1、李江华江南大学2014-9-19,新型有机酸的发酵法制备技术,报告内容,一. 新型有机酸概况二. 新型有机酸发酵研究进展举例 丙酮酸发酵 丙酸发酵 -酮戊二酸发酵三. 新型有机酸发酵工业展望,一、新型有机酸概况,新型有机酸概述,柠檬酸,乳酸,-酮戊二酸,丙酸,琥珀酸,衣康酸,葡萄糖酸,丙酮酸,有机酸是指一些具有酸性的有机化合物。最常见的有机酸是羧酸，其酸性源于羧基(-COOH),新型有机酸概述,新型有机酸是指一系列在食品、医药和化工等领域具有重要应用价值，但是长期以来由于结构复杂性和较高的化学反应活性无法在工业规模进行低成本生产的有机酸。其中丙酮酸、-酮戊二酸和丙酸等，由于化学合成工艺复杂，成
2、本长期维持在10万元/吨以上(普通有机酸价格仅为0.4-1万元/吨)，导致下游产品成本居高不下，妨碍了其大规模应用。,二. 新型有机酸发酵研究进展丙酮酸,丙酮酸的应用领域,丙酮酸,农业： 阿托酸、谷物保护剂等多种农药合成前体,食品工业： 功能饮料添加剂 减肥食品 酸味剂,医药工业： 原料药 药物合成前体 药物佐剂,日化工业： 防腐剂 抗氧化剂,诊断检测试剂： 伯醇/仲醇检定 转氨酶测定 脂肪族胺显示剂,丙酮酸的生产方式比较,化学法,代谢工程改造：,酶转化法,发酵法,筛选得到的菌种：光滑球拟酵母,酿酒酵母,大肠杆菌,原料成本高环境污染严重,原料成本高来源有限,最适pH值高易感染噬菌体丙酮酸耐受性
3、差,转化率较低，副产物多生产周期较长发酵过程不稳定,最适pH值低不易染菌无噬菌体高丙酮酸耐受性,发酵法生产丙酮酸,选育维生素缺陷型酵母,光滑球拟酵母丙酮酸代谢,优化培养基中维生素供给,X,X,X,X,菌株选育,不同kLa下发酵动力学曲线,不同kLa下溶氧、产率变化,不同供氧控制模式下发酵过程参数,高溶氧下，丙酮酸产率较高(0.724 g/g)，葡萄糖消耗速度(生产强度)较慢(1.14 g/(Lh)低溶氧下，细胞消耗葡萄糖速度加快(1.97 g/(Lh)，丙酮酸产率(0.483 g/g)却明显下降,不同供氧控制模式下发酵过程参数,丙酮酸产率,细胞产率,发酵法生产丙酮酸,代谢网络分析,高溶氧下转化
4、率高的原因:DO从85%到10%，PEP到Pyr的通量增加了20%，丙酮酸代谢的通量下降了63.3%,辅因子分析,低溶氧下生产强度提高原因：DO从85%到10%，总ATP、NADH下降31.4%、18.6%，糖耗速度上升59%,采用单一供氧模式(高或低)，不能同时达到高转化率和高生产强度,发酵法生产丙酮酸,实现相对统一高产量(69.4 g/L)高产率(0.636 g/g)高生产强度(1.95 g/(Lh),发酵过程碳平衡分析,前16 h较高溶氧有利于碳流合成细胞；,16 h后耗氧速率恒定，碳流转向合成丙酮酸,必须进行分阶段溶氧控制！如何分阶段？,发酵法生产丙酮酸,美国科学院院士L O. Ing
5、ram在PNAS上的论文11次引用本团队丙酮酸高效合成的论文，并比较表明本团队获得了国际最高发酵水平。,被世界上最大发酵公司之一日本味之素公司购买，为该公司从中国购买的唯一技术,发酵法生产丙酮酸,二. 新型有机酸发酵研究进展丙酸,丙酸的应用及市场,2012: 260m lbs (117,936 tonnes),化学法：2万/吨,发酵法：6万/吨（食品安全）,丙酸钙价格,06年全球产量37.7万吨,75%用于谷物和饲料防腐,消费者热衷于使用天然、绿色、健康 的发酵级丙酸钙作为食品防腐剂,丙酸的生产方法,丙酸杆菌代谢工程改造策略,过量表达甘油脱氢酶（gldA），提高对甘油的利用速率过量表达苹果酸脱
6、氢酶（mdh），富马酸水合酶（fumC），提高丙酸代谢途径通量,gldA,mdh,fumC,丙酸发酵的问题丙酸杆菌对碳源利用率低，生长慢；代谢途径过程中存在若干限速酶，大大抑制了丙酸的积累,筛选丙酸高产菌,菌种鉴定,筛选野生型质粒,细胞壁裂解条件优化,条件: 溶菌酶 20 mg/mL 37 oC, 蛋白酶K 2 mg/mL 56 oC. “-” 表示细胞壁没有裂解. “+” 表示细胞壁被裂解.,质粒电泳图,质粒鉴定分析,质粒ORF转录水平分析,丙酸高产菌、野生质粒的筛选以及质粒分析,过量表达甘油脱氢酶,野生菌与工程菌分批发酵对比: 丙酸(PA), : 甘油浓度, : 细胞干重(DCW), :
