1、动物遗传育种与繁殖专业优秀论文 体细胞克隆山羊表观遗传修饰与基因表达特征研究关键词：体细胞克隆 山羊 端粒长度 基因表达 荧光实时定量摘要：尽管体细胞核移植在许多物种中获得成功，但是获得表型正常克隆动物的效率却非常低。供体细胞核的不完全重序被认为是造成克隆胚胎不能正常发育到成年的首要原因。深入探讨成年体细胞克隆动物中潜在的表观遗传修饰机制，将有助于了解关于克隆动物能够正常发育的后成重序界限，强化 SCNT 中相关的伦理观念。本研究以成年体细胞克隆山羊为研究对象，运用同源扩增、PCR克隆测序方法获得山羊印迹基因差异甲基化(DMR)序列，并通过 Southern 杂交、实时定量 RT-PCR、SS
2、CP 等技术，进一步探索了成年克隆山羊印迹基因、DNA 重复序列的甲基化模式，端粒长度以及生长相关印迹基因和非印迹基因的表达特征，深入探讨甲基化对基因表达的调控模式。 1山羊 H19/IGF2 和 IGF2R第 2 内含子 DMR 的克隆测序与分析 本实验根据绵羊的 DNA 序列 AJ566210 保守区域设计引物扩增出山羊 H19 基因第一外显子上游长 4.2kb 的调控区域序列，经生物信息学分析，该序列具有和绵羊、人类和小鼠同样的结构(Genbank 登录号：EF577239)。包含有 4 个锌指蛋白 CTCF 结合位点，分别定位于转录起始部位上游 4079bp()、3646bp()、28
3、66bp()和 1221bp()；4 个 CpG 岛，GC含量分别为 63、65、61和 71；该序列与绵羊的参考序列同源度达93.5。 根据绵羊 DNA 序列 AY182033 保守区域设计引物扩增出山羊 IGF2R第二内含子 DMR 片段，并成功获得上游 809bp 和下游 576bp 序列(中间区域由于GC 含量过高，无法测序；Genbank 登录号：EF577240)。经 BLAST 分析确认，与所参照序列同区域同源度平均为 95.7，GC 含量分别为 76和 67。 2成年体细胞克隆山羊 H19 和 IGF2R 基因 DMR 甲基化状况分析 基因组DNA10g 用 EcoR 和甲基化
4、敏感酶 Sac酶切后，与筛选出的 H19 基因上游特异性探针(地高辛标记)进行 Southern 杂交。结果表明，在 H19 基因上游DMR，成年体细胞克隆山羊甲基化程度均值(1.850.37)与年龄相近的对照组山羊均值(1.530.38)相比，差异不显著；但是就个体而言，克隆山羊只有一只甲基化水平不在对照组均值范围内；卵巢颗粒细胞克隆山羊均值(1.840.39)与皮肤成纤维细胞克隆山羊均值(1.900.47)基本接近，表明不同的供核细胞类型来源并没有对其甲基化状况有什么影响；皮肤成纤维细胞克隆山羊平均值稍低于其供核体山羊。为了检测成年体细胞克隆山羊 IGD2R 第 2 内含子 DMR 的甲基
5、化状态，基因组 DNA10g 用 Hind和甲基化敏感酶 sac酶切，Southem转移后与特异性探针杂交。结果表明，成年克隆山羊甲基化均值(4.461.67)与年龄相近的对照组山羊均值(2.341.28)相比，差异显著，表明成年克隆山羊 IGF2R 基因内含子差异甲基化区域甲基化水平显著高于同龄对照组动物；卵巢颗粒细胞克隆山羊均值(4.541.91)与 2 只皮肤成纤维细胞克隆山羊均值(4.190.99)基本接近，因此，在这个差异甲基化位点上，不同的供核细胞类型并没有对其甲基化状况影响不大；皮肤成纤维细胞克隆山羊平均值则与其核供体山羊的甲基化程度相当。 3成年体细胞克隆山羊小卫星 DNA 重
6、复序列甲基化状况分析 基因组 DNA 5g 平均分成 2 等份，分别用甲基化不敏感内切酶 Msp 消化和甲基化敏感性限制酶 Hpa消化后与人源小卫星探针 33.6 杂交。结果表明，成年体细胞克隆山羊小卫星 DNA 重复序列甲基化程度与自然繁殖山羊相比差异不显著；成纤维细胞克隆山羊甲基化水平(6.171.46)少于颗粒细胞克隆山羊的均值(6.894.15)，也低于其皮肤成纤维细胞供体山羊的7.96，但是颗粒细胞克隆变异系数较高。 4体细胞克隆山羊端粒长度分析 本实验用 TRF 法检测了成年体细胞克隆山羊端粒长度。结果表明，成年克隆山羊耳皮肤组织端粒平均长度与同龄对照相比，差异不显著，但是克隆山羊
