1、临床检验诊断学专业优秀论文 急性移植排斥反应过程中 HLA-G 表达动态变化的实验及临床研究关键词：急性移植排斥反应 HLA-G Qa-2 免疫抑制剂摘要：背景： 器官和组织移植是 20 世纪的医学壮举，为挽救人类生命做出了超乎寻常的贡献。随着组织配型、器官保存、移植手术、术后抗感染等一系列临床技术的不断进步，移植器官的存活率以及患者的生活质量和生存率都得到了很大的提高，使得器官移植成为治疗终末期器官功能衰竭最有效的治疗手段。 然而，移植术后的排斥反应，尤其是急性排斥反应，仍然是导致移植器官功能丧失、甚至患者死亡最主要的原因。尽管移植物局部组织的病理活检可以对排斥反应做出明确诊断，而且一直被公
2、认为是诊断移植排斥反应的金标准，但由于其具有创伤性、容易诱发并发症等缺点，在临床上难以成为常规的检查手段；临床常用的生化学等检查只有在移植器官组织结构明显异常，影响到器官功能时才能做出诊断。而目前研究较多的细胞因子、抗体等检查，则往往由于其准确性、敏感性、特异性方面的不足而无法得到广泛的应用。到目前为止，仍没有一种可以及时、准确诊断排斥反应的公认的检测方法。 在无法准确了解患者免疫状态的情况下，免疫抑制剂是预防排斥反应发生的最有效的手段，但过量的免疫抑制剂往往导致严重感染和肿瘤等恶性疾病的发生。 因此如何通过一种无创性的检测方法准确地反映患者的免疫状态并及时发现、预测排斥反应的发生是移植研究领
3、域一个亟待解决的重大课题。只有这样，才能在预防排斥反应和减少免疫抑制剂用量之间寻找到一个适宜的平衡点，制定个性化的治疗方案，达到最佳的治疗效果。 以往相关研究主要从淋巴细胞活化的角度加以研究，但从另一方面看，移植术后稳定的患者大多处于免疫抑制或免疫耐受状态，而发生排斥的患者则是打破了业已建立的免疫抑制状态而使得免疫细胞重新激活并发挥同种异体杀伤作用。那么能否从免疫耐受的角度着手，借观察宿主免疫耐受相关因素的变化来预测排斥反应的发生呢? 胚胎植入是诱导免疫耐受最成功的典范，从本质上看，胚胎植入的过程，其实就是母体对带有父方异体抗原成分的胚胎的免疫耐受过程。器官移植和胚胎植入是两个密切相关的研究领
4、域，虽然同样是同种异体之间的免疫应答，胚胎植入和器官移植的结局却截然相反，这其中涉及很多种蛋白和分子的参与。其中非经典主要组织相容性复合体（MHC） ，尤其是 HLA-G 的差异性表达，引起了越来越多胚胎学研究和病理妊娠研究领域专家的重视。 HLA-G 是一种非经典 MHC-类抗原，与经典 MHC-类抗原的基因高度同源，蛋白结构也很相似。不同的是，HLA-G分子不具有丰富的多态，也不像经典 MHC-抗原那样分布广泛。生理状态下HLA-G 仅表达于胚胎滋养层和一些免疫豁免部位。从功能上看，HLA-G 分子可与NK 细胞、T 细胞和 APC 细胞等免疫细胞的抑制性受体结合，传递抑制性信号，从而抑制
5、母体免疫细胞的活性，诱导母体对胚胎抗原的免疫耐受。母胎界面HLA-G 表达下降与流产、子痫等病理妊娠的发生密切相关。 胚胎学的研究成果为器官移植免疫的研究提供了新的思路。那么从器官移植的角度来看，移植术后 HLA-G 的表达是否呈现出规律性的变化?排斥反应发生时，HLA-G 的表达是否会有相应的变化?是否有助于临床上排斥反应的诊断呢?免疫抑制剂对机体HLA-G 的表达有怎样的影响作用呢?这一系列问题尚未引起人们的重视。如果解决了上述问题，将有助于阐述 HLA-G 分子在器官移植中的作用机制，为临床排斥反应的诊断提供新的思路。 临床上，移植受者术后常规接受免疫抑制剂治疗以诱导耐受，因此难以区分移
