜豆、花椰菜等 20 种植物首次确定了 18S-5S rDNA 在中期染色体上的位置, 其余 10 种植物与前人的结果相吻合.该方法可以作为染色体的一个识别指标, 也可为蔬果类植物属内进化和物种分化研究提供重要资料.关键词： 荧光原位杂交; 18S-5S rDNA 探针; 植物中期染色体定位; 作者简介：牛凯 (1993-) , 男, 山东菏泽人, 硕士研究生.作者简介：陈成彬 (1972-) , 男, 河北冀州人, 副教授, 研究方向:分子细胞遗传学.E-mail:收稿日期：2017-02-13基金：国家
3、自然科学基金 (31371249) Localization of rDNA Sequences in a Variety of Vegetable Tianjin Kernel Vegetable Reasearch Institute; Abstract： rDNA sequences were fluorescence in situ hybridization method, 18 S-5 S rDNA probe sequence in the synthesis directly in the 5 end labeled, successfully applied to many
4、plant chromosome, this method than the conventional method Time-saving, economical, fast, signals and other characteristics, so that rDNA-FISH hybridization is more simple, easier to operate. The author first Usingthis way to 30 species of fruits and vegetables successfully among different genera of
5、 plants, species chromosome 18 S-5 S rDNA on the physical location, preliminary exploration of the rDNA sequences of those species of vegetables and fruit in the plant genome the number of sites And distribution. 20 kinds of plants garlic, green onions, beans, radish (3) fennel, red Cabbage, spinach
6、, kale, lettuce, Wuta vegetables, Brassica juncea, garland chrysanthemum, rape, pepper, eggplant, Celery, beans, broccoli are the first location.The other10 kinds of plants consistent with the previous results. This study can be used as an identification index of chromosomes, and also provides a clu
7、e as vegetables and fruit plants within the evolution and differentiation of species.Keyword： 18S-5S rDNA probe; FISH; plant metaphase chromosome localization; Received： 2017-02-130 引言荧光原位杂交技术 (fluorescence in situ hybridization, FISH) 是上个世纪 80 年代后期发展起来的一种重要的非放射性原位杂交技术, 是研究 DNA 序列在染色体上位置的最直接方法, 其原理是
