1、实 用医学杂志 2011 年第 27 卷第 19 期登革热是由登革病毒 （DENV）引起的急性传染病 ，广泛流行于全球热带和亚热带地区 ， 是世界上发病患者数最多 、 分布最广的虫媒病毒病 。 疫苗是预防登革热最有效的途径 ， 然而 ， 迄今仍没有安全有效的疫苗用于登革热的特异 性 预 防 。 根据抗原性的不同 ，DENV 分 为 4 个 血 清 型（DENV 1、2、3、4）。人类感染 DENV 后可产生型特异性中和抗体 ， 对同型病毒的再感染具有免疫保护作用 。 但不同型的抗体之间不但没有交叉免疫保护作用 ， 而且还可能对异型病毒感染产生抗体依赖的感染增强作用 （ADE）。因此 ，理想 的
2、 DENV 疫苗应该是能诱导人体产生对 4 种 血 清 型DENV 均有免疫保护作用的四价疫苗 。1 灭活疫苗1996 年 Putnak 等用 DENV 2 型病毒 S16803 株 （DENV2 S16803）感染 Vero 细胞 ，大量培养病毒后 ，经纯化和甲醛灭活 ，制备了 DENV 2 灭活疫苗 。 用这种灭活疫苗免疫小鼠及恒河猴后 ，可产生高滴度抗 DENV 2 型中和抗体 ，并能部分抵抗 DENV 的攻击 ， 证明该灭活疫苗在小鼠及恒河猴中具有免疫原性和保护作用 。 随后 Robert Putnak 等1又进一步证明了 DENV 2 灭活疫苗在恒河猴中的免疫保护作用 。然而 ，灭活
3、疫苗在制备过程中需要大量培养和灭活病毒 ，程序复杂 ，生产成本高 ，且有病毒灭活不完全的潜在危险 。 此外 ， 灭活疫苗免疫效率较低 ， 需多次接种才能诱导有效免疫 ， 仅诱导体液免疫 ， 免疫力不持久等 。 这些因素制约了DENV 灭活疫苗的发展 。2 亚单位疫苗包膜蛋白 E 是 DENV 的主要结构蛋白 ，具有多种 B 细胞和 T 细胞表位 ，能诱导产生保护性中和抗体和细胞免疫应答 ，因此 E 蛋白是亚单位疫苗首选的抗原靶标 。 1997 年Surgue 等用嗜甲醇毕赤酵母成功地表达了 DENV 1 结构基因 （C-prM-E）的非分泌型病毒样颗粒 （VLPs），用这些 VLPs免疫家兔可
4、诱导产生中和抗体 。 这是用黄病毒结构基因成功表达病毒样颗粒状的首次报道 。 2010 年 Liu 等2利用DENV 2 型 C-prM-E 和 prM-E 分别在非甲醇诱导的毕赤酵母表达系统成功地表达了分泌型登革 2 型 病 毒 样 颗 粒（VLPs）， 并证明该 VLPs 具有良好的免疫原性和免疫反应性 ，能高效诱导体液免疫和细胞免疫 。 VLPs 是不含病毒核酸的空心颗粒 ， 保留了与天然病毒粒子类似的空间构型和抗原表位 ，能有效诱导产生体液免疫和细胞免疫反应 ，因而被认为是研制 DENV 亚单位疫苗的有效途径 。包膜蛋白 E 含 3 个结构域 （ 区 、 区和 区 ），其中 区可诱导产
5、生保护性免疫应答 。 2007 年 Chen 等 将DENV 4 个血清型的 E 蛋白 区 （ED ）相继连接 ，构建成串联的 ED ，用该免疫原免疫小鼠 ，能诱发小鼠产生抗 DENV 1 4 型的交叉中和抗体 。 2009 年 Leng 等3将DENV 4 个血清型的 ED 区进行比对获得各型同源的 E蛋白 区免疫源 （cED ），这种免疫源辅以佐剂免疫小鼠 ，可产生抗 DENV 4 个血清型的高水平交叉中和抗体 ， 为研制四价 DENV 疫苗奠定了基础 。亚单位疫苗在免疫小鼠后 ， 均能产生中高度水平的抗体 ，但其与灭活 DENV 疫苗一样具有维持时间较短 、需重复接种等缺点 。3 DNA
6、 疫苗DNA 疫苗具有可插入基因片段大 、易于操作 、安全可靠等特点 ，已在黄病毒属病毒 、HIV、流感 、HBV 等多种病毒的疫苗研制中得到应用 ，DENV DNA 疫苗的研究也取得了一 些 进 展 。 1997 年美国海军医学研究中心 （NMRC）的Kochel 等率先报道了用 DENV 2 PrM 蛋白和 92E 蛋白构建 DAN 疫 苗 的 研 究 结 果 ， 发 现 用 这 种 DNA 疫 苗 免 疫BALB c 小鼠后 ， 可诱导所有小鼠产生中和抗体 。 2003 年NMRC 的 Raviprakash 等 又 用 DENV 1 PrM-E 基 因 构 建 了DENV 1 DNA
7、疫苗 ，动物实验结果表明 ， 3 剂加强免疫后可Kumarasamy V， Wahab A H， Chua S K， et al Evaluation ofa commercial dengue NS1 antigen-capture ELISA for laboratorydiagnosis of acute dengue virus infection J J Virol Methods，2007，140（12）：7579Bessoff K， Delorey M， Sun W， et al Comparison of twocommercially available dengue vir
8、us （DENV） NS1 captureenzyme-linked immunosorbent assays using a single clinicalsample for diagnosis of acute DENV infection J ClinVaccine Immunol， 2008，15（10）：15131518Ding X， Hu D， Chen Y， et al Full serotype- and group-specific NS1 capture enzyme-linked immunosorbent assay forrapid differential dia
