1、免疫学专业优秀论文 乙型肝炎病毒感染小鼠模型的建立关键词：乙型病毒性肝炎 动物模型 水动力转染 噬菌体整合酶 致病机制 抗病毒治疗摘要：乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)感染是全球范围影响健康的重要问题，慢性感染人群存在肝硬化和肝细胞癌的高患病风险。尽管乙型肝炎病毒疫苗有效，但是在世界范围内慢性感染人数超过了 3.5 亿，占全球人数的5。HBV 感染具有宿主特异性，在自然情况下，HBV 不感染医学研究中常用的实验小动物。乙型肝炎病毒生物学研究未完全阐明，缺乏理想的小动物模型给疾病的治疗和研究带来困难。 针对上述问题确立本课题的研究目的：基于水动力转染技术和/或噬菌体整合
2、酶系统，建立 HBV 急性感染小鼠模型和 HBV 小鼠体内长期表达模型，用于 HBV 致病机制研究以及抗 HBV 药物在体内筛选与评价。具体研究内容如下： 1真核表达质粒的构建与鉴定 以真核表达载体pCI-neo 为构架，将 1.3 倍长 HBV 全基因组连接在不同真核表达载体中，构建HBV 全基因组重组质粒 pCI-neo-AerApoEAATP-HBV1.3 和 pCI-neo-CMV-HBV1.3。 2急性 HBV 感染小鼠模型的建立 水动力转染方法将 HBV 表达质粒转染Balb/c 小鼠(免疫系统正常小鼠)和 Balb/c 裸鼠(免疫系统缺陷小鼠)体内，观察 HBV 在小鼠体内复制和
3、表达情况。 结果表明，HBV 在小鼠体内转录出相应病毒 mRNA。通过免疫组织化学和血清 ELISA 方法，分析 HBV 在小鼠模型中的表达和分泌特征。小鼠肝细胞中表达的病毒蛋白可分泌入血，急性期第 3 天Balb/c 小鼠血清中 HBsAg 检出率为 100，但 HBsAg 的存在时间和水平并不相同，具有较明显的个体差异，持续表达时间约为 7 天，同时在两周后检测到抗-HBs；Balb/c 裸鼠血清中 HBsAg 持续阳性约为 30 天。采用血清 real-time PCR的方法，分析了急性感染小鼠体内 HBV 的复制和分泌特征。小鼠血清中存在HBV DNA，在急性期其含量明显高于临床患者阳
4、性标准(10lt;#39;3gt;copies/ml)，在第 3 天最高可达到10lt;#39;7gt;copies/ml。Balb/c 小鼠体内 HBV DNA 在 30 天后降至阳性临界值以下，Balb/c 裸鼠可以维持 45 天左右。血清中 HBV DNA 的定量检测简便准确，是用于评价抗病毒药物治疗效果的重要指标之一。无论是HBV 感染 Balb/c 小鼠还是 Balb/c 裸鼠，HBV 在小鼠体内皆为瞬时表达，表达时间比较短。在此基础上为了延长 HBV 在小鼠体内的表达时间，本课题提出水动力转染技术结合噬菌体整合酶系统建立长期表达 HBV 小鼠模型的设想。 3HBV 小鼠体内长期表达
5、模型的建立 噬菌体 C31 整合酶能识别噬菌体的attP 位点和宿主基因组上的 attB 位点，由于 attP 位点和 attB 位点是同源序列，通过整合酶介导同源序列之间的位点特异性重组，从而将噬菌体基因组整合到细菌染色体上。最近研究发现小鼠肝脏细胞染色体上存在两个被噬菌体整合酶识别的 attP 同源序列 mpsL1 和 mpsL2，因此可通过在目的基因表达框架上添加整合酶作用靶序列 attB 位点，在整合酶作用下，使外源基因在小鼠体细胞基因组特异位点进行整合，实现目的基因在小鼠体细胞内长期稳定表达。 在己构建的含 HBV1.3 基因组的质粒启动子前分别插入噬菌体整合酶识别位点attB，得到
6、含整合酶识别位点 attB 的质粒 pCI-neo-attB-AerApoEAATP-HBV1.3和 pCI-neo-attB-CMV-HBV1.3 应用水动力转染技术分别将此载体与整合酶表达质粒 pCMV-Int 共转染 Balb/c 小鼠肝脏，观察 HBV 在小鼠体内肝脏表达强度和持续时间。 结果表明，HBV 在小鼠肝脏中转录出相应病毒 mRNA。转染 45 天后小鼠肝细胞中仍表达 HBcAg 病毒蛋白，同时小鼠肝细胞中表达的病毒蛋白可分泌入血，HBsAg 表达时间比急性感染小鼠模型明显延长，第 30 天仍持续阳性。血清 real-time PCR 的方法，分析了小鼠血清中存在的 HBV