8、:用将 DNA 序列用 digoxigenin-11-d UTP 或 biotin-11 d UTP 等非放射性标记物制备成探针, 与载玻片上的染色体标本进行杂交, 把探针直接定位到染色体上1,2.多色荧光原位杂交技术是1996 年建立起来的细胞遗传学方法, 其优点是通过一次杂交完成全基因水平的分析, 能同时鉴定多个探针位点, 有效鉴定各种简单或复杂的染色体易位, 构建染色体分子核型.蔬果类植物在世界范围内广泛分布, 具有巨大的经济价值和营养价值, 诸多优势与人们的生活息息相关, 应用 r DNA 探针进行荧光原位杂交定位方面的研究在蔬果类植物中还较少, 除了一些零星报道之外3-7, 对于我国
9、栽培蔬菜和水果植物的核型还没有比较系统的研究.利用改进的 r DNA 序列荧光原位杂交方法, 将 18S-5S r DNA 序列直接在 5端进行荧光修饰, 并利用双色荧光原位杂交技术对 30 种蔬果类植物不同属间、种间中期染色体上进行 18S-5S r DNA 的物理定位, 进而了解 r DNA 序列在这些蔬果类植物基因组中位点数目和分布特点, 同时证明该方法的可行性, 使 r DNA-FISH 杂交具有省时、经济、快速、信号强等特点, 便于推广和应用.1 材料与方法1.1 材料以兰州百合、芹菜、萝卜等 26 种蔬菜和西瓜、甜瓜 4 种水果共 9 科 21 属 30 种植物为实验材料, 名称见
10、表 1, 凭证标本保存在天津农科院科润蔬菜研究所1.2 实验方法1.2.1 探针的合成及染色体标本制备:染色体标本的制备采用陈瑞阳等人 (1979) 的去壁低渗法8选择分散良好的染色体用荧光显微镜标尺记下坐标的位置或用记号笔在反面标记染色体的位置, 将染色体标本放在-20冰箱中保存待用.1.2.2 18S r DNA 和 5S r DNA 探针制备:从拟南芥 18S 和 5S r DNA 序列中选取一段重复序列, 直接由上海生工合成探针, 18S r DNA 在 5端进行 FAM 绿色荧光标记;5S r DNA 探针 5端进行 TAMRA 红色荧光标记.1.2.3 染色体荧光原位 (FISH)
11、 杂交方法:A:染色体标本预处理: (1) 在荧光显微镜上记下已标记分裂相的坐标, 并用玻璃刀在载玻片背面标记分裂相的位置; (2) 将载玻片在 45%醋酸中浸泡 5min 褪色, 空气干燥; (3) 多聚甲醛固定 10 min, 70%, 85%, 100%系列乙醇脱水各 5 min, 风干; (4) 在标记处加 30L 70%去离子甲酰胺/2SSC, 盖上盖玻片, 于 PCR 仪或烘箱中 70处理 2-4 min; (5) 去掉盖片, -20的冷乙醇系列 (70%, 85%, 100%) 脱水, 每级 3 min, 空气干燥.B:杂交: (1) 用 2SSC 稀释探针至 5 ng/L; (
12、2) 每张标本加 10L 18S 和5S 混合探针, 并盖 1818mm 的盖玻片; (3) 于湿盒中 37杂交 2 h 以上或过夜.C:杂交后洗脱: (1) 在 4SSC, 0.2%Tween 20 中室温下避光洗涤 10 min; (2) 蒸馏水冲洗片刻, 空气干燥 (避光) .D:杂交信号检测: (1) 滴加 5 u L 含有 DAPI 的防荧光淬灭剂, 盖上盖玻片; (2) 荧光显微镜观察, 并用冷 CCD 拍照; (3) 荧光显微镜观察, 在紫外光激发下可观察到蓝色的分裂相, 在绿色激发光激发下可观察到红色的 5S 杂交信号.在蓝色光激发下可观察到绿色的 18S 荧光信号.E:图像采
13、集与处理:Nikon 80i 荧光显微镜观察杂交信号, 冷 CCD 进行图像采集, SPOT 4.1 软件进行图像合成.2 结果及分析2.1 百合科 3 种植物 18S-5S r DNA FISH 定位兰州百合 (Lilium davidii var.unicolor Cotton) (图 1-1) 具有 8 个 18S r DNA 位点 (如图中长箭头所示亮点) 和两个 5S r DNA 位点 (如图中长箭头所示亮点) , 18S r DNA 位点均位于 1 对染色体的副縊痕位置, 有 3 对染色体副縊痕上显示了清楚的信号, 这些信号位于 3 对染色体长臂上, 与核型分析的随体位置一致, 这