6、植排斥反应和免疫抑制剂对 HLA-G 的不同作用，因而有必要利用动物模型来系统研究移植排斥反应发生过程中 HLA-G 分子表达的变化规律，并独立探讨免疫抑制剂对其的影响作用。 小鼠的 Qa-2 分子与人类 HLA-G 分子在结构和功能上均具有高度的同源性，而且纯系小鼠之间的皮肤移植模型是最经典的排斥反应动物模型，手术简便，易于观察。因此小鼠皮肤移植模型成为本次研究的理想动物模型。 为了系统的研究移植排斥反应发生过程中 HLA-G 分子表达的变化规律以及免疫抑制剂的影响作用，我们首先以近交系小鼠皮肤移植模型研究了移植术后不同时间移植物、浸润淋巴细胞、外周血淋巴细胞（PBLs）以及血浆中 Qa-2
7、 的表达，分析了其与移植排斥反应分级之间的相关性和不同剂量免疫抑制剂的影响作用。并在动物研究的基础上，动态监测了临床肾移植术后稳定患者和排斥患者术后不同时间外周血单个核细胞以及血浆 HLA-G 的不同表达，探讨了 HLA-G 对移植物排斥反应的诊断价值，并分析了其与患者免疫耐受状态之间的关系，以期为临床制定个性化免疫抑制方案提供实验依据。 目的： 1、利用成功建立的小鼠皮肤移植模型，动态监测用药和不用药状态下移植受者术后不同时间小鼠 Qa-2 分子在移植物、浸润淋巴细胞、外周血淋巴细胞、血浆中的表达变化，揭示移植受者 Qa-2 分子在移植排斥反应发生过程中的变化规律，探讨其与同种异体急性移植排
8、斥反应发生进程之间的对应关系。 2、通过检测不同种类、不同剂量免疫抑制剂单一或联合作用下小鼠 Qa-2 表达的变化，分析免疫抑制剂种类和剂量对 Qa-2 表达的不同作用，探讨 Qa-2 表达对机体免疫抑制状态的监测价值，以期为指导临床制定个性化治疗方案提供实验依据。 3、动态监测肾移植患者术前和术后不同时间外周血单个核细胞 HLA-G 转录和蛋白水平以及血浆可溶性 HLA-G 表达的变化规律，对比稳定组和排斥组的差异，探讨 HLA-G 对于移植排斥反应的诊断价值、最佳检测方法以及对患者免疫状态的监测作用。 方法： 1建立小鼠皮肤移植动物模型：为研究不同鼠系之间的差别，分别以 SPF 级近交系C
9、57BL/6（简称 C57）和 BALB/C（简称 BA）两种鼠系作为研究对象，分别随机分为正常对照组和手术组，其中手术组又分为自身移植组、同系移植组和异系移植组。为了观察免疫抑制剂的影响，同系和异系移植组又分别分为不用药组和用药组。用药组模拟临床环孢素 A（CsA） 、皮质激素（Horm）及霉酚酸酯（MMF）中等剂量三联用药。手术组采用经典的小鼠背一背皮肤移植手术方法，建立动物模型，术后每天观察皮肤移植物大体改变，记录肉眼排斥时间。每天取移植皮片进行 HE 染色，根据移植物病理组织学改变将其分为排斥反应-级，记录移植物病理排斥进展情况。观察用药和不用药对移植物存活时间和病理组织学改变的影响