7、DNA，其含量(10lt;#39;7gt;copies/ml)明显高于临床患者阳性标准，在血清中的存在时间明显长于急性感染小鼠模型，在转染后 100 天时仍然在临床规定的阳性水平之上。 由于 HBV 在该小鼠模型体内表达时间较急性感染组明显延长，所以对噬菌体整合酶在小鼠体内的作用进行了鉴定。 针对小鼠染色体上特异性整合位点中热点-mpsLlt;,1gt;设计引物，利用巢式 PCR 鉴定目的基因在小鼠染色体上的整合位点，PCR 鉴定和测序结果正确；同时也鉴定出了 HBV 在体内的中间复制模板 cccDNA，证明 HBV 表达质粒通过特异性位点已经整合到小鼠染色体上，并能在小鼠体内复制。 选用临床
8、上常用的两种抗病毒药物恩替卡韦和拉米夫定对该模型用于抗 HBV 药物的筛选和评价的可行性进行了初步探讨，结果显示，用药前后血清 HBVDNA 在有显著变化，进一步的评估还在进行之中。 综上所述，本研究初步建立 HBV 急性感染小鼠模型和 HBV小鼠体内长期表达模型，为 HBV 发病机制的探讨、药物筛选及抗病毒治疗的研究奠定了一定基础。正文内容乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)感染是全球范围影响健康的重要问题，慢性感染人群存在肝硬化和肝细胞癌的高患病风险。尽管乙型肝炎病毒疫苗有效，但是在世界范围内慢性感染人数超过了 3.5 亿，占全球人数的5。HBV 感染具有宿主特异性，
9、在自然情况下，HBV 不感染医学研究中常用的实验小动物。乙型肝炎病毒生物学研究未完全阐明，缺乏理想的小动物模型给疾病的治疗和研究带来困难。 针对上述问题确立本课题的研究目的：基于水动力转染技术和/或噬菌体整合酶系统，建立 HBV 急性感染小鼠模型和 HBV 小鼠体内长期表达模型，用于 HBV 致病机制研究以及抗 HBV 药物在体内筛选与评价。具体研究内容如下： 1真核表达质粒的构建与鉴定 以真核表达载体pCI-neo 为构架，将 1.3 倍长 HBV 全基因组连接在不同真核表达载体中，构建HBV 全基因组重组质粒 pCI-neo-AerApoEAATP-HBV1.3 和 pCI-neo-CMV
10、-HBV1.3。 2急性 HBV 感染小鼠模型的建立 水动力转染方法将 HBV 表达质粒转染Balb/c 小鼠(免疫系统正常小鼠)和 Balb/c 裸鼠(免疫系统缺陷小鼠)体内，观察 HBV 在小鼠体内复制和表达情况。 结果表明，HBV 在小鼠体内转录出相应病毒 mRNA。通过免疫组织化学和血清 ELISA 方法，分析 HBV 在小鼠模型中的表达和分泌特征。小鼠肝细胞中表达的病毒蛋白可分泌入血，急性期第 3 天Balb/c 小鼠血清中 HBsAg 检出率为 100，但 HBsAg 的存在时间和水平并不相同，具有较明显的个体差异，持续表达时间约为 7 天，同时在两周后检测到抗-HBs；Balb/
11、c 裸鼠血清中 HBsAg 持续阳性约为 30 天。采用血清 real-time PCR的方法，分析了急性感染小鼠体内 HBV 的复制和分泌特征。小鼠血清中存在HBV DNA，在急性期其含量明显高于临床患者阳性标准(10lt;#39;3gt;copies/ml)，在第 3 天最高可达到10lt;#39;7gt;copies/ml。Balb/c 小鼠体内 HBV DNA 在 30 天后降至阳性临界值以下，Balb/c 裸鼠可以维持 45 天左右。血清中 HBV DNA 的定量检测简便准确，是用于评价抗病毒药物治疗效果的重要指标之一。无论是HBV 感染 Balb/c 小鼠还是 Balb/c 裸鼠，
12、HBV 在小鼠体内皆为瞬时表达，表达时间比较短。在此基础上为了延长 HBV 在小鼠体内的表达时间，本课题提出水动力转染技术结合噬菌体整合酶系统建立长期表达 HBV 小鼠模型的设想。 3HBV 小鼠体内长期表达模型的建立 噬菌体 C31 整合酶能识别噬菌体的attP 位点和宿主基因组上的 attB 位点，由于 attP 位点和 attB 位点是同源序列，通过整合酶介导同源序列之间的位点特异性重组，从而将噬菌体基因组整合到细菌染色体上。最近研究发现小鼠肝脏细胞染色体上存在两个被噬菌体整合酶识别的 attP 同源序列 mpsL1 和 mpsL2，因此可通过在目的基因表达框架上添加整合酶作用靶序列 a