7、乙酸(AA), : 琥珀酸 (SA), : 甘油脱氢酶比酶活.,过量表达甘油脱氢酶工程菌的丙酸产量比野生菌提高了28%,过量表达丙酸代谢限速酶,mdh,fumC,P. jensenii ATCC 4868 (pZGX04-fumC)和P. jensenii ATCC 4868 (pZGX04-mdh)分批补料发酵 , glycerol; , PA; , LA; , DCW; , AA.,富马酸水合酶基因和苹果酸脱氢酶基因表达载体的构建,过量表达丙酸代谢限速酶,不同菌株丙酸发酵参数对比,过量表达甘油脱氢酶基因的工程菌丙酸产量比出发菌提高了28.46%过量表达富马酸水合酶基因的工程菌丙酸产量比出发
8、菌提高了28.09%过量表达苹果酸脱氢酶基因的工程菌丙酸产量比出发菌提高了33.91%,共表达关键限速酶,富马酸水合酶基因和苹果酸脱氢酶基因共表达载体的构建示意图,三株共表达载体pZGX04-gldA-mdh, pZGX04-gldA-fumC, pZGX04-mdh-fumC的物理图谱,共表达关键限速酶,不同菌株丙酸分批发酵参数对比,共表达苹果酸脱氢酶和富马酸水合酶基因的工程菌丙酸产量比出发菌提高了36.73%共表达甘油脱氢酶和富马酸水合酶基因的工程菌丙酸产量比出发菌提高了39.22%共表达甘油脱氢酶和苹果酸脱氢酶基因的工程菌丙酸产量比出发菌提高了46.31%,氧化还原电位（ORP）发酵优化
9、,不控制ORP分批发酵,甘油; ,丙酸; , pH; ,乳酸; , DCW; ,乙酸; ， ORP.,不控制ORP发酵，ORP下降迅速，后期产酸能力低,氧化还原电位（ORP）发酵优化,不同ORP对分批发酵的影响,甘油; ,丙酸; , pH; ,乳酸; , DCW; ,乙酸,高ORP条件下，菌体浓度高；低ORP条件下，单位菌体产酸能力高,氧化还原电位（ORP）发酵优化,三阶段ORP控制对分批发酵的影响,甘油; ,丙酸; , pH; ,乳酸; , DCW; ,乙酸,提出三阶段ORP控制策略：0-36 h，控制ORP为-200 mV；36-156 h，控制ORP为350 mV，156 h后控制ORP
10、为-400mV。三阶段ORP控制分批发酵丙酸产量比不控制ORP发酵提高了27.7%,10m3发酵罐放大试验,丙酸10 m3罐中试发酵过程曲线, residual glycerol, PA, DCW, SA, * AA,丙酸最高产量为47.28 g/L，生产强度为0.197 gL-1h-1全球第二家采用发酵法生产丙酸,二. 新型有机酸发酵研究进展-酮戊二酸, -酮戊二酸的应用,降低病患机体损耗,清除自由基，延缓衰老,提高繁殖率，促进骨骼的生长,有机中间体,体格增强剂、运动饮料添加剂,医药,化妆品,食品,化工,饲料, -酮戊二酸市场概况,国际市场食品级-酮戊二酸潜在市场容量约为1万吨,化学法,发酵
11、法,筛选得到的菌种：解脂亚诺酵母, -酮戊二酸的生产方法,生产效率低、环境非友好和有毒试剂使用，限制其在医药、保健品和食品等高附加值产品生产应用,生产效率高环境友好食品安全性高,食品安全级生物法生产-酮戊二酸,土壤样品,维生素B1缺陷型筛选,500株微生物菌株,0.1 g/L 13.4%,0.1-1 g/L 74.4%,1-10 g/L 6.4%,10 g/L 5.8%,菌落形态,AGTCTAGTATAAACAATTATACAGTGAAACTGCGAACGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTTTTCTACATGGATAACCGTGATAACTTCAGAACTAAT
12、ACATGACAGCCTTCTGGCGTATATATTAGATACAAACCAACAGTATGGTGATTCATAATATCTTGTCGAACCGATCTTCGGTGTATCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTGTCGATGGTAGGATCGTGGCCTACCATGGTAACAACGGGTAACGGGGAATCAGGGTTCTATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAATATATAACGATCCGGGGCTCTTTGAGTTTCGGAATT
13、GGAATGAGTACAATTTAAACACCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTG,18S rRNA,Yarrowia lipolytica WSH-Z06,生物法生产-酮戊二酸的关键问题,当以甘油为唯一碳源时，发酵6天后-KG产量可达30 g/L左右，但是发酵液中同时会积累大量的副产物丙酮酸(30 g/L左右)。,Y. lipolytica WSH-Z06摇瓶发酵曲线-KG (), Glycerol (), Pyruvate (), DCW (),存在的问题,1.辅因子调控,3.节流,2.开源,4.调控转运蛋白,解决方案代谢工程改造解脂亚洛酵母,代谢工程改造解脂亚洛酵