7、的变化范围较大；皮肤成纤维克隆山羊端粒长度略大于卵巢颗粒细胞；继代克隆山羊端粒长度略短于对照，但差异不显著。说明核移植以及连续核移植对克隆山羊端粒长度影响不大。 5成年体细胞克隆山羊生长相关印迹基因表达分析 本实验用 Real-time PcR 分析了成年体细胞克隆山羊印迹基因 H19、IGF2 和IGF2R mRNA 表达情况。结果表明，克隆山羊和非克隆山羊 J19 基因和 IGF2 基因的表达并没有显著差异，而 IGFR 基因的表达水平核移植山羊极显著高于普通山羊。2 只皮肤成纤维细胞克隆山羊 H19 和 IGF2 基因的表达明显低于颗粒细胞克隆山羊中的表达量，而 IGF2R 基因的表达在
8、二者中的表达基本相同。同时本实验还 H19 和 IGF2 基因的定量 PCR 产物进行 SSCP 分析，结果表明，二者的单等位表达方式是一致的。 本实验还获得了山羊 IGF2 基因完整编码区和 3非翻译区。分析表明，山羊 IGF2 基因开放阅读框(ORF)长度为 540bp，编码一个 179 氨基酸的蛋白。三种反刍动物相比，山羊 IGF2 DNA 序列与绵羊的同源性(99.47)要高于牛(97.68)。编码的氨基酸序列与绵羊同源性(98.88)也高于牛(96.09)。山羊 IGF2 基因 GenBank 登陆号为 DQ645739。同时还获得山羊H19 和 IGF2R 基因部分序列，GenBa
9、nk 登陆号分别为：DQ666955 和 DQ666954。 6成年体细胞克隆山羊生长相关非印迹基因表达分析 本实验用 Real-time PCR 分析了成年体细胞克隆山羊非印迹基因 IGF1、IGF1R、GHR 和 GHSR mRNA 表达情况。结果表明，克隆山羊和非克隆山羊 IGF1、GHR 和 GHSR 基因的 mRNA 表达量差异不显著，而 IGF1R 基因的表达水平核移植山羊极显著高于普通山羊。本实验同时还获得山羊 IGF1R 基因部分序列，GenBank 登陆号为：DQ666953。正文内容尽管体细胞核移植在许多物种中获得成功，但是获得表型正常克隆动物的效率却非常低。供体细胞核的不
10、完全重序被认为是造成克隆胚胎不能正常发育到成年的首要原因。深入探讨成年体细胞克隆动物中潜在的表观遗传修饰机制，将有助于了解关于克隆动物能够正常发育的后成重序界限，强化 SCNT 中相关的伦理观念。本研究以成年体细胞克隆山羊为研究对象，运用同源扩增、PCR 克隆测序方法获得山羊印迹基因差异甲基化(DMR)序列，并通过 Southern 杂交、实时定量 RT-PCR、SSCP 等技术，进一步探索了成年克隆山羊印迹基因、DNA 重复序列的甲基化模式，端粒长度以及生长相关印迹基因和非印迹基因的表达特征，深入探讨甲基化对基因表达的调控模式。 1山羊 H19/IGF2 和 IGF2R第 2 内含子 DMR
11、 的克隆测序与分析 本实验根据绵羊的 DNA 序列 AJ566210 保守区域设计引物扩增出山羊 H19 基因第一外显子上游长 4.2kb 的调控区域序列，经生物信息学分析，该序列具有和绵羊、人类和小鼠同样的结构(Genbank 登录号：EF577239)。包含有 4 个锌指蛋白 CTCF 结合位点，分别定位于转录起始部位上游 4079bp()、3646bp()、2866bp()和 1221bp()；4 个 CpG 岛，GC含量分别为 63、65、61和 71；该序列与绵羊的参考序列同源度达93.5。 根据绵羊 DNA 序列 AY182033 保守区域设计引物扩增出山羊 IGF2R第二内含子
12、DMR 片段，并成功获得上游 809bp 和下游 576bp 序列(中间区域由于GC 含量过高，无法测序；Genbank 登录号：EF577240)。经 BLAST 分析确认，与所参照序列同区域同源度平均为 95.7，GC 含量分别为 76和 67。 2成年体细胞克隆山羊 H19 和 IGF2R 基因 DMR 甲基化状况分析 基因组DNA10g 用 EcoR 和甲基化敏感酶 Sac酶切后，与筛选出的 H19 基因上游特异性探针(地高辛标记)进行 Southern 杂交。结果表明，在 H19 基因上游DMR，成年体细胞克隆山羊甲基化程度均值(1.850.37)与年龄相近的对照组山羊均值(1.53
13、0.38)相比，差异不显著；但是就个体而言，克隆山羊只有一只甲基化水平不在对照组均值范围内；卵巢颗粒细胞克隆山羊均值(1.840.39)与皮肤成纤维细胞克隆山羊均值(1.900.47)基本接近，表明不同的供核细胞类型来源并没有对其甲基化状况有什么影响；皮肤成纤维细胞克隆山羊平均值稍低于其供核体山羊。为了检测成年体细胞克隆山羊 IGD2R 第 2 内含子 DMR 的甲基化状态，基因组 DNA10g 用 Hind和甲基化敏感酶 sac酶切，Southem转移后与特异性探针杂交。结果表明，成年克隆山羊甲基化均值(4.461.67)与年龄相近的对照组山羊均值(2.341.28)相比，差异显著，表明成年