13、ttB 位点，在整合酶作用下，使外源基因在小鼠体细胞基因组特异位点进行整合，实现目的基因在小鼠体细胞内长期稳定表达。 在己构建的含 HBV1.3 基因组的质粒启动子前分别插入噬菌体整合酶识别位点attB，得到含整合酶识别位点 attB 的质粒 pCI-neo-attB-AerApoEAATP-HBV1.3和 pCI-neo-attB-CMV-HBV1.3 应用水动力转染技术分别将此载体与整合酶表达质粒 pCMV-Int 共转染 Balb/c 小鼠肝脏，观察 HBV 在小鼠体内肝脏表达强度和持续时间。 结果表明，HBV 在小鼠肝脏中转录出相应病毒 mRNA。转染 45 天后小鼠肝细胞中仍表达 H
14、BcAg 病毒蛋白，同时小鼠肝细胞中表达的病毒蛋白可分泌入血，HBsAg 表达时间比急性感染小鼠模型明显延长，第 30 天仍持续阳性。血清 real-time PCR 的方法，分析了小鼠血清中存在的 HBV DNA，其含量(10lt;#39;7gt;copies/ml)明显高于临床患者阳性标准，在血清中的存在时间明显长于急性感染小鼠模型，在转染后 100 天时仍然在临床规定的阳性水平之上。 由于 HBV 在该小鼠模型体内表达时间较急性感染组明显延长，所以对噬菌体整合酶在小鼠体内的作用进行了鉴定。 针对小鼠染色体上特异性整合位点中热点-mpsLlt;,1gt;设计引物，利用巢式 PCR 鉴定目的
15、基因在小鼠染色体上的整合位点，PCR 鉴定和测序结果正确；同时也鉴定出了 HBV 在体内的中间复制模板 cccDNA，证明 HBV 表达质粒通过特异性位点已经整合到小鼠染色体上，并能在小鼠体内复制。 选用临床上常用的两种抗病毒药物恩替卡韦和拉米夫定对该模型用于抗 HBV 药物的筛选和评价的可行性进行了初步探讨，结果显示，用药前后血清 HBVDNA 在有显著变化，进一步的评估还在进行之中。 综上所述，本研究初步建立 HBV 急性感染小鼠模型和 HBV小鼠体内长期表达模型，为 HBV 发病机制的探讨、药物筛选及抗病毒治疗的研究奠定了一定基础。乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV
16、)感染是全球范围影响健康的重要问题，慢性感染人群存在肝硬化和肝细胞癌的高患病风险。尽管乙型肝炎病毒疫苗有效，但是在世界范围内慢性感染人数超过了 3.5 亿，占全球人数的 5。HBV 感染具有宿主特异性，在自然情况下，HBV 不感染医学研究中常用的实验小动物。乙型肝炎病毒生物学研究未完全阐明，缺乏理想的小动物模型给疾病的治疗和研究带来困难。 针对上述问题确立本课题的研究目的：基于水动力转染技术和/或噬菌体整合酶系统，建立 HBV 急性感染小鼠模型和 HBV 小鼠体内长期表达模型，用于 HBV 致病机制研究以及抗 HBV 药物在体内筛选与评价。具体研究内容如下： 1真核表达质粒的构建与鉴定 以真核
17、表达载体 pCI-neo 为构架，将 1.3 倍长 HBV 全基因组连接在不同真核表达载体中，构建 HBV 全基因组重组质粒 pCI-neo-AerApoEAATP-HBV1.3 和 pCI-neo-CMV-HBV1.3。 2急性 HBV感染小鼠模型的建立 水动力转染方法将 HBV 表达质粒转染 Balb/c 小鼠(免疫系统正常小鼠)和 Balb/c 裸鼠(免疫系统缺陷小鼠)体内，观察 HBV 在小鼠体内复制和表达情况。 结果表明，HBV 在小鼠体内转录出相应病毒 mRNA。通过免疫组织化学和血清 ELISA 方法，分析 HBV 在小鼠模型中的表达和分泌特征。小鼠肝细胞中表达的病毒蛋白可分泌入
18、血，急性期第 3 天 Balb/c 小鼠血清中HBsAg 检出率为 100，但 HBsAg 的存在时间和水平并不相同，具有较明显的个体差异，持续表达时间约为 7 天，同时在两周后检测到抗-HBs；Balb/c 裸鼠血清中 HBsAg 持续阳性约为 30 天。采用血清 real-time PCR 的方法，分析了急性感染小鼠体内 HBV 的复制和分泌特征。小鼠血清中存在 HBV DNA，在急性期其含量明显高于临床患者阳性标准(10lt;#39;3gt;copies/ml)，在第 3 天最高可达到 10lt;#39;7gt;copies/ml。Balb/c 小鼠体内 HBV DNA 在 30 天后降
19、至阳性临界值以下，Balb/c 裸鼠可以维持 45 天左右。血清中 HBV DNA 的定量检测简便准确，是用于评价抗病毒药物治疗效果的重要指标之一。无论是 HBV 感染 Balb/c 小鼠还是 Balb/c 裸鼠，HBV 在小鼠体内皆为瞬时表达，表达时间比较短。在此基础上为了延长 HBV 在小鼠体内的表达时间，本课题提出水动力转染技术结合噬菌体整合酶系统建立长期表达 HBV 小鼠模型的设想。 3HBV 小鼠体内长期表达模型的建立 噬菌体 C31 整合酶能识别噬菌体的 attP 位点和宿主基因组上的 attB 位点，由于 attP 位点和attB 位点是同源序列，通过整合酶介导同源序列之间的位点