10、2动态检测移植术后 Qa-2 的表达：利用成功建立的小鼠皮肤移植模型，术后每天每组处死 5 只小鼠，采集移植皮片、外周血淋巴细胞和血浆，采用免疫组化、Real-Time 荧光定量 PCR、流式细胞术和 ELISA 等方法动态监测不同组别小鼠移植受者术后不同时间点小鼠 Qa-2 分子在移植物、浸润淋巴细胞、外周血淋巴细胞、血浆中的表达变化，分析上述指标与排斥反应发生和免疫抑制剂应用之间的关系。 3免疫抑制剂对 Qa-2 表达的影响：将SPF 级 C57BL/6 小鼠随机分为对照组、环孢素组、激素组、霉酚酸酯组和联合用药组，其中三种单一用药组又分为低、中低、中等、中高、高共 5 个剂量组，收集外周
11、血淋巴细胞、血浆以及移植物，采用 Real-Time 荧光定量 PCR、流式细胞术、ELISA 及免疫组化等方法检测不同种类、不同剂量免疫抑制剂单一作用或联合作用下小鼠 Qa-2 表达的变化，分析了免疫抑制剂种类和剂量对 Qa-2表达的不同作用，探讨了 Qa-2 表达对机体免疫抑制状态的监测价值，以期为指导临床制定个性化治疗方案提供实验依据。 4肾移植患者 HLA-G 的动态监测：连续收集 57 例肾移植患者（其中术后 32 例肾功能稳定、25 例发生急性排斥反应）术前和术后不同时间（术后 3 天、7 天、2 周、3 周、1 月、2 月、3 月以上）外周血标本。怀疑排斥的患者及时进行肾活检明确
12、诊断，并于冲击治疗前、排斥反应发生后 3 天、7 天、2 周、3 周以上分别收集标本。采用 Real-Time 荧光定量 PCR、流式细胞术和 ELISA 等方法动态检测移植受者外周血淋巴细胞 HLA-G 转录和蛋白水平以及血浆可溶性 HLA-G 表达的变化规律，对比分析稳定组和排斥组的差异，探讨 HLA-G 对于移植排斥反应的诊断价值、最佳检测方法。 结论： 1、通过动态监测移植术后不同时间小鼠 Qa-2 的表达变化规律，首次发现：移植术后早期，尤其是在用药状态下，移植物浸润淋巴细胞、外周血淋巴细胞 Qa-2 表达水平明显下调，发生于淋巴细胞活化的阶段。这一阶段尚未造成严重的移植物损伤，远远
13、早于肉眼排斥的发生。 2、免疫抑制剂可明显提高移植物、浸润淋巴细胞、外周血淋巴细胞 HLA-G 的表达，同时延长移植物存活时间，但过高剂量作用反而有所下降。免疫抑制剂中等剂量联合应用不但可以达到最大限度上调 HLA-G 表达的作用，而且对动物的毒性较小，是最佳选择。 3、临床检测结果显示：肾移植术后外周血 HLA-G 的表达，尤其是 CD4+T 细胞 HLA-G 的动态改变，与免疫抑制剂用药时间和剂量密切相关，并在排斥反应发生时明显下调，有可能成为一种反映移植患者免疫耐受状态和诊断排斥反应发生的无创性检测指标。正文内容背景： 器官和组织移植是 20 世纪的医学壮举，为挽救人类生命做出了超乎寻常
14、的贡献。随着组织配型、器官保存、移植手术、术后抗感染等一系列临床技术的不断进步，移植器官的存活率以及患者的生活质量和生存率都得到了很大的提高，使得器官移植成为治疗终末期器官功能衰竭最有效的治疗手段。然而，移植术后的排斥反应，尤其是急性排斥反应，仍然是导致移植器官功能丧失、甚至患者死亡最主要的原因。尽管移植物局部组织的病理活检可以对排斥反应做出明确诊断，而且一直被公认为是诊断移植排斥反应的金标准，但由于其具有创伤性、容易诱发并发症等缺点，在临床上难以成为常规的检查手段；临床常用的生化学等检查只有在移植器官组织结构明显异常，影响到器官功能时才能做出诊断。而目前研究较多的细胞因子、抗体等检查，则往往