14、克隆山羊 IGF2R 基因内含子差异甲基化区域甲基化水平显著高于同龄对照组动物；卵巢颗粒细胞克隆山羊均值(4.541.91)与 2 只皮肤成纤维细胞克隆山羊均值(4.190.99)基本接近，因此，在这个差异甲基化位点上，不同的供核细胞类型并没有对其甲基化状况影响不大；皮肤成纤维细胞克隆山羊平均值则与其核供体山羊的甲基化程度相当。 3成年体细胞克隆山羊小卫星 DNA 重复序列甲基化状况分析 基因组 DNA 5g 平均分成 2 等份，分别用甲基化不敏感内切酶 Msp 消化和甲基化敏感性限制酶 Hpa消化后与人源小卫星探针 33.6 杂交。结果表明，成年体细胞克隆山羊小卫星 DNA 重复序列甲基化程
15、度与自然繁殖山羊相比差异不显著；成纤维细胞克隆山羊甲基化水平(6.171.46)少于颗粒细胞克隆山羊的均值(6.894.15)，也低于其皮肤成纤维细胞供体山羊的7.96，但是颗粒细胞克隆变异系数较高。 4体细胞克隆山羊端粒长度分析 本实验用 TRF 法检测了成年体细胞克隆山羊端粒长度。结果表明，成年克隆山羊耳皮肤组织端粒平均长度与同龄对照相比，差异不显著，但是克隆山羊的变化范围较大；皮肤成纤维克隆山羊端粒长度略大于卵巢颗粒细胞；继代克隆山羊端粒长度略短于对照，但差异不显著。说明核移植以及连续核移植对克隆山羊端粒长度影响不大。 5成年体细胞克隆山羊生长相关印迹基因表达分析 本实验用 Real-t
16、ime PcR 分析了成年体细胞克隆山羊印迹基因 H19、IGF2 和IGF2R mRNA 表达情况。结果表明，克隆山羊和非克隆山羊 J19 基因和 IGF2 基因的表达并没有显著差异，而 IGFR 基因的表达水平核移植山羊极显著高于普通山羊。2 只皮肤成纤维细胞克隆山羊 H19 和 IGF2 基因的表达明显低于颗粒细胞克隆山羊中的表达量，而 IGF2R 基因的表达在二者中的表达基本相同。同时本实验还 H19 和 IGF2 基因的定量 PCR 产物进行 SSCP 分析，结果表明，二者的单等位表达方式是一致的。 本实验还获得了山羊 IGF2 基因完整编码区和 3非翻译区。分析表明，山羊 IGF2
17、 基因开放阅读框(ORF)长度为 540bp，编码一个 179 氨基酸的蛋白。三种反刍动物相比，山羊 IGF2 DNA 序列与绵羊的同源性(99.47)要高于牛(97.68)。编码的氨基酸序列与绵羊同源性(98.88)也高于牛(96.09)。山羊 IGF2 基因 GenBank 登陆号为 DQ645739。同时还获得山羊H19 和 IGF2R 基因部分序列，GenBank 登陆号分别为：DQ666955 和 DQ666954。 6成年体细胞克隆山羊生长相关非印迹基因表达分析 本实验用 Real-time PCR 分析了成年体细胞克隆山羊非印迹基因 IGF1、IGF1R、GHR 和 GHSR m
18、RNA 表达情况。结果表明，克隆山羊和非克隆山羊 IGF1、GHR 和 GHSR 基因的 mRNA 表达量差异不显著，而 IGF1R 基因的表达水平核移植山羊极显著高于普通山羊。本实验同时还获得山羊 IGF1R 基因部分序列，GenBank 登陆号为：DQ666953。尽管体细胞核移植在许多物种中获得成功，但是获得表型正常克隆动物的效率却非常低。供体细胞核的不完全重序被认为是造成克隆胚胎不能正常发育到成年的首要原因。深入探讨成年体细胞克隆动物中潜在的表观遗传修饰机制，将有助于了解关于克隆动物能够正常发育的后成重序界限，强化 SCNT 中相关的伦理观念。本研究以成年体细胞克隆山羊为研究对象，运用
19、同源扩增、PCR 克隆测序方法获得山羊印迹基因差异甲基化(DMR)序列，并通过 Southern 杂交、实时定量 RT-PCR、SSCP 等技术，进一步探索了成年克隆山羊印迹基因、DNA 重复序列的甲基化模式，端粒长度以及生长相关印迹基因和非印迹基因的表达特征，深入探讨甲基化对基因表达的调控模式。 1山羊 H19/IGF2 和 IGF2R 第 2 内含子 DMR 的克隆测序与分析 本实验根据绵羊的 DNA 序列 AJ566210 保守区域设计引物扩增出山羊 H19 基因第一外显子上游长 4.2kb 的调控区域序列，经生物信息学分析，该序列具有和绵羊、人类和小鼠同样的结构(Genbank 登录号