14、母,1.辅因子调控,调控乙酰辅酶A代谢促进-酮戊二酸的积累,过量表达ACS1基因使胞内ACS比酶活达到0.92 U/mg protein，过量表达ACL基因使胞内ACL酶活达到了1.51 U/mg protein，比对照分别提高了10.5和11.6倍，胞内乙酰辅酶A含量分别是对照的231.2% 和244.2%。,调控乙酰辅酶A代谢促进-酮戊二酸的积累,过量表达ACS1和ACL基因对菌体生长和-酮戊二酸合成的影响,: -KG; : Glycerol; : pyruvate; : DCW,(A): The time-courses of fermentation in Y. lipolytica-
15、CON; (B): The time-courses of fermentation in Y. lipolytica-ACS1; (C): The time-courses of fermentation in Y. lipolytica-ACL.,提高16.2%,提高28.6%,Y. lipolytica-ACS1和Y. lipolytica-ACL中-酮戊二酸的产量分别为42.2 g/L和46.7 g/L，比对照菌(36.3 g/L)分别提高了16.2%和28.6%。丙酮酸产量分别为14.5g/L和10.6 g/L，比对照菌(21.2 g/L)分别降低了31.6%和50%。,代谢工程改造
16、解脂亚洛酵母,2.开源,强化丙酮酸羧化途径促进-酮戊二酸的积累,6.5倍,10.2倍,表达载体p0(hph)-ScPYC1和p0(hph)-RoPYC2的构建,Y. lipolytica及其突变株胞内PC 酶活,转化子提取基因组进行PCR验证,强化丙酮酸羧化途径促进-酮戊二酸的积累,过量表达ScPYC1和RoPYC2基因对菌体生长和-酮戊二酸合成的影响,: -KG; : Glycerol; : Pyruvate; : DCW,(A): The time-courses of fermentation in Y. lipolytica-CON; (B): The time-courses of
17、fermentation in Y. lipolytica-ScPYC1; (C): The time-courses of fermentation in Y. lipolytica-RoPYC2.,Y. lipolytica-ScPYC1和Y. lipolytica-RoPYC2中-酮戊二酸的产量分别为45.2 g/L和49.1 g/L，比对照菌(36.3 g/L)分别提高了24.5%和35.3%。丙酮酸产量分别为10.2 g/L和6.4 g/L，比对照菌(21.2 g/L)分别降低了51.9%和69.8%。,提高24.5%,提高35.3%,5 M3中试结果,Time course of
18、fed-batch fermentation by constant feeding strategy in pilot scale,发酵156 h，PA：24.6 g/L； -KG ： 64.2 g/L,成果获奖,三. 新型有机酸发酵技术展望,技术发展1：基于组学分析构建获得优良菌种,工业微生物基因组,组学分析,计算模拟,分子改造,新一代工业菌种,基因组,转录组,蛋白质组,代谢组,结构设计,途径设计,网络设计,数据集成,基因组理性设计,基因组网络重构,全局扰动优化,多位点快速进化,基因组删减优化,代谢途径优化,技术发展2：发展信息和控制技术提高装备水平,发酵过程的自动控制基于实时代谢流分析的
19、在线状态预测与控制 基于智能控制系统的过程放大模拟系统 基于人工智能技术的过程控制与优化,细胞生理代谢与流场特性的结合生理代谢特征与代谢通量分析 基于传递、混合与生物反应动力学 计算流体力学、发酵罐流场的计算机模拟,技术发展3：技术集成提高产品质量和实现清洁生产,高效分离单元及装备的开发与集成连续板框过滤技术、膜过滤技术人工智能模拟与控制的结晶技术生化反应与分离耦合技术,资源和能量的高效利用 发酵过程清洁生产技术和闭路循环工艺发酵食品生产废渣资源化和高值化工艺发酵废弃物和副产物的综合利用和资源化处理,致谢,项目支持：973项目、863项目国家自然科学基金(21006040 )国家自然科学基金(31171638 )国家自然科学基金(21276109) 合作伙伴：宜兴协联生物化学有限公司沈阳科纳提克生物科技有限公司江苏江山制药有限公司杭州宝晶生物股份有限公司,谢谢! 请批评指正！,