14、与李懋学等人 1984 年报道的结果吻合9.蒜 (Allium sativum L.) (图 1-2) 18S r DNA 在两对染色体上有信号, 证明有两对随体染色体, 他们均位于着丝粒附近, 为中间随体.5S r DNA 信号位于一对染色体上, 其中 1 对信号位于染色体的短臂上, 能看到 4-5 个信号位点, 1对信号位于长臂靠近着丝粒附近.葱 (Allium fistulosum L.) (图 1-3) 18S r DNA 位于一对染色体上, 为一对随体染色体, 5S r DNA 具有 2 个位点均位于一对染色体短臂中间部位.2.2 十字花科 7 种植物 18S-5S r DNA-FI
15、SH 定位旱萝卜 (Raphanus sativus L.ssp.hanluobu) (图 1-4) 、水萝卜 (Raphanus sativus L.ssp.shuiluobo) (图 1-5) 和樱桃萝卜 (Raphanus sativus L.var.radculus Pers) (图 1-6) 3 个品种 18S r DNA 都定位在一对染色体上, 5S r DNA 定位在两对染色体上, 其中有一对是与 18S r DNA 在同一对染色体上, 18S r D-NA 信号在前, 5S r DNA 信号在后, 位于随体染色体上, 信号也比较强, 另一对染色体上的 5S r DNA 信号在染
16、色体着丝粒部位.白菜型油菜 (Brassica campestris L.) (图 1-7) 随体比较大, 这与陈瑞阳等人报道的结果一致10, 属于大随体, 18S r DNA 位点有 2 个, 位于一对染色体的短臂靠近着丝粒的部位, 这与核型分析的结果相吻合.5S r DNA 位于 3 对染色体上, 其中 1 对与 18S r DNA 位于同 1 条染色体上, 5S 位点在 18S r DNA后面更靠近着丝粒.花椰菜 (B.oleracea L.var.botrytis L.) (图 1-8) 18S r DNA 位于两对染色体上, 其中 1 对信号比较强, 1 对信号比较弱.5S r DN
17、A 定位到 1 对染色体的长臂靠近着丝粒位置上, 信号强度比 18S r DNA 亮.乌塌菜 (B.campestris L.ssp.chinensis L.) (图 1-9) 18S r DNA 位点位于 1对具随体染色体上, 2 个信号有些差别, 1 个信号靠近短臂末端, 1 个信号靠近短臂着丝粒附近, 信号强度比较弱.5S r DNA 信号位于 3 对染色体上, 其中 1对与 18S 在同 1 条染色体上, 1 对位于染色体长臂上, 位于小染色体短臂上的信号稍弱.芥蓝 (B.alboglabra Baile) (图 1-10) 18S r DNA 杂交信号有 1 对, 位于染色体短臂靠近
18、着丝粒, 一条染色体的信号几乎覆盖整个着丝粒, 一条更靠近短臂末端.5S r DNA 杂交信号位于染色体长臂靠近着丝粒处, 两个信号呈现出点状形态, 信号强度基本一致.雪里蕻 (B.juncea Coss.var.crispifolia Bailey) (图 1-11) 18S r DNA 在两对染色体上有信号, 两对均在染色体短臂末端, 1 对信号覆盖整个随体, 另外一对比较小, 5S r DNA 位于 5 对染色体上, 5S r DNA 信号都比较强, 其中两对与 18S r DNA 在同一条染色体短臂上, 其中一对信号非常强.红菜苔 (B.compestris L.var.purpure
19、a Bailey) (图 1-12) 18S r DNA 位点位于 1 对小染色体上, 信号整个覆盖染色体的短臂, 信号强度比较强.5S r DNA信号位于 4 对染色体上, 其中 1 对与 18S r DNA 在同 1 条染色体上, 1 对位于1 对小染色体短臂末端, 1 对位于长臂上, 1 对位于着丝粒附近, 信号都比较强.2.3 菊科 2 种植物的 18S-5S r DNA-FISH 定位莴苣 (Lactuca sativa L.) (图 1-13) 18S-5S r DNA 信号均位于 1 对具随体染色体上, 18S r DNA 信号位于副缢痕与核仁组成区 (NOR) , 覆盖整个随体