15、由于其准确性、敏感性、特异性方面的不足而无法得到广泛的应用。到目前为止，仍没有一种可以及时、准确诊断排斥反应的公认的检测方法。 在无法准确了解患者免疫状态的情况下，免疫抑制剂是预防排斥反应发生的最有效的手段，但过量的免疫抑制剂往往导致严重感染和肿瘤等恶性疾病的发生。 因此如何通过一种无创性的检测方法准确地反映患者的免疫状态并及时发现、预测排斥反应的发生是移植研究领域一个亟待解决的重大课题。只有这样，才能在预防排斥反应和减少免疫抑制剂用量之间寻找到一个适宜的平衡点，制定个性化的治疗方案，达到最佳的治疗效果。 以往相关研究主要从淋巴细胞活化的角度加以研究，但从另一方面看，移植术后稳定的患者大多处于
16、免疫抑制或免疫耐受状态，而发生排斥的患者则是打破了业已建立的免疫抑制状态而使得免疫细胞重新激活并发挥同种异体杀伤作用。那么能否从免疫耐受的角度着手，借观察宿主免疫耐受相关因素的变化来预测排斥反应的发生呢? 胚胎植入是诱导免疫耐受最成功的典范，从本质上看，胚胎植入的过程，其实就是母体对带有父方异体抗原成分的胚胎的免疫耐受过程。器官移植和胚胎植入是两个密切相关的研究领域，虽然同样是同种异体之间的免疫应答，胚胎植入和器官移植的结局却截然相反，这其中涉及很多种蛋白和分子的参与。其中非经典主要组织相容性复合体（MHC） ，尤其是 HLA-G 的差异性表达，引起了越来越多胚胎学研究和病理妊娠研究领域专家的
17、重视。 HLA-G 是一种非经典 MHC-类抗原，与经典 MHC-类抗原的基因高度同源，蛋白结构也很相似。不同的是，HLA-G分子不具有丰富的多态，也不像经典 MHC-抗原那样分布广泛。生理状态下HLA-G 仅表达于胚胎滋养层和一些免疫豁免部位。从功能上看，HLA-G 分子可与NK 细胞、T 细胞和 APC 细胞等免疫细胞的抑制性受体结合，传递抑制性信号，从而抑制母体免疫细胞的活性，诱导母体对胚胎抗原的免疫耐受。母胎界面HLA-G 表达下降与流产、子痫等病理妊娠的发生密切相关。 胚胎学的研究成果为器官移植免疫的研究提供了新的思路。那么从器官移植的角度来看，移植术后 HLA-G 的表达是否呈现出
18、规律性的变化?排斥反应发生时，HLA-G 的表达是否会有相应的变化?是否有助于临床上排斥反应的诊断呢?免疫抑制剂对机体HLA-G 的表达有怎样的影响作用呢?这一系列问题尚未引起人们的重视。如果解决了上述问题，将有助于阐述 HLA-G 分子在器官移植中的作用机制，为临床排斥反应的诊断提供新的思路。 临床上，移植受者术后常规接受免疫抑制剂治疗以诱导耐受，因此难以区分移植排斥反应和免疫抑制剂对 HLA-G 的不同作用，因而有必要利用动物模型来系统研究移植排斥反应发生过程中 HLA-G 分子表达的变化规律，并独立探讨免疫抑制剂对其的影响作用。 小鼠的 Qa-2 分子与人类 HLA-G 分子在结构和功能
19、上均具有高度的同源性，而且纯系小鼠之间的皮肤移植模型是最经典的排斥反应动物模型，手术简便，易于观察。因此小鼠皮肤移植模型成为本次研究的理想动物模型。 为了系统的研究移植排斥反应发生过程中 HLA-G 分子表达的变化规律以及免疫抑制剂的影响作用，我们首先以近交系小鼠皮肤移植模型研究了移植术后不同时间移植物、浸润淋巴细胞、外周血淋巴细胞（PBLs）以及血浆中 Qa-2 的表达，分析了其与移植排斥反应分级之间的相关性和不同剂量免疫抑制剂的影响作用。并在动物研究的基础上，动态监测了临床肾移植术后稳定患者和排斥患者术后不同时间外周血单个核细胞以及血浆 HLA-G 的不同表达，探讨了 HLA-G 对移植物