20、：EF577239)。包含有 4 个锌指蛋白 CTCF 结合位点，分别定位于转录起始部位上游 4079bp()、3646bp()、2866bp()和 1221bp()；4 个 CpG 岛，GC 含量分别为 63、65、61和 71；该序列与绵羊的参考序列同源度达93.5。 根据绵羊 DNA 序列 AY182033 保守区域设计引物扩增出山羊 IGF2R第二内含子 DMR 片段，并成功获得上游 809bp 和下游 576bp 序列(中间区域由于GC 含量过高，无法测序；Genbank 登录号：EF577240)。经 BLAST 分析确认，与所参照序列同区域同源度平均为 95.7，GC 含量分别为
21、 76和 67。 2成年体细胞克隆山羊 H19 和 IGF2R 基因 DMR 甲基化状况分析 基因组DNA10g 用 EcoR 和甲基化敏感酶 Sac酶切后，与筛选出的 H19 基因上游特异性探针(地高辛标记)进行 Southern 杂交。结果表明，在 H19 基因上游DMR，成年体细胞克隆山羊甲基化程度均值(1.850.37)与年龄相近的对照组山羊均值(1.530.38)相比，差异不显著；但是就个体而言，克隆山羊只有一只甲基化水平不在对照组均值范围内；卵巢颗粒细胞克隆山羊均值(1.840.39)与皮肤成纤维细胞克隆山羊均值(1.900.47)基本接近，表明不同的供核细胞类型来源并没有对其甲基
22、化状况有什么影响；皮肤成纤维细胞克隆山羊平均值稍低于其供核体山羊。为了检测成年体细胞克隆山羊 IGD2R 第 2 内含子 DMR 的甲基化状态，基因组 DNA10g 用 Hind和甲基化敏感酶 sac酶切，Southem转移后与特异性探针杂交。结果表明，成年克隆山羊甲基化均值(4.461.67)与年龄相近的对照组山羊均值(2.341.28)相比，差异显著，表明成年克隆山羊 IGF2R 基因内含子差异甲基化区域甲基化水平显著高于同龄对照组动物；卵巢颗粒细胞克隆山羊均值(4.541.91)与 2 只皮肤成纤维细胞克隆山羊均值(4.190.99)基本接近，因此，在这个差异甲基化位点上，不同的供核细胞
23、类型并没有对其甲基化状况影响不大；皮肤成纤维细胞克隆山羊平均值则与其核供体山羊的甲基化程度相当。 3成年体细胞克隆山羊小卫星 DNA 重复序列甲基化状况分析 基因组 DNA 5g 平均分成 2 等份，分别用甲基化不敏感内切酶 Msp 消化和甲基化敏感性限制酶 Hpa消化后与人源小卫星探针 33.6 杂交。结果表明，成年体细胞克隆山羊小卫星 DNA 重复序列甲基化程度与自然繁殖山羊相比差异不显著；成纤维细胞克隆山羊甲基化水平(6.171.46)少于颗粒细胞克隆山羊的均值(6.894.15)，也低于其皮肤成纤维细胞供体山羊的7.96，但是颗粒细胞克隆变异系数较高。 4体细胞克隆山羊端粒长度分析 本
24、实验用 TRF 法检测了成年体细胞克隆山羊端粒长度。结果表明，成年克隆山羊耳皮肤组织端粒平均长度与同龄对照相比，差异不显著，但是克隆山羊的变化范围较大；皮肤成纤维克隆山羊端粒长度略大于卵巢颗粒细胞；继代克隆山羊端粒长度略短于对照，但差异不显著。说明核移植以及连续核移植对克隆山羊端粒长度影响不大。 5成年体细胞克隆山羊生长相关印迹基因表达分析 本实验用 Real-time PcR 分析了成年体细胞克隆山羊印迹基因 H19、IGF2 和IGF2R mRNA 表达情况。结果表明，克隆山羊和非克隆山羊 J19 基因和 IGF2 基因的表达并没有显著差异，而 IGFR 基因的表达水平核移植山羊极显著高于
25、普通山羊。2 只皮肤成纤维细胞克隆山羊 H19 和 IGF2 基因的表达明显低于颗粒细胞克隆山羊中的表达量，而 IGF2R 基因的表达在二者中的表达基本相同。同时本实验还 H19 和 IGF2 基因的定量 PCR 产物进行 SSCP 分析，结果表明，二者的单等位表达方式是一致的。 本实验还获得了山羊 IGF2 基因完整编码区和 3非翻译区。分析表明，山羊 IGF2 基因开放阅读框(ORF)长度为 540bp，编码一个 179 氨基酸的蛋白。三种反刍动物相比，山羊 IGF2 DNA 序列与绵羊的同源性(99.47)要高于牛(97.68)。编码的氨基酸序列与绵羊同源性(98.88)也高于牛(96.