20、.5Sr DNA 信号位于短臂靠近着丝粒附近, 信号强度比较亮.茼蒿 (Chrysanthemum coronarium L.) (图 1-14) 18S-5S r DNA 信号都位于 1对染色体上, 18S r D-NA 位于短臂末端, 5S r DNA 位于着丝粒附近, 2 个探针信号强度相当.这个结果与李真等人 (2011) 利用 45S r DNA 为探针在中亚苦蒿上的杂交结果一致11.2.4 葫芦科 7 种植物 18S-5S r DNA-FISH 定位丝瓜 (Luffa cylindrica (L.) Roem.) (图 1-15) 具有 1 对 18S r DNA 信号, 信号弥散
21、几乎覆盖这对染色体的短臂, 1 对 5S r DNA 信号位于短臂中间部位, 本研究得试验结果与徐延浩 (2007) 12报道的丝瓜具有 5 对 45S r DNA 位点结果不一致, 5S r DNA 一致, 这也许与 18S r DNA 与 45S r DNA 在基因组中的大小有一定关系, 也许与品种之间的差异相关, 还有待于进一步利用 45S r DNA 作探针进一步验证.苦瓜 (Momordica charantia L.) (图 1-16) 18S r DNA 杂交信号检出分别位于2 对染色体短臂末端, 信号强弱没有明显区别, 5S r DNA 杂交信号位于 1 条小染色体短臂上, 信
22、号在 2 条染色体上没有区别.与李琦 (2007) 报道的结果一致13.西瓜 (Citrullus lanatus L.) (图 1-17) 18S r DNA 信号有 4 个, 分布在两对染色体上, 1 对 5S r DNA 信号位于 1 对具随体染色体上, 与 18S r DNA 信号位于同 1 对染色体上, 紧挨着 18S r DNA 的信号.与李琦等人的报道不同13, 这可能与所用的西瓜品种有关.白色薄皮甜瓜 (Cucumis melo L.ssp.baopi) (图 1-18) 、花薄皮甜瓜 (Cucumis melo L.ssp.huapi) (图 1-19) 、厚皮甜瓜 (Cuc
23、umis melo L.houpi) (图 1-20) 虽然表型特征不同, 但所具有的染色体数目、18S-5S r DNA 的位点数目均相同, 18S r DNA 位于一对随体染色体上, 信号比较强, 几乎覆盖了整个短臂.5Sr DNA 位于另外一对染色体的短臂末端.黄瓜 (Cucumis sativus L.) (图 1-21) 18S r DNA 信号全部位于 6 条染色体的中部着丝粒位置.5S r D-NA FISH 信号位于 1 对染色体的短臂上, 1 个信号强 1个信号稍弱一些, 也许与 5S r DNA 在染色体上的拷贝数有关.2.5 茄科两种植物 18S-5S r DNA-FIS
24、H 定位辣椒 (Capsicum annuum L.) (图 1-22) 18S r DNA 信号分布在两对染色体短臂末端, 相对 5S r DNA, 18S r DNA 信号比较弱.从辣椒核型分析的角度来看, 与李懋学等报道的辣椒具 1 对随体染色体有差别14, 与陈瑞阳等 2003 报道的一致10.茄子 (Solanum melongena L.) (图 1-23) 18S r DNA 定位在 1 对染色体短臂副缢痕的位置, 信号比较大, 几乎覆盖整个短臂, 1 对较弱的 5S r DNA 信号定位在 1 对染色体长臂末端, 信号呈点状.2.6 伞形科 2 种植物 18S-5S r DNA
25、-FISH 定位芹菜 (Apium graveolens L.) (图 1-24) 18S r DNA 位于 1 对具随体染色体上, 信号在短臂的末端, 两条染色体上的信号强度很均匀.5S r DNA 信号位于 1 对中着丝点染色体上, 位于短臂的末端.茴香 (Foeniculum vulgare Mill.) (图 1-25) 18S r DNA 特异地定位在 1 对具随体染色体, 形成了随体相接的形态, 整个信号覆盖了随体部位.5S r DNA 位于 1 对染色体长臂靠近着丝粒的位置.信号强度大小一致.2.7 豆科 3 种植物 18S-5S r DNA-FISH 定位菜豆 (Phaseol