20、特异性重组，从而将噬菌体基因组整合到细菌染色体上。最近研究发现小鼠肝脏细胞染色体上存在两个被噬菌体整合酶识别的 attP 同源序列 mpsL1 和 mpsL2，因此可通过在目的基因表达框架上添加整合酶作用靶序列 attB 位点，在整合酶作用下，使外源基因在小鼠体细胞基因组特异位点进行整合，实现目的基因在小鼠体细胞内长期稳定表达。 在己构建的含 HBV1.3 基因组的质粒启动子前分别插入噬菌体整合酶识别位点 attB，得到含整合酶识别位点 attB 的质粒 pCI-neo-attB-AerApoEAATP-HBV1.3 和 pCI-neo-attB-CMV-HBV1.3 应用水动力转染技术分别将
21、此载体与整合酶表达质粒 pCMV-Int 共转染 Balb/c 小鼠肝脏，观察 HBV 在小鼠体内肝脏表达强度和持续时间。 结果表明，HBV 在小鼠肝脏中转录出相应病毒 mRNA。转染 45 天后小鼠肝细胞中仍表达 HBcAg 病毒蛋白，同时小鼠肝细胞中表达的病毒蛋白可分泌入血，HBsAg 表达时间比急性感染小鼠模型明显延长，第 30 天仍持续阳性。血清 real-time PCR 的方法，分析了小鼠血清中存在的HBV DNA，其含量(10lt;#39;7gt;copies/ml)明显高于临床患者阳性标准，在血清中的存在时间明显长于急性感染小鼠模型，在转染后 100天时仍然在临床规定的阳性水平
22、之上。 由于 HBV 在该小鼠模型体内表达时间较急性感染组明显延长，所以对噬菌体整合酶在小鼠体内的作用进行了鉴定。 针对小鼠染色体上特异性整合位点中热点-mpsLlt;,1gt;设计引物，利用巢式 PCR 鉴定目的基因在小鼠染色体上的整合位点，PCR 鉴定和测序结果正确；同时也鉴定出了 HBV 在体内的中间复制模板 cccDNA，证明 HBV 表达质粒通过特异性位点已经整合到小鼠染色体上，并能在小鼠体内复制。 选用临床上常用的两种抗病毒药物恩替卡韦和拉米夫定对该模型用于抗 HBV 药物的筛选和评价的可行性进行了初步探讨，结果显示，用药前后血清 HBVDNA 在有显著变化，进一步的评估还在进行之
23、中。 综上所述，本研究初步建立 HBV 急性感染小鼠模型和 HBV 小鼠体内长期表达模型，为 HBV 发病机制的探讨、药物筛选及抗病毒治疗的研究奠定了一定基础。乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)感染是全球范围影响健康的重要问题，慢性感染人群存在肝硬化和肝细胞癌的高患病风险。尽管乙型肝炎病毒疫苗有效，但是在世界范围内慢性感染人数超过了 3.5 亿，占全球人数的 5。HBV 感染具有宿主特异性，在自然情况下，HBV 不感染医学研究中常用的实验小动物。乙型肝炎病毒生物学研究未完全阐明，缺乏理想的小动物模型给疾病的治疗和研究带来困难。 针对上述问题确立本课题的研究目的：基于水动
24、力转染技术和/或噬菌体整合酶系统，建立 HBV 急性感染小鼠模型和 HBV 小鼠体内长期表达模型，用于 HBV 致病机制研究以及抗 HBV 药物在体内筛选与评价。具体研究内容如下： 1真核表达质粒的构建与鉴定 以真核表达载体 pCI-neo 为构架，将 1.3 倍长 HBV 全基因组连接在不同真核表达载体中，构建 HBV 全基因组重组质粒 pCI-neo-AerApoEAATP-HBV1.3 和 pCI-neo-CMV-HBV1.3。 2急性 HBV感染小鼠模型的建立 水动力转染方法将 HBV 表达质粒转染 Balb/c 小鼠(免疫系统正常小鼠)和 Balb/c 裸鼠(免疫系统缺陷小鼠)体内，
25、观察 HBV 在小鼠体内复制和表达情况。 结果表明，HBV 在小鼠体内转录出相应病毒 mRNA。通过免疫组织化学和血清 ELISA 方法，分析 HBV 在小鼠模型中的表达和分泌特征。小鼠肝细胞中表达的病毒蛋白可分泌入血，急性期第 3 天 Balb/c 小鼠血清中HBsAg 检出率为 100，但 HBsAg 的存在时间和水平并不相同，具有较明显的个体差异，持续表达时间约为 7 天，同时在两周后检测到抗-HBs；Balb/c 裸鼠血清中 HBsAg 持续阳性约为 30 天。采用血清 real-time PCR 的方法，分析了急性感染小鼠体内 HBV 的复制和分泌特征。小鼠血清中存在 HBV DNA
