1、营养与食品卫生学教研室,实验九 食品中总黄酮的测定,【目的意义】黄酮类化合物(flavonoids)是广泛存在于植物界的一大类多酚化合物，多以苷类形式存在。其分析方法有多种，对于黄酮类化合物的相互分离以及单一成分的定量分析，常采用高效液相色谱法(high performance liquidchromatography，HPLC)；而对于总黄酮含量的测定，则主要采用分光光度法。通过本方法的学习，可以掌握食物中总黄酮的测定方法。,一、高效液相色谱法,【原理】植物类样品用石油醚脱脂后，经甲醇加热回流提取，以高效液相色谱法分离，在紫外检测器360nm条件下，以保留时间定性、峰面积定量。,【仪器和试剂
2、】 1高效液相色谱仪（附紫外检测器） 2层析柱 3超声波清洗仪 4索氏提取器 5微孔过滤器(滤膜0.45m) 6甲醇(色谱纯) 7石油醚，盐酸，磷酸(分析纯) 8去离子水 9芦丁标准溶液（150g/ml）,【操作步骤】 1色谱分离条件 色谱柱：CLC-ODS，6mm150mm，5m 流动相：0.3%磷酸水溶液：甲醇(V：V) = 40：60，临用前用超声波脱气 流 速：lml/mm 柱 温：40 检测波长：360nm 灵敏度：0.02AUFS 进样量：20l,【操作步骤】 2样品处理 （1）固体样品：称取2.0g干燥的固体样品，研细，置于索氏提取器中，用石油醚(60-90)提取脂肪等脂溶性成分
3、，弃去石油醚提取液，剩余物挥去石油醚，加入甲醇50ml和25%HCl 5ml，80水浴回流水解1h，取出后快速冷却至室温，转移至50ml容量瓶中，甲醇定容，经0.45m滤膜过滤，供分析用。 （2）液体样品：准确吸取样品2.0ml，直接以石油醚萃取脱脂，挥去石油醚后，以甲醇溶解并定容，经微孔滤膜(0.45m)滤过后供测定用。,【操作步骤】 3样品测定准确吸取样品处理液和标准液各10l，注入高效液相色谱仪进行分离以其标准溶液峰的保留时间定性，以其峰面积计算出样品中总黄酮的含量。,【结果计算】X= S1cV/ S2m式中：X 样品中总黄酮含量，g/g或g/ml；S1 样品峰面积；C 标准溶液浓度，g
4、/ml；S2 标准溶液峰面积；V 样品提取液总体积，ml；M 样品质量或样品体积，g或ml。,【原理】黄酮类化合物是具有苯并吡喃环结构的一类天然化合物的总称，一般都具有4位羰基，且呈现黄色。黄酮类化合物的3-羟基、4-羟基或5-羟基、4-羰基或邻二位酚羟基，与铝盐进行络合反应，在碱性条件下生成红色的络合物。本方法对样品中黄酮类化合物进行提取纯化后，用分光光度法于510nm波长下测定其吸光度，与芦丁标准品比较，进行待测物中总黄酮的定量测定。,二、分光光度法,【仪器】 1.722分光光度计 2.索氏提取器 3.真空泵 4.盐基交换管 5.恒温水浴 6.分液漏斗,【试剂】 1.亚硝酸钠 2.硝酸铝
5、3.氢氧化钠(分析纯) 4.氯仿 5.无水乙醇 6.甲醇(分析纯) 7.5%香草醛溶液 8.聚酰胺树脂 9.去离子水 10.芦丁标准溶液（150g/ml）。,【操作步骤】 1样品处理 （1）固体样品：称取12g干燥的固体样品，用滤纸包紧，置于索氏提取器中，加入50100ml70%乙醇溶液浸润，80水浴回流3h，至提取液无色。粗提液冷却，减压抽滤，用少量25%乙醇溶液洗涤滤渣，合并滤液。50下减压蒸馏至索氏提取器内溶液呈无醇味。倒出容器内溶液，用30ml热水分3次洗涤，抽滤后，将滤液倒入分液漏斗中，以75ml氯仿分3次萃取脱脂，待完全分层后，收集各次下层水溶液并定容至50ml。,【操作步骤】 1
6、样品处理称取12g经预处理的聚酰胺树脂粉末，湿法装柱，用水饱和。吸取上述脱脂后的水溶液12ml，沿层析柱漫漫滴入柱内，放置一定时间，待测液被充分吸附后，用70%乙醇或甲醇洗脱，流速为1.0ml/min，至流出液基本无色，一般收集10ml即可。上述洗出液用洗脱剂定容后即可用于测定。 （2）液体样品：准确吸取1.0ml样品，定容至50ml后，直接以75ml氯仿分3次萃取脱脂，其余步骤同上。,2标准曲线的绘制准确吸取芦丁标准溶液0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00ml，移入10ml比色管中，加入30%乙醇溶液至5ml，各加5%亚硝酸钠溶液0.3ml，振摇后放置5min，加入10%硝酸
7、铝溶液0.3ml摇匀后放置6min，加1.0mol/L氢氧化钠溶液2ml，用30%乙醇定容至刻度。摇匀，放置15min，于510nm波长处测定吸光度，以零管为空白，以芦丁含量(g)为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线，计算相关系数。,3样品测定根据样品中总黄酮含量高低，取适宜体积待测液，按标准曲线制备操作步骤于510nm处进行吸光度的测定(样液如有沉淀，应过滤后测定)。,【结果计算】 X= 100m1V2/mV1106 式中：X 样品中总黄酮含量，g/100g或g/100ml；M 根据标准曲线计算出待测液中黄酮的量；m1 样品质量或样品体积，g或ml；V1 样品提取液测定用体积，ml；V2 样品提取液总体积，m1。,【注意事项】 1HPLC法与分光光度法比较，HPLC法相对干扰少，重现性好，测定结果更为准确可靠；但其操作较为烦琐，费用较高。分光光度法操作简便、快速、易行，所需费用不高；但易受杂质干扰，稳定性稍差。 2样品水解后随着放置时间的延长，总黄酮的含量可能会发生变化，因此样品水解后应尽快测定。 3随着显色时间的延长，吸光度将略有下降，因此应尽快进行测定。,Thank You !,