26、us vulgaris L.) (图 1-26) 18S r DNA 特异地定位在一对随体染色体上, 信号强度覆盖整个短臂.两对染色体具有 5S r DNA 信号, 1 对信号位于长臂信号弱一些, 一对位于着丝粒附近信号相对强一些.豌豆 (Pisum sativum L.) (图 1-27) 在一对染色体长臂副缢痕处显示 18S r DNA 信号, 表明豌豆的随体在长臂, 这与陈瑞阳等人 2003 报道豌豆具随体染色体在第五号染色体的长臂结果一致.蚕豆 (Vicia faba L.) (图 1-28) 只在 1 对大染色体副缢痕处显示 18S 和 5S r DNA 信号, 5S r DNA 信
27、号呈点状, 靠近短臂与 18Sr DNA 信号紧密相连, 18S r DNA 信号在副缢痕处比 5S r DNA 信号强.2.8 藜科菠菜 18S-5S r DNA-FISH 定位菠菜 (Spinacia oleracea L.) (图 1-29) 18S r DNA 在两对染色体次缢痕及随体部位显示了杂交信号, 1 对信号较强, 1 对信号较弱.结果与兰添颖等报道 (2007) 结果不一致7, 这可能与 18S r DNA 的分布有关或者与品种的性别有关.5S r DNA 信号定位于两对染色体长臂末端, 信号强度、大小没有区别.2.9 旋花科空心菜 18S-5S r DNA-FISH 定位空
28、心菜 (Ipomoea aquatica Forsk) (图 1-30) 18S r DNA 位于两对染色体上, 与吴建桥等人 45S r DNA 定位结果一致都是位于 2 对染色体上.5S r DNA 位于一对染色体的长臂上, 5S r DNA 信号比 18S r DNA 信号强.3 讨论以往的研究都是利用 45S r DNA 或 25S r DNA, 在植物上很少使用 18S r DNA, 本研究首次应用直接合成的 18S-5S r DNA 探针, 在探针的 5端直接修饰 FAM或 TAMRA, 免去了繁琐的探针标记, 节省了时间、节省了经费, 而且信号强度等基本上与 45S r DNA
29、探针效果相当, 从我们的试验结果看基本上达到了预期的效果.像葫芦科植物 (苦瓜和西瓜) 、茄科植物 (辣椒和茄子) 、十字花科植物 (白菜型油菜、乌塌菜、旱萝卜、樱桃水萝卜、长型水萝卜、芥兰、花椰菜、红菜苔) , 他们的染色体数目分别相同且形态差异较小, 仅根据常规核型分析结果很难区分各个品种, 而 18S r DNA, 5S r DNA 在这些植物上的染色体位点数和分布模式为准确识别这些物种提供了标识, 更重要的是, 本研究所采用的18S r DNA 探针在其他作物中通用性很强, 虽然与 45S r DNA 杂交所获得的信号在一些物种上有一些差异, 但也许是和所用品种有一定的关系, 也可能与
30、18S r DNA 所包含的序列有一定关系.还需要进一步改进探针序列的选择, 增加信号强度, 使一些较弱的信号能够观察到.图 1 18S-5S r DNA 混合探针对 30 种蔬果植物染色体 FISH 杂交结果 Fig.1 FISH result of 18S-5S r DNA prob in 30 vegetable5S r DNA 为红色信号如图中长箭头所示亮点;图中种名编号顺序与表 1 一致表 1 30 种蔬果类植物的染色体数目和 18S-5S r DNA FISH 杂交结果 Table 1 Chromosome numbers and FISH result of 18S-5S r D