26、09)。山羊 IGF2 基因 GenBank 登陆号为 DQ645739。同时还获得山羊H19 和 IGF2R 基因部分序列，GenBank 登陆号分别为：DQ666955 和 DQ666954。 6成年体细胞克隆山羊生长相关非印迹基因表达分析 本实验用 Real-time PCR 分析了成年体细胞克隆山羊非印迹基因 IGF1、IGF1R、GHR 和 GHSR mRNA 表达情况。结果表明，克隆山羊和非克隆山羊 IGF1、GHR 和 GHSR 基因的 mRNA 表达量差异不显著，而 IGF1R 基因的表达水平核移植山羊极显著高于普通山羊。本实验同时还获得山羊 IGF1R 基因部分序列，GenB
27、ank 登陆号为：DQ666953。尽管体细胞核移植在许多物种中获得成功，但是获得表型正常克隆动物的效率却非常低。供体细胞核的不完全重序被认为是造成克隆胚胎不能正常发育到成年的首要原因。深入探讨成年体细胞克隆动物中潜在的表观遗传修饰机制，将有助于了解关于克隆动物能够正常发育的后成重序界限，强化 SCNT 中相关的伦理观念。本研究以成年体细胞克隆山羊为研究对象，运用同源扩增、PCR 克隆测序方法获得山羊印迹基因差异甲基化(DMR)序列，并通过 Southern 杂交、实时定量 RT-PCR、SSCP 等技术，进一步探索了成年克隆山羊印迹基因、DNA 重复序列的甲基化模式，端粒长度以及生长相关印迹
28、基因和非印迹基因的表达特征，深入探讨甲基化对基因表达的调控模式。 1山羊 H19/IGF2 和 IGF2R 第 2 内含子 DMR 的克隆测序与分析 本实验根据绵羊的 DNA 序列 AJ566210 保守区域设计引物扩增出山羊 H19 基因第一外显子上游长 4.2kb 的调控区域序列，经生物信息学分析，该序列具有和绵羊、人类和小鼠同样的结构(Genbank 登录号：EF577239)。包含有 4 个锌指蛋白 CTCF 结合位点，分别定位于转录起始部位上游 4079bp()、3646bp()、2866bp()和 1221bp()；4 个 CpG 岛，GC 含量分别为 63、65、61和 71；该
29、序列与绵羊的参考序列同源度达93.5。 根据绵羊 DNA 序列 AY182033 保守区域设计引物扩增出山羊 IGF2R第二内含子 DMR 片段，并成功获得上游 809bp 和下游 576bp 序列(中间区域由于GC 含量过高，无法测序；Genbank 登录号：EF577240)。经 BLAST 分析确认，与所参照序列同区域同源度平均为 95.7，GC 含量分别为 76和 67。 2成年体细胞克隆山羊 H19 和 IGF2R 基因 DMR 甲基化状况分析 基因组DNA10g 用 EcoR 和甲基化敏感酶 Sac酶切后，与筛选出的 H19 基因上游特异性探针(地高辛标记)进行 Southern
30、杂交。结果表明，在 H19 基因上游DMR，成年体细胞克隆山羊甲基化程度均值(1.850.37)与年龄相近的对照组山羊均值(1.530.38)相比，差异不显著；但是就个体而言，克隆山羊只有一只甲基化水平不在对照组均值范围内；卵巢颗粒细胞克隆山羊均值(1.840.39)与皮肤成纤维细胞克隆山羊均值(1.900.47)基本接近，表明不同的供核细胞类型来源并没有对其甲基化状况有什么影响；皮肤成纤维细胞克隆山羊平均值稍低于其供核体山羊。为了检测成年体细胞克隆山羊 IGD2R 第 2 内含子 DMR 的甲基化状态，基因组 DNA10g 用 Hind和甲基化敏感酶 sac酶切，Southem转移后与特异性
31、探针杂交。结果表明，成年克隆山羊甲基化均值(4.461.67)与年龄相近的对照组山羊均值(2.341.28)相比，差异显著，表明成年克隆山羊 IGF2R 基因内含子差异甲基化区域甲基化水平显著高于同龄对照组动物；卵巢颗粒细胞克隆山羊均值(4.541.91)与 2 只皮肤成纤维细胞克隆山羊均值(4.190.99)基本接近，因此，在这个差异甲基化位点上，不同的供核细胞类型并没有对其甲基化状况影响不大；皮肤成纤维细胞克隆山羊平均值则与其核供体山羊的甲基化程度相当。 3成年体细胞克隆山羊小卫星 DNA 重复序列甲基化状况分析 基因组 DNA 5g 平均分成 2 等份，分别用甲基化不敏感内切酶 Msp