26、，在急性期其含量明显高于临床患者阳性标准(10lt;#39;3gt;copies/ml)，在第 3 天最高可达到 10lt;#39;7gt;copies/ml。Balb/c 小鼠体内 HBV DNA 在 30 天后降至阳性临界值以下，Balb/c 裸鼠可以维持 45 天左右。血清中 HBV DNA 的定量检测简便准确，是用于评价抗病毒药物治疗效果的重要指标之一。无论是 HBV 感染 Balb/c 小鼠还是 Balb/c 裸鼠，HBV 在小鼠体内皆为瞬时表达，表达时间比较短。在此基础上为了延长 HBV 在小鼠体内的表达时间，本课题提出水动力转染技术结合噬菌体整合酶系统建立长期表达 HBV 小鼠模
27、型的设想。 3HBV 小鼠体内长期表达模型的建立 噬菌体 C31 整合酶能识别噬菌体的 attP 位点和宿主基因组上的 attB 位点，由于 attP 位点和attB 位点是同源序列，通过整合酶介导同源序列之间的位点特异性重组，从而将噬菌体基因组整合到细菌染色体上。最近研究发现小鼠肝脏细胞染色体上存在两个被噬菌体整合酶识别的 attP 同源序列 mpsL1 和 mpsL2，因此可通过在目的基因表达框架上添加整合酶作用靶序列 attB 位点，在整合酶作用下，使外源基因在小鼠体细胞基因组特异位点进行整合，实现目的基因在小鼠体细胞内长期稳定表达。 在己构建的含 HBV1.3 基因组的质粒启动子前分别
28、插入噬菌体整合酶识别位点 attB，得到含整合酶识别位点 attB 的质粒 pCI-neo-attB-AerApoEAATP-HBV1.3 和 pCI-neo-attB-CMV-HBV1.3 应用水动力转染技术分别将此载体与整合酶表达质粒 pCMV-Int 共转染 Balb/c 小鼠肝脏，观察 HBV 在小鼠体内肝脏表达强度和持续时间。 结果表明，HBV 在小鼠肝脏中转录出相应病毒 mRNA。转染 45 天后小鼠肝细胞中仍表达 HBcAg 病毒蛋白，同时小鼠肝细胞中表达的病毒蛋白可分泌入血，HBsAg 表达时间比急性感染小鼠模型明显延长，第 30 天仍持续阳性。血清 real-time PCR
29、 的方法，分析了小鼠血清中存在的HBV DNA，其含量(10lt;#39;7gt;copies/ml)明显高于临床患者阳性标准，在血清中的存在时间明显长于急性感染小鼠模型，在转染后 100天时仍然在临床规定的阳性水平之上。 由于 HBV 在该小鼠模型体内表达时间较急性感染组明显延长，所以对噬菌体整合酶在小鼠体内的作用进行了鉴定。 针对小鼠染色体上特异性整合位点中热点-mpsLlt;,1gt;设计引物，利用巢式 PCR 鉴定目的基因在小鼠染色体上的整合位点，PCR 鉴定和测序结果正确；同时也鉴定出了 HBV 在体内的中间复制模板 cccDNA，证明 HBV 表达质粒通过特异性位点已经整合到小鼠染
30、色体上，并能在小鼠体内复制。 选用临床上常用的两种抗病毒药物恩替卡韦和拉米夫定对该模型用于抗 HBV 药物的筛选和评价的可行性进行了初步探讨，结果显示，用药前后血清 HBVDNA 在有显著变化，进一步的评估还在进行之中。 综上所述，本研究初步建立 HBV 急性感染小鼠模型和 HBV 小鼠体内长期表达模型，为 HBV 发病机制的探讨、药物筛选及抗病毒治疗的研究奠定了一定基础。乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)感染是全球范围影响健康的重要问题，慢性感染人群存在肝硬化和肝细胞癌的高患病风险。尽管乙型肝炎病毒疫苗有效，但是在世界范围内慢性感染人数超过了 3.5 亿，占全球人数的
31、 5。HBV 感染具有宿主特异性，在自然情况下，HBV 不感染医学研究中常用的实验小动物。乙型肝炎病毒生物学研究未完全阐明，缺乏理想的小动物模型给疾病的治疗和研究带来困难。 针对上述问题确立本课题的研究目的：基于水动力转染技术和/或噬菌体整合酶系统，建立 HBV 急性感染小鼠模型和 HBV 小鼠体内长期表达模型，用于 HBV 致病机制研究以及抗 HBV 药物在体内筛选与评价。具体研究内容如下： 1真核表达质粒的构建与鉴定 以真核表达载体 pCI-neo 为构架，将 1.3 倍长 HBV 全基因组连接在不同真核表达载体中，构建 HBV 全基因组重组质粒 pCI-neo-AerApoEAATP-H