20、排斥反应的诊断价值，并分析了其与患者免疫耐受状态之间的关系，以期为临床制定个性化免疫抑制方案提供实验依据。 目的： 1、利用成功建立的小鼠皮肤移植模型，动态监测用药和不用药状态下移植受者术后不同时间小鼠 Qa-2 分子在移植物、浸润淋巴细胞、外周血淋巴细胞、血浆中的表达变化，揭示移植受者 Qa-2 分子在移植排斥反应发生过程中的变化规律，探讨其与同种异体急性移植排斥反应发生进程之间的对应关系。 2、通过检测不同种类、不同剂量免疫抑制剂单一或联合作用下小鼠 Qa-2 表达的变化，分析免疫抑制剂种类和剂量对 Qa-2 表达的不同作用，探讨 Qa-2 表达对机体免疫抑制状态的监测价值，以期为指导临床
21、制定个性化治疗方案提供实验依据。 3、动态监测肾移植患者术前和术后不同时间外周血单个核细胞 HLA-G 转录和蛋白水平以及血浆可溶性 HLA-G 表达的变化规律，对比稳定组和排斥组的差异，探讨 HLA-G 对于移植排斥反应的诊断价值、最佳检测方法以及对患者免疫状态的监测作用。 方法： 1建立小鼠皮肤移植动物模型：为研究不同鼠系之间的差别，分别以 SPF 级近交系C57BL/6（简称 C57）和 BALB/C（简称 BA）两种鼠系作为研究对象，分别随机分为正常对照组和手术组，其中手术组又分为自身移植组、同系移植组和异系移植组。为了观察免疫抑制剂的影响，同系和异系移植组又分别分为不用药组和用药组。
22、用药组模拟临床环孢素 A（CsA） 、皮质激素（Horm）及霉酚酸酯（MMF）中等剂量三联用药。手术组采用经典的小鼠背一背皮肤移植手术方法，建立动物模型，术后每天观察皮肤移植物大体改变，记录肉眼排斥时间。每天取移植皮片进行 HE 染色，根据移植物病理组织学改变将其分为排斥反应-级，记录移植物病理排斥进展情况。观察用药和不用药对移植物存活时间和病理组织学改变的影响 2动态检测移植术后 Qa-2 的表达：利用成功建立的小鼠皮肤移植模型，术后每天每组处死 5 只小鼠，采集移植皮片、外周血淋巴细胞和血浆，采用免疫组化、Real-Time 荧光定量 PCR、流式细胞术和 ELISA 等方法动态监测不同组
23、别小鼠移植受者术后不同时间点小鼠 Qa-2 分子在移植物、浸润淋巴细胞、外周血淋巴细胞、血浆中的表达变化，分析上述指标与排斥反应发生和免疫抑制剂应用之间的关系。 3免疫抑制剂对 Qa-2 表达的影响：将SPF 级 C57BL/6 小鼠随机分为对照组、环孢素组、激素组、霉酚酸酯组和联合用药组，其中三种单一用药组又分为低、中低、中等、中高、高共 5 个剂量组，收集外周血淋巴细胞、血浆以及移植物，采用 Real-Time 荧光定量 PCR、流式细胞术、ELISA 及免疫组化等方法检测不同种类、不同剂量免疫抑制剂单一作用或联合作用下小鼠 Qa-2 表达的变化，分析了免疫抑制剂种类和剂量对 Qa-2表达