32、消化和甲基化敏感性限制酶 Hpa消化后与人源小卫星探针 33.6 杂交。结果表明，成年体细胞克隆山羊小卫星 DNA 重复序列甲基化程度与自然繁殖山羊相比差异不显著；成纤维细胞克隆山羊甲基化水平(6.171.46)少于颗粒细胞克隆山羊的均值(6.894.15)，也低于其皮肤成纤维细胞供体山羊的7.96，但是颗粒细胞克隆变异系数较高。 4体细胞克隆山羊端粒长度分析 本实验用 TRF 法检测了成年体细胞克隆山羊端粒长度。结果表明，成年克隆山羊耳皮肤组织端粒平均长度与同龄对照相比，差异不显著，但是克隆山羊的变化范围较大；皮肤成纤维克隆山羊端粒长度略大于卵巢颗粒细胞；继代克隆山羊端粒长度略短于对照，但差
33、异不显著。说明核移植以及连续核移植对克隆山羊端粒长度影响不大。 5成年体细胞克隆山羊生长相关印迹基因表达分析 本实验用 Real-time PcR 分析了成年体细胞克隆山羊印迹基因 H19、IGF2 和IGF2R mRNA 表达情况。结果表明，克隆山羊和非克隆山羊 J19 基因和 IGF2 基因的表达并没有显著差异，而 IGFR 基因的表达水平核移植山羊极显著高于普通山羊。2 只皮肤成纤维细胞克隆山羊 H19 和 IGF2 基因的表达明显低于颗粒细胞克隆山羊中的表达量，而 IGF2R 基因的表达在二者中的表达基本相同。同时本实验还 H19 和 IGF2 基因的定量 PCR 产物进行 SSCP
34、分析，结果表明，二者的单等位表达方式是一致的。 本实验还获得了山羊 IGF2 基因完整编码区和 3非翻译区。分析表明，山羊 IGF2 基因开放阅读框(ORF)长度为 540bp，编码一个 179 氨基酸的蛋白。三种反刍动物相比，山羊 IGF2 DNA 序列与绵羊的同源性(99.47)要高于牛(97.68)。编码的氨基酸序列与绵羊同源性(98.88)也高于牛(96.09)。山羊 IGF2 基因 GenBank 登陆号为 DQ645739。同时还获得山羊H19 和 IGF2R 基因部分序列，GenBank 登陆号分别为：DQ666955 和 DQ666954。 6成年体细胞克隆山羊生长相关非印迹基
35、因表达分析 本实验用 Real-time PCR 分析了成年体细胞克隆山羊非印迹基因 IGF1、IGF1R、GHR 和 GHSR mRNA 表达情况。结果表明，克隆山羊和非克隆山羊 IGF1、GHR 和 GHSR 基因的 mRNA 表达量差异不显著，而 IGF1R 基因的表达水平核移植山羊极显著高于普通山羊。本实验同时还获得山羊 IGF1R 基因部分序列，GenBank 登陆号为：DQ666953。尽管体细胞核移植在许多物种中获得成功，但是获得表型正常克隆动物的效率却非常低。供体细胞核的不完全重序被认为是造成克隆胚胎不能正常发育到成年的首要原因。深入探讨成年体细胞克隆动物中潜在的表观遗传修饰机
36、制，将有助于了解关于克隆动物能够正常发育的后成重序界限，强化 SCNT 中相关的伦理观念。本研究以成年体细胞克隆山羊为研究对象，运用同源扩增、PCR 克隆测序方法获得山羊印迹基因差异甲基化(DMR)序列，并通过 Southern 杂交、实时定量 RT-PCR、SSCP 等技术，进一步探索了成年克隆山羊印迹基因、DNA 重复序列的甲基化模式，端粒长度以及生长相关印迹基因和非印迹基因的表达特征，深入探讨甲基化对基因表达的调控模式。 1山羊 H19/IGF2 和 IGF2R 第 2 内含子 DMR 的克隆测序与分析 本实验根据绵羊的 DNA 序列 AJ566210 保守区域设计引物扩增出山羊 H19
37、 基因第一外显子上游长 4.2kb 的调控区域序列，经生物信息学分析，该序列具有和绵羊、人类和小鼠同样的结构(Genbank 登录号：EF577239)。包含有 4 个锌指蛋白 CTCF 结合位点，分别定位于转录起始部位上游 4079bp()、3646bp()、2866bp()和 1221bp()；4 个 CpG 岛，GC 含量分别为 63、65、61和 71；该序列与绵羊的参考序列同源度达93.5。 根据绵羊 DNA 序列 AY182033 保守区域设计引物扩增出山羊 IGF2R第二内含子 DMR 片段，并成功获得上游 809bp 和下游 576bp 序列(中间区域由于GC 含量过高，无法测