32、BV1.3 和 pCI-neo-CMV-HBV1.3。 2急性 HBV感染小鼠模型的建立 水动力转染方法将 HBV 表达质粒转染 Balb/c 小鼠(免疫系统正常小鼠)和 Balb/c 裸鼠(免疫系统缺陷小鼠)体内，观察 HBV 在小鼠体内复制和表达情况。 结果表明，HBV 在小鼠体内转录出相应病毒 mRNA。通过免疫组织化学和血清 ELISA 方法，分析 HBV 在小鼠模型中的表达和分泌特征。小鼠肝细胞中表达的病毒蛋白可分泌入血，急性期第 3 天 Balb/c 小鼠血清中HBsAg 检出率为 100，但 HBsAg 的存在时间和水平并不相同，具有较明显的个体差异，持续表达时间约为 7 天，同
33、时在两周后检测到抗-HBs；Balb/c 裸鼠血清中 HBsAg 持续阳性约为 30 天。采用血清 real-time PCR 的方法，分析了急性感染小鼠体内 HBV 的复制和分泌特征。小鼠血清中存在 HBV DNA，在急性期其含量明显高于临床患者阳性标准(10lt;#39;3gt;copies/ml)，在第 3 天最高可达到 10lt;#39;7gt;copies/ml。Balb/c 小鼠体内 HBV DNA 在 30 天后降至阳性临界值以下，Balb/c 裸鼠可以维持 45 天左右。血清中 HBV DNA 的定量检测简便准确，是用于评价抗病毒药物治疗效果的重要指标之一。无论是 HBV 感染
34、 Balb/c 小鼠还是 Balb/c 裸鼠，HBV 在小鼠体内皆为瞬时表达，表达时间比较短。在此基础上为了延长 HBV 在小鼠体内的表达时间，本课题提出水动力转染技术结合噬菌体整合酶系统建立长期表达 HBV 小鼠模型的设想。 3HBV 小鼠体内长期表达模型的建立 噬菌体 C31 整合酶能识别噬菌体的 attP 位点和宿主基因组上的 attB 位点，由于 attP 位点和attB 位点是同源序列，通过整合酶介导同源序列之间的位点特异性重组，从而将噬菌体基因组整合到细菌染色体上。最近研究发现小鼠肝脏细胞染色体上存在两个被噬菌体整合酶识别的 attP 同源序列 mpsL1 和 mpsL2，因此可通
35、过在目的基因表达框架上添加整合酶作用靶序列 attB 位点，在整合酶作用下，使外源基因在小鼠体细胞基因组特异位点进行整合，实现目的基因在小鼠体细胞内长期稳定表达。 在己构建的含 HBV1.3 基因组的质粒启动子前分别插入噬菌体整合酶识别位点 attB，得到含整合酶识别位点 attB 的质粒 pCI-neo-attB-AerApoEAATP-HBV1.3 和 pCI-neo-attB-CMV-HBV1.3 应用水动力转染技术分别将此载体与整合酶表达质粒 pCMV-Int 共转染 Balb/c 小鼠肝脏，观察 HBV 在小鼠体内肝脏表达强度和持续时间。 结果表明，HBV 在小鼠肝脏中转录出相应病毒
36、 mRNA。转染 45 天后小鼠肝细胞中仍表达 HBcAg 病毒蛋白，同时小鼠肝细胞中表达的病毒蛋白可分泌入血，HBsAg 表达时间比急性感染小鼠模型明显延长，第 30 天仍持续阳性。血清 real-time PCR 的方法，分析了小鼠血清中存在的HBV DNA，其含量(10lt;#39;7gt;copies/ml)明显高于临床患者阳性标准，在血清中的存在时间明显长于急性感染小鼠模型，在转染后 100天时仍然在临床规定的阳性水平之上。 由于 HBV 在该小鼠模型体内表达时间较急性感染组明显延长，所以对噬菌体整合酶在小鼠体内的作用进行了鉴定。 针对小鼠染色体上特异性整合位点中热点-mpsLlt;
37、,1gt;设计引物，利用巢式 PCR 鉴定目的基因在小鼠染色体上的整合位点，PCR 鉴定和测序结果正确；同时也鉴定出了 HBV 在体内的中间复制模板 cccDNA，证明 HBV 表达质粒通过特异性位点已经整合到小鼠染色体上，并能在小鼠体内复制。 选用临床上常用的两种抗病毒药物恩替卡韦和拉米夫定对该模型用于抗 HBV 药物的筛选和评价的可行性进行了初步探讨，结果显示，用药前后血清 HBVDNA 在有显著变化，进一步的评估还在进行之中。 综上所述，本研究初步建立 HBV 急性感染小鼠模型和 HBV 小鼠体内长期表达模型，为 HBV 发病机制的探讨、药物筛选及抗病毒治疗的研究奠定了一定基础。乙型肝炎
