1、维生素 C 含量测定的实验设计方案一、目的与要求(1)掌握维生素 C 的含量测定的原理和操作。(2)掌握维生素 C 的分子式和结构简式，了解维生素 C 的还原性。(3)掌握紫外分光光度法维生素 C 含量的测定的方法。(4)熟悉精密紫外可见分光光度计的使用方法。(5)掌握用标准曲线法进行定量分析的原理和方法。二、方法提要 维生素 C（Vitamin C ，Ascorbic Acid）广泛存在于新鲜水果中，它具有保持肌肤润滑、防止衰老、抗坏血酸等作用，是人体必需的主要维生素之一，是人体正常生理代谢不可缺少的一类有机物1。维生素 C 在水果中主要以还原型（ASA ）存在。维生素又名抗坏血酸是一种含有
2、 6 个碳原子的酸性多羟基化合物，分子式为 C6H8O6，分子量为 176.1。能溶于水、乙醇和甲醇，而不溶于其他有机溶剂，具有酸性和还原性，有 4 种异构体，即 L抗坏血酸、D抗坏血酸、L 异抗坏血酸、D异抗坏血酸。天然抗坏血酸主要以 L抗坏血酸为主，其效力最高。抗坏血酸在合适的条件下，可氧化成脱氢抗坏血酸，脱氢后的 L脱氢抗坏血酸在生物体内可还原为 L抗坏血酸，且这种变化是可逆的，故仍有生物活性。脱氢抗坏血酸可进一步被氧化，生成二酮古洛糖酸，而这一过程是不可逆的。在许多水果和蔬菜中，维生素 C 主要以还原型抗坏血酸存在。维生素 C 的固体较稳定，水溶性最容易受氧化，所以测定 VC 的准确性
3、很大程度上取决于分析技术。 水果中 VC 含量的测定一般采用 2,6-二氯靛酚滴定法 2、碘量法3、2,4二硝基苯肼法4 、荧光分光光度法5高效液相色谱法6和点位滴定法7等，这些方法都有所用试剂不稳、操作程序复杂、费时等缺点，为此，此实验采用分光光度法8，首先测定维生素 C 的标准曲线，以吸光度差值A 对抗坏血酸浓度 C 绘制标准曲线，以此为基础测定样品的A ，并求得水果中维生素 C的含量。本方法与常规方法比较，具有准确、快速、稳定、试剂易得等优点。维生素 C 是烯醇化合物，具有C=C基，在可见光区无吸收，在紫外区有吸收。按实验方法，分别对不同浓度的标准维生素 C 与试剂空白溶液在 20040
4、0nm 波长范围内进行扫描，通过吸收光谱曲线确定维生素 C 水溶液的最大吸收波长。又根据维生素 C 对碱不稳定的特性，于最大吸收波长处测定样品溶液与碱处理样品两者吸收光度之差，通过查标准维生素C 的标准曲线，即可计算样品维生素 C 的含量。这种方法具有准确、快速、重现性好等优点，还适合深色样品的测定。 由于维生素 C 极度不稳定，在样品前处理过程中，防止抗坏血酸的氧化是非常重要的。可采用添加偏磷酸、草酸的方法加以解决。因为它们均能抑制抗坏血酸的氧化酶，而起稳定作用。但由于 2%草酸在波长 200400nm 处有非常强的吸收，所以不能作为维生素 C 的提取液，而 2%偏磷酸虽然在波长 20040
5、0nm 处有微弱的吸收，可通过扣除其空白吸光值，便可计算出样品维生素 C 的吸光值差 A。因此，本实验选择 2%偏磷酸作为分光光度法的溶剂。(本实验采用紫外分光光度法)三、试剂与仪器（1 ）试剂：标准抗坏血酸溶液（0.1mg/mL）：精确称取抗坏血酸 10mg（精确至 0.1mg）, 用 2%偏磷酸溶解并定容至 100mL，此溶液应贮存在棕色瓶中，最好现配现用；2%（W/V）偏磷酸溶液，0.5mol/mLNaOH，（2 ）仪器：紫外可见光光度计、石英比色皿、组织捣碎机、高速离心机、50mL 容量瓶、100mL 容量瓶、10mL 移液管、洗耳球、10mL 比色管、电子天平。四、操作步骤1、样品制
6、备取水果样品 400 g 清洗、沥干，将每份样品平均分成 4 份，即每份 100 g，用破碎机破碎。加入 100mL2.0%偏磷酸溶液，迅速捣成匀浆。称取 31.5g 浆状样品，用 2.0%偏磷酸将样品移入 100mL 容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀。有浑浊现象，用高速冷离心机离心，7500rpm，离心 10min，取其上清液。2、绘制标准曲线吸取 0.00、0.20、0.40、0.80、1.00、1.20mL 抗坏血酸标准溶液，置于 10mL 比色管中；用 2%偏磷酸定容，摇匀。此标准系列抗坏血酸的浓度分别为0.00、1.00、2.00、4.00、6.00 、8.00、10.0、12.0/mL
7、 。以蒸馏水为参比，在波长max（经测定，最大吸收峰所对应的入射光波长 max=245nm）处，用 1cm 石英比色皿测定标准系列抗坏血酸溶液的吸光度。抗坏血酸吸光度为 A，试剂空白吸光度为 A。 ，计算吸光度差值A=AA 。 ，以吸光度差值A 对抗坏血酸浓度 C 绘制标准曲线。3、样品的测定准确移取澄清透明的 0.4mL 的提取液，置于 10mL 的比色管中，用 2.0%偏磷酸溶液稀释至刻度后摇匀。以蒸馏水为参比，在波长 max 处，用 1cm 石英比色皿测定其吸光度。每个样品做三次重复。 待测碱处理样溶液的测定：分别吸取 0.4mL 澄清透明提取液，加入 6 滴 0.5mol/L 的NaO
8、H 溶液，置于 10mL 比色管中混匀，在室温放置 40min 后，加入 2.0%偏磷酸溶液稀释至刻度后摇匀。以蒸馏水为参比，在波长 max 处，用 1cm 石英比色皿测定其吸光度。每个样品做三次重复。4、结果计算由待测样品与待测碱处理样品的吸光度值之差校准曲线，即可计算出样品中维生素 C 的含量，也可以直接以待测碱处理液样为参比，测得待测液的吸光值，通过查校准曲线，计算出样品的维生素 C 的含量。 维生素 C 的含量 mg/100g=200 C) mV 式中： m样品重量（g） ； 200稀释倍数； C从校准曲线上查得抗坏血酸的含量，/mL； V测试时吸取提取液体积， mL。五、注意事项（1 ）在优化的实验条件下得到的校准曲线，表明维生素 C 在 1.0012.0/mL 范围内吸光度与浓度 C 之间呈良好的线性关系服从朗伯比尔定律。所以测定的最大吸光度值最好不要超过 0.8A，否则浓度过高易造成曲线的弯曲。 （2 ）要求每批测定样品都要有校准曲线。 （3 ）在处理药品时，如遇到泡沫产生，可加入数滴辛酸消除。 （4 ）若样品浑浊，可用离心机分离用转速 7500rpm，时间 10min,至样液澄清、透明，取上清液。 （5 ）一般分析纯抗坏血酸纯度为 99%以上，可不标定，若试剂发黄，则弃去不用。六、思考题1.2.参考资料网址http:/