38、序；Genbank 登录号：EF577240)。经 BLAST 分析确认，与所参照序列同区域同源度平均为 95.7，GC 含量分别为 76和 67。 2成年体细胞克隆山羊 H19 和 IGF2R 基因 DMR 甲基化状况分析 基因组DNA10g 用 EcoR 和甲基化敏感酶 Sac酶切后，与筛选出的 H19 基因上游特异性探针(地高辛标记)进行 Southern 杂交。结果表明，在 H19 基因上游DMR，成年体细胞克隆山羊甲基化程度均值(1.850.37)与年龄相近的对照组山羊均值(1.530.38)相比，差异不显著；但是就个体而言，克隆山羊只有一只甲基化水平不在对照组均值范围内；卵巢颗粒细
39、胞克隆山羊均值(1.840.39)与皮肤成纤维细胞克隆山羊均值(1.900.47)基本接近，表明不同的供核细胞类型来源并没有对其甲基化状况有什么影响；皮肤成纤维细胞克隆山羊平均值稍低于其供核体山羊。为了检测成年体细胞克隆山羊 IGD2R 第 2 内含子 DMR 的甲基化状态，基因组 DNA10g 用 Hind和甲基化敏感酶 sac酶切，Southem转移后与特异性探针杂交。结果表明，成年克隆山羊甲基化均值(4.461.67)与年龄相近的对照组山羊均值(2.341.28)相比，差异显著，表明成年克隆山羊 IGF2R 基因内含子差异甲基化区域甲基化水平显著高于同龄对照组动物；卵巢颗粒细胞克隆山羊均
40、值(4.541.91)与 2 只皮肤成纤维细胞克隆山羊均值(4.190.99)基本接近，因此，在这个差异甲基化位点上，不同的供核细胞类型并没有对其甲基化状况影响不大；皮肤成纤维细胞克隆山羊平均值则与其核供体山羊的甲基化程度相当。 3成年体细胞克隆山羊小卫星 DNA 重复序列甲基化状况分析 基因组 DNA 5g 平均分成 2 等份，分别用甲基化不敏感内切酶 Msp 消化和甲基化敏感性限制酶 Hpa消化后与人源小卫星探针 33.6 杂交。结果表明，成年体细胞克隆山羊小卫星 DNA 重复序列甲基化程度与自然繁殖山羊相比差异不显著；成纤维细胞克隆山羊甲基化水平(6.171.46)少于颗粒细胞克隆山羊的
41、均值(6.894.15)，也低于其皮肤成纤维细胞供体山羊的7.96，但是颗粒细胞克隆变异系数较高。 4体细胞克隆山羊端粒长度分析 本实验用 TRF 法检测了成年体细胞克隆山羊端粒长度。结果表明，成年克隆山羊耳皮肤组织端粒平均长度与同龄对照相比，差异不显著，但是克隆山羊的变化范围较大；皮肤成纤维克隆山羊端粒长度略大于卵巢颗粒细胞；继代克隆山羊端粒长度略短于对照，但差异不显著。说明核移植以及连续核移植对克隆山羊端粒长度影响不大。 5成年体细胞克隆山羊生长相关印迹基因表达分析 本实验用 Real-time PcR 分析了成年体细胞克隆山羊印迹基因 H19、IGF2 和IGF2R mRNA 表达情况。
42、结果表明，克隆山羊和非克隆山羊 J19 基因和 IGF2 基因的表达并没有显著差异，而 IGFR 基因的表达水平核移植山羊极显著高于普通山羊。2 只皮肤成纤维细胞克隆山羊 H19 和 IGF2 基因的表达明显低于颗粒细胞克隆山羊中的表达量，而 IGF2R 基因的表达在二者中的表达基本相同。同时本实验还 H19 和 IGF2 基因的定量 PCR 产物进行 SSCP 分析，结果表明，二者的单等位表达方式是一致的。 本实验还获得了山羊 IGF2 基因完整编码区和 3非翻译区。分析表明，山羊 IGF2 基因开放阅读框(ORF)长度为 540bp，编码一个 179 氨基酸的蛋白。三种反刍动物相比，山羊
43、IGF2 DNA 序列与绵羊的同源性(99.47)要高于牛(97.68)。编码的氨基酸序列与绵羊同源性(98.88)也高于牛(96.09)。山羊 IGF2 基因 GenBank 登陆号为 DQ645739。同时还获得山羊H19 和 IGF2R 基因部分序列，GenBank 登陆号分别为：DQ666955 和 DQ666954。 6成年体细胞克隆山羊生长相关非印迹基因表达分析 本实验用 Real-time PCR 分析了成年体细胞克隆山羊非印迹基因 IGF1、IGF1R、GHR 和 GHSR mRNA 表达情况。结果表明，克隆山羊和非克隆山羊 IGF1、GHR 和 GHSR 基因的 mRNA 表