38、病毒(Hepatitis B Virus，HBV)感染是全球范围影响健康的重要问题，慢性感染人群存在肝硬化和肝细胞癌的高患病风险。尽管乙型肝炎病毒疫苗有效，但是在世界范围内慢性感染人数超过了 3.5 亿，占全球人数的 5。HBV 感染具有宿主特异性，在自然情况下，HBV 不感染医学研究中常用的实验小动物。乙型肝炎病毒生物学研究未完全阐明，缺乏理想的小动物模型给疾病的治疗和研究带来困难。 针对上述问题确立本课题的研究目的：基于水动力转染技术和/或噬菌体整合酶系统，建立 HBV 急性感染小鼠模型和 HBV 小鼠体内长期表达模型，用于 HBV 致病机制研究以及抗 HBV 药物在体内筛选与评价。具体研
39、究内容如下： 1真核表达质粒的构建与鉴定 以真核表达载体 pCI-neo 为构架，将 1.3 倍长 HBV 全基因组连接在不同真核表达载体中，构建 HBV 全基因组重组质粒 pCI-neo-AerApoEAATP-HBV1.3 和 pCI-neo-CMV-HBV1.3。 2急性 HBV感染小鼠模型的建立 水动力转染方法将 HBV 表达质粒转染 Balb/c 小鼠(免疫系统正常小鼠)和 Balb/c 裸鼠(免疫系统缺陷小鼠)体内，观察 HBV 在小鼠体内复制和表达情况。 结果表明，HBV 在小鼠体内转录出相应病毒 mRNA。通过免疫组织化学和血清 ELISA 方法，分析 HBV 在小鼠模型中的表
40、达和分泌特征。小鼠肝细胞中表达的病毒蛋白可分泌入血，急性期第 3 天 Balb/c 小鼠血清中HBsAg 检出率为 100，但 HBsAg 的存在时间和水平并不相同，具有较明显的个体差异，持续表达时间约为 7 天，同时在两周后检测到抗-HBs；Balb/c 裸鼠血清中 HBsAg 持续阳性约为 30 天。采用血清 real-time PCR 的方法，分析了急性感染小鼠体内 HBV 的复制和分泌特征。小鼠血清中存在 HBV DNA，在急性期其含量明显高于临床患者阳性标准(10lt;#39;3gt;copies/ml)，在第 3 天最高可达到 10lt;#39;7gt;copies/ml。Balb
41、/c 小鼠体内 HBV DNA 在 30 天后降至阳性临界值以下，Balb/c 裸鼠可以维持 45 天左右。血清中 HBV DNA 的定量检测简便准确，是用于评价抗病毒药物治疗效果的重要指标之一。无论是 HBV 感染 Balb/c 小鼠还是 Balb/c 裸鼠，HBV 在小鼠体内皆为瞬时表达，表达时间比较短。在此基础上为了延长 HBV 在小鼠体内的表达时间，本课题提出水动力转染技术结合噬菌体整合酶系统建立长期表达 HBV 小鼠模型的设想。 3HBV 小鼠体内长期表达模型的建立 噬菌体 C31 整合酶能识别噬菌体的 attP 位点和宿主基因组上的 attB 位点，由于 attP 位点和attB
42、位点是同源序列，通过整合酶介导同源序列之间的位点特异性重组，从而将噬菌体基因组整合到细菌染色体上。最近研究发现小鼠肝脏细胞染色体上存在两个被噬菌体整合酶识别的 attP 同源序列 mpsL1 和 mpsL2，因此可通过在目的基因表达框架上添加整合酶作用靶序列 attB 位点，在整合酶作用下，使外源基因在小鼠体细胞基因组特异位点进行整合，实现目的基因在小鼠体细胞内长期稳定表达。 在己构建的含 HBV1.3 基因组的质粒启动子前分别插入噬菌体整合酶识别位点 attB，得到含整合酶识别位点 attB 的质粒 pCI-neo-attB-AerApoEAATP-HBV1.3 和 pCI-neo-attB
43、-CMV-HBV1.3 应用水动力转染技术分别将此载体与整合酶表达质粒 pCMV-Int 共转染 Balb/c 小鼠肝脏，观察 HBV 在小鼠体内肝脏表达强度和持续时间。 结果表明，HBV 在小鼠肝脏中转录出相应病毒 mRNA。转染 45 天后小鼠肝细胞中仍表达 HBcAg 病毒蛋白，同时小鼠肝细胞中表达的病毒蛋白可分泌入血，HBsAg 表达时间比急性感染小鼠模型明显延长，第 30 天仍持续阳性。血清 real-time PCR 的方法，分析了小鼠血清中存在的HBV DNA，其含量(10lt;#39;7gt;copies/ml)明显高于临床患者阳性标准，在血清中的存在时间明显长于急性感染小鼠模