24、的不同作用，探讨了 Qa-2 表达对机体免疫抑制状态的监测价值，以期为指导临床制定个性化治疗方案提供实验依据。 4肾移植患者 HLA-G 的动态监测：连续收集 57 例肾移植患者（其中术后 32 例肾功能稳定、25 例发生急性排斥反应）术前和术后不同时间（术后 3 天、7 天、2 周、3 周、1 月、2 月、3 月以上）外周血标本。怀疑排斥的患者及时进行肾活检明确诊断，并于冲击治疗前、排斥反应发生后 3 天、7 天、2 周、3 周以上分别收集标本。采用 Real-Time 荧光定量 PCR、流式细胞术和 ELISA 等方法动态检测移植受者外周血淋巴细胞 HLA-G 转录和蛋白水平以及血浆可溶性
25、 HLA-G 表达的变化规律，对比分析稳定组和排斥组的差异，探讨 HLA-G 对于移植排斥反应的诊断价值、最佳检测方法。 结论： 1、通过动态监测移植术后不同时间小鼠 Qa-2 的表达变化规律，首次发现：移植术后早期，尤其是在用药状态下，移植物浸润淋巴细胞、外周血淋巴细胞 Qa-2 表达水平明显下调，发生于淋巴细胞活化的阶段。这一阶段尚未造成严重的移植物损伤，远远早于肉眼排斥的发生。 2、免疫抑制剂可明显提高移植物、浸润淋巴细胞、外周血淋巴细胞 HLA-G 的表达，同时延长移植物存活时间，但过高剂量作用反而有所下降。免疫抑制剂中等剂量联合应用不但可以达到最大限度上调 HLA-G 表达的作用，而
26、且对动物的毒性较小，是最佳选择。 3、临床检测结果显示：肾移植术后外周血 HLA-G 的表达，尤其是 CD4+T 细胞 HLA-G 的动态改变，与免疫抑制剂用药时间和剂量密切相关，并在排斥反应发生时明显下调，有可能成为一种反映移植患者免疫耐受状态和诊断排斥反应发生的无创性检测指标。背景： 器官和组织移植是 20 世纪的医学壮举，为挽救人类生命做出了超乎寻常的贡献。随着组织配型、器官保存、移植手术、术后抗感染等一系列临床技术的不断进步，移植器官的存活率以及患者的生活质量和生存率都得到了很大的提高，使得器官移植成为治疗终末期器官功能衰竭最有效的治疗手段。 然而，移植术后的排斥反应，尤其是急性排斥反
27、应，仍然是导致移植器官功能丧失、甚至患者死亡最主要的原因。尽管移植物局部组织的病理活检可以对排斥反应做出明确诊断，而且一直被公认为是诊断移植排斥反应的金标准，但由于其具有创伤性、容易诱发并发症等缺点，在临床上难以成为常规的检查手段；临床常用的生化学等检查只有在移植器官组织结构明显异常，影响到器官功能时才能做出诊断。而目前研究较多的细胞因子、抗体等检查，则往往由于其准确性、敏感性、特异性方面的不足而无法得到广泛的应用。到目前为止，仍没有一种可以及时、准确诊断排斥反应的公认的检测方法。 在无法准确了解患者免疫状态的情况下，免疫抑制剂是预防排斥反应发生的最有效的手段，但过量的免疫抑制剂往往导致严重感
28、染和肿瘤等恶性疾病的发生。 因此如何通过一种无创性的检测方法准确地反映患者的免疫状态并及时发现、预测排斥反应的发生是移植研究领域一个亟待解决的重大课题。只有这样，才能在预防排斥反应和减少免疫抑制剂用量之间寻找到一个适宜的平衡点，制定个性化的治特别提醒 ：正文内容由 PDF 文件转码生成，如您电脑未有相应转换码，则无法显示正文内容，请您下载相应软件，下载地址为 http:/ 。如还不能显示，可以联系我 q q 1627550258 ，提供原格式文档。我们还可提供代笔服务，价格优惠，服务周到，包您通过。“垐垯櫃 换烫梯葺铑?endstreamendobj2x 滌甸?*U 躆 跦?l, 墀 VGi?
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