44、达量差异不显著，而 IGF1R 基因的表达水平核移植山羊极显著高于普通山羊。本实验同时还获得山羊 IGF1R 基因部分序列，GenBank 登陆号为：DQ666953。尽管体细胞核移植在许多物种中获得成功，但是获得表型正常克隆动物的效率却非常低。供体细胞核的不完全重序被认为是造成克隆胚胎不能正常发育到成年的首要原因。深入探讨成年体细胞克隆动物中潜在的表观遗传修饰机制，将有助于了解关于克隆动物能够正常发育的后成重序界限，强化 SCNT 中相关的伦理观念。本研究以成年体细胞克隆山羊为研究对象，运用同源扩增、PCR 克隆测序方法获得山羊印迹基因差异甲基化(DMR)序列，并通过 Southern 杂交
45、、实时定量 RT-PCR、SSCP 等技术，进一步探索了成年克隆山羊印迹基因、DNA 重复序列的甲基化模式，端粒长度以及生长相关印迹基因和非印迹基因的表达特征，深入探讨甲基化对基因表达的调控模式。 1山羊 H19/IGF2 和 IGF2R 第 2 内含子 DMR 的克隆测序与分析 本实验根据绵羊的 DNA 序列 AJ566210 保守区域设计引物扩增出山羊 H19 基因第一外显子上游长 4.2kb 的调控区域序列，经生物信息学分析，该序列具有和绵羊、人类和小鼠同样的结构(Genbank 登录号：EF577239)。包含有 4 个锌指蛋白 CTCF 结合位点，分别定位于转录起始部位上游 4079
46、bp()、3646bp()、2866bp()和 1221bp()；4 个 CpG 岛，GC 含量分别为 63、65、61和 71；该序列与绵羊的参考序列同源度达93.5。 根据绵羊 DNA 序列 AY182033 保守区域设计引物扩增出山羊 IGF2R第二内含子 DMR 片段，并成功获得上游 809bp 和下游 576bp 序列(中间区域由于GC 含量过高，无法测序；Genbank 登录号：EF577240)。经 BLAST 分析确认，与所参照序列同区域同源度平均为 95.7，GC 含量分别为 76和 67。 2成年体细胞克隆山羊 H19 和 IGF2R 基因 DMR 甲基化状况分析 基因组D
47、NA10g 用 EcoR 和甲基化敏感酶 Sac酶切后，与筛选出的 H19 基因上游特异性探针(地高辛标记)进行 Southern 杂交。结果表明，在 H19 基因上游DMR，成年体细胞克隆山羊甲基化程度均值(1.850.37)与年龄相近的对照组山羊均值(1.530.38)相比，差异不显著；但是就个体而言，克隆山羊只有一只甲基化水平不在对照组均值范围内；卵巢颗粒细胞克隆山羊均值(1.840.39)与皮肤成纤维细胞克隆山羊均值(1.900.47)基本接近，表明不同的供核细胞类型来源并没有对其甲基化状况有什么影响；皮肤成纤维细胞克隆山羊平均值稍低于其供核体山羊。为了检测成年体细胞克隆山羊 IGD2
48、R 第 2 内含子 DMR 的甲基化状态，基因组 DNA10g 用 Hind和甲基化敏感酶 sac酶切，Southem转移后与特异性探针杂交。结果表明，成年克隆山羊甲基化均值(4.461.67)与年龄相近的对照组山羊均值(2.341.28)相比，差异显著，表明成年克隆山羊 IGF2R 基因内含子差异甲基化区域甲基化水平显著高于同龄对照组动物；卵巢颗粒细胞克隆山羊均值(4.541.91)与 2 只皮肤成纤维细胞克隆山羊均值(4.190.99)基本接近，因此，在这个差异甲基化位点上，不同的供核细胞类型并没有对其甲基化状况影响不大；皮肤成纤维细胞克隆山羊平均值则与其核供体山羊的甲基化程度相当。 3成年体细胞克隆山羊小卫星 DNA 重复序列甲基化状况分析 基因组 DNA 5g 平均分成 2 等份，分别用甲基化不敏感内切酶 Msp 消化和甲基化敏感性限制酶 Hpa消化后与人源小卫星探针 33.6 杂交。结果表明，成年体细胞克隆山羊小卫星 DNA 重复序列甲基化程度与自然繁殖山羊相比差异不显著；成纤维细胞克隆山羊甲基化水平(6.171.46)少于颗粒细胞克隆山羊的均值(6.894.15)，也低于其皮肤成纤维细胞供体山羊的7.96，但是颗粒细胞克隆变异系数较高。 4体细胞克隆山羊端粒长度分析 本实验用 TRF 法检测了成年体细胞克隆山羊端粒长度。结