44、型，在转染后 100天时仍然在临床规定的阳性水平之上。 由于 HBV 在该小鼠模型体内表达时间较急性感染组明显延长，所以对噬菌体整合酶在小鼠体内的作用进行了鉴定。 针对小鼠染色体上特异性整合位点中热点-mpsLlt;,1gt;设计引物，利用巢式 PCR 鉴定目的基因在小鼠染色体上的整合位点，PCR 鉴定和测序结果正确；同时也鉴定出了 HBV 在体内的中间复制模板 cccDNA，证明 HBV 表达质粒通过特异性位点已经整合到小鼠染色体上，并能在小鼠体内复制。 选用临床上常用的两种抗病毒药物恩替卡韦和拉米夫定对该模型用于抗 HBV 药物的筛选和评价的可行性进行了初步探讨，结果显示，用药前后血清 H
45、BVDNA 在有显著变化，进一步的评估还在进行之中。 综上所述，本研究初步建立 HBV 急性感染小鼠模型和 HBV 小鼠体内长期表达模型，为 HBV 发病机制的探讨、药物筛选及抗病毒治疗的研究奠定了一定基础。乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)感染是全球范围影响健康的重要问题，慢性感染人群存在肝硬化和肝细胞癌的高患病风险。尽管乙型肝炎病毒疫苗有效，但是在世界范围内慢性感染人数超过了 3.5 亿，占全球人数的 5。HBV 感染具有宿主特异性，在自然情况下，HBV 不感染医学研究中常用的实验小动物。乙型肝炎病毒生物学研究未完全阐明，缺乏理想的小动物模型给疾病的治疗和研究带来困
46、难。 针对上述问题确立本课题的研究目的：基于水动力转染技术和/或噬菌体整合酶系统，建立 HBV 急性感染小鼠模型和 HBV 小鼠体内长期表达模型，用于 HBV 致病机制研究以及抗 HBV 药物在体内筛选与评价。具体研究内容如下： 1真核表达质粒的构建与鉴定 以真核表达载体 pCI-neo 为构架，将 1.3 倍长 HBV 全基因组连接在不同真核表达载体中，构建 HBV 全基因组重组质粒 pCI-neo-AerApoEAATP-HBV1.3 和 pCI-neo-CMV-HBV1.3。 2急性 HBV感染小鼠模型的建立 水动力转染方法将 HBV 表达质粒转染 Balb/c 小鼠(免疫系统正常小鼠)
47、和 Balb/c 裸鼠(免疫系统缺陷小鼠)体内，观察 HBV 在小鼠体内复制和表达情况。 结果表明，HBV 在小鼠体内转录出相应病毒 mRNA。通过免疫组织化学和血清 ELISA 方法，分析 HBV 在小鼠模型中的表达和分泌特征。小鼠肝细胞中表达的病毒蛋白可分泌入血，急性期第 3 天 Balb/c 小鼠血清中HBsAg 检出率为 100，但 HBsAg 的存在时间和水平并不相同，具有较明显的个体差异，持续表达时间约为 7 天，同时在两周后检测到抗-HBs；Balb/c 裸鼠血清中 HBsAg 持续阳性约为 30 天。采用血清 real-time PCR 的方法，分析了急性感染小鼠体内 HBV
48、的复制和分泌特征。小鼠血清中存在 HBV DNA，在急性期其含量明显高于临床患者阳性标准(10lt;#39;3gt;copies/ml)，在第 3 天最高可达到 10lt;#39;7gt;copies/ml。Balb/c 小鼠体内 HBV DNA 在 30 天后降至阳性临界值以下，Balb/c 裸鼠可以维持 45 天左右。血清中 HBV DNA 的定量检测简便准确，是用于评价抗病毒药物治疗效果的重要指标之一。无论是 HBV 感染 Balb/c 小鼠还是 Balb/c 裸鼠，HBV 在小鼠体内皆为瞬时表达，表达时间比较短。在此基础上为了延长 HBV 在小鼠体内的表达时间，本课题提出水动力转染技术
49、结合噬菌体整合酶系统建立长期表达 HBV 小鼠模型的设想。 3HBV 小鼠体内长期表达模型的建立 噬菌体 C31 整合酶能识别噬菌体的 attP 位点和宿主基因组上的 attB 位点，由于 attP 位点和attB 位点是同源序列，通过整合酶介导同源序列之间的位点特异性重组，从而将噬菌体基因组整合到细菌染色体上。最近研究发现小鼠肝脏细胞染色体上存在两个被噬菌体整合酶识别的 attP 同源序列 mpsL1 和 mpsL2，因此可通过在目的基因表达框架上添加整合酶作用靶序列 attB 位点，在整合酶作用下，使外源基因在小鼠体细胞基因组特异位点进行整合，实现目的基因在小鼠体细胞内长期稳定表达。 在己构建的含 HBV1.3 基因组的质粒启动子前分别插入噬菌体整合酶识别位点 attB，得到含整合酶识别位点 attB 的质粒 pCI-neo-attB-AerApoEAATP-HBV1.3 和 pCI-neo-attB-CMV-HBV1.3 应用水动力转染技术分别将此载体与整合酶表达质粒 pCMV-Int 共转染 Balb/c