31、NA prob in 30 vegetable&fruit plants 下载原表 目前已有大量的研究证明 18S-5.8S-25S r DNA 在大多数物种中其主要定位在核仁组织区 (NOR) 即染色体的次缢痕部位.18S r DNA 是 45S r DNA 的一部分, 其定位位点应与 45S r DNA 一致.从染色体结构来讲, NOR 的数目应该与随体数目相对应, 因此, 18S r DNA 的杂交位点数目即是染色体随体的数目5.本实验采用双色荧光原位杂交技术在 30 种蔬果类植物不同属间、种间中期染色体上进行了 r DNA 的物理定位, 所研究的 30 种蔬果植物 18S r DNA
32、的杂交信号从2-8 个不等, 其中, 兰州百合最多为 8 个杂交信号, 黄瓜 6 个杂交信号, 蒜、西瓜、苦瓜、花椰菜、雪里蕻、辣椒、空心菜和菠菜为 4 个杂交信号, 其余的均为 2 个杂交信号.除菠菜、丝瓜和白菜型油菜与 25S r DNA 和 45S r DNA 信号位点不一致外, 其余的均与已报道的一致, 这可能与所取的品种来源相关.或许是由于 45S r DNA 与 18S r DNA 他们本身的结构所造成.在高等植物中, 45S 包括 18S-5.8S-28Sr DNA, 由许多的 45Sr DNA 重复单位所组成, 一个 45S r DNA重复单位包括转录区和非转录区, 他们串联在
33、一起形成多个重复序列, 45Sr DNA 重复单位长度为 7.8Kb-18.5Kb, 而 18Sr DNA 只是其中的一部分结构, 18Sr DNA 重复单位长度约 1.8Kb, 比 45Sr DNA 小得多, 重复的次数少, 在杂交的过程中所获得信号比较弱, 不能够显示出来, 可能是造成这种差异的原因, 有待进一步研究.在高等植物中, 包括被子植物和裸子植物, 5S r DNA 的位置并不恒定, 位点 2-10 个不等, 最多的是雪里蕻 10 个信号, 红苔菜 8 个信号, 白菜型油菜、乌塌菜和豌豆为 6 个杂交信号, 菠菜、蒜、旱萝卜、樱桃萝卜、水萝卜、菜豆为 4个杂交信号.由于 5S r
34、 DNA 和其它 r DNA 在染色体的分布彼此独立, 有些物种分布在相同染色体上, 如本试验中的蚕豆、大蒜、西瓜、3 种萝卜、白菜型油菜、乌塌菜、红苔菜、雪里蕻、莴苣、茼蒿、菠菜等物种都有一对染色体 18S r DNA 与 5S r DNA 在同一染色体上.但没有发现 5S r DNA 与 18S r D-NA 在相同的位点上, 虽然 5S r DNA 在功能上也与核仁有关, 但它并不位于核仁, 5S r DNA 的结构由编码区和间隔区组成, 编码区的长度和序列物种间变化较大.另外所观察的这 30 种蔬果植物中都发现了 r DNA 信号强弱在不同的染色体上有变化, 这种变化在有的植物染色体中
35、明显.如雪里蕻、红苔菜等, 这些信号的强弱有些可能是由于染色体所处的空间位置导致信号大小不一样, 但是大多数信号强弱的变化应该是由于 r DNA 序列的在不同染色体拷贝数不同而造成, 如果染色体上 r DNA 拷贝数越多, 相应显示的信号越强, 反之则越弱.也有学者认为这种信号微弱的区域是曾经存在于着丝粒附近的 45Sr DNA 区域在大规模的染色体重排中移向染色体末端后所剩的残余15.参考文献1 Lalev A I, Nazar R N.Conserved core structure in the internal transcribed spacer 1 of the Schizosac
36、charomyces pombe precursor ribosomal RNAJ.J Mol Bio, 1998, 284:1 341-1 351. 2 Pillay M, Hilu K W.Chloroplast DNA restriction site analysis in the genus Bromus (Poaceae) J.Amer J Bot, 1995, 83:239-250 3 刁英, 陈思, 黄雨蝶, 等.蕹菜的 DAPI 显带核型J.氨基酸和生物资源, 2005, 1:32-34. 4 郝剑瑾, 程舟, 梁洪卉, 等.基于 r DNA ITS 序列探讨我国冬虫夏草的遗
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