9、gnosis of dengue virus infection J ClinVaccine Immunol， 2011，18（3）：430434Hunsperger E A， Yoksan S， Buchy P， et al Evaluation ofcommercially available anti-dengue virus immunoglobulin Mtests J Emerg Infect Dis， 2009，15（3）：436440Innis B L， Nisalak A， Nimmannitya S， et al An enzyme-linked immunosorbent
10、 assay to characterize dengue infectionswhere dengue and Japanese encephalitis co-circulate J Am JTrop Med Hyg， 1989， 40（4）： 418427Kuno G， Gomez I， Gubler D J An ELISA procedure for thediagnosis of dengue infections J J Virol Methods， 1991， 33（12）： 101113（收稿 ：20110702 编辑 ：黄月薪 ）111213141516登革病毒疫苗研究进展
11、罗雅艳 江丽芳doi：103969jissn1006-5725.2011.19.005作者单位 ：510080 广州市 ， 中山大学中山医学院微生物教研室通信作者 ：江丽芳 E-mail： jianglf909yahoocomcn3468实 用医学杂志 2011 年第 27 卷第 19 期有效抵抗野生型病毒攻击 。 此后 ， 有不少用 DENV 1 的NS1、ED 和 ED 等基因构建 DNA 疫苗的报道 。4 减毒活疫苗41 传统减毒活疫苗 传统减毒疫苗是通过在敏感细胞上或动物体内连续传代后所获得的突变病毒 。 泰国 Mahidol大学和美国 Walter Reed 陆军研究所为传统减毒疫苗
12、的研究作出了突出的贡献 ， 推动了传统减毒活疫苗的发展 。Mahidol 大学用原代狗肾细胞 （PDK）、 原代绿猴 肾 细 胞（PGMK） 等细胞连续传代的方法获得 4 个 型 的 减 毒 株DENV 1 PDK13、DENV 2 PDK53、DENV 4 PDK48 和 DENV3 PGMK30F3， 随后 ，该大学与法国巴斯德研究所合作 ，将这些减毒株配伍成四价减毒活疫苗进行了 期临床试验 ，接种志愿者后 ， 超过 80的人产生了针对 DENV 4 个型的抗体 。 随后的 b 期临床试验发现 ，这些疫苗不能在 DENV各型之间产生有效的平衡免疫反应 ， 同时不良反应现象严重 ，为此这一合
13、作研究已经停止4。 美国 Walter Reed 陆军研究所经 期临床试验后筛选出了四个传统减毒活疫苗株DENV 1 PDK20、DENV 2 PDK50、DENV 3 PDK20 和 DENV4 PDK20，用这些疫苗株接种志愿者后 ，能在志愿者体内诱导产生中和抗体 ， 目前正在进行 期临床试验 。 在此基础上 ， Sriluck 等进一步研究了 DENV 1 PDK27、DENV 2PDK50、DENV 3 PDK20、DENV 4 PDK6 的安全性和免疫原性 ， 期临床试验显示有很好的安全性 。 随后的 期临床试验接种了 23 例成人志愿者 ， 接种者表现出良好的耐受性 ，不良反应较少
14、5。一般情况下 ， 病毒免疫原性随着病毒毒力的减弱而降低 。 因此 ， 构建的减毒活疫苗在使病毒毒力减弱的同时还应保持减毒株的免疫原性 。 细胞连续传代虽然能使病毒株减毒 ，但其要么减毒不明显 ，要么过于减毒而使免疫原性降低 ，因而传统减毒活疫苗的研究进展缓慢 。42 新型减毒活疫苗 减毒活疫苗的减毒机制研究为新型减毒活疫苗的研制奠定了基础 。 1997 年 Kinney 等 对DENV 2 PDK53 的减毒原因进行探讨 ，发现野毒株 DENV 216681 株与 DENV 2 PDK53 减毒株之间存在 5 个氨基酸的差异 ，表明 DENV 的减毒与基因变异有关 ；Butrapet 等发现
15、DENV 2 PDK53 少数氨基酸的变化 （2 3 个 ）可导致 DENV病毒表型的明显变化 。 随后 ，Puri 等通过测序发现突变位点随着传代次数的增加而增多 ，说明 DENV 毒力是由多位点控制的 。 上述研究为通过定点突变获得 DENV 减毒株提供了理论依据 。 1991 年 Lai 等首次构建了 DENV 4 型病毒株全长 cDNA 克隆 ，由于疫苗基因成分在 cDNA 系统中稳定 ，减少了回复突变的危险 。 感染性 cDNA 克隆技术为 DENV减毒活疫苗的研制开辟了新途径 ，使 DENV 人工定向减毒成为可能 ，因此 ，以反向遗传技术为基础的新型 DENV 减毒疫苗的研制成为当
16、今的热点 。421 非编码区缺失突变疫苗 研究表明 ，登革病毒基因组非编码区对病毒的翻译 、 复制和包装具有重要作用 ，这些序列缺失可影响 DENV 的增殖及感染过程而导致减毒 。1996 年美国国立卫生研究院过敏与传染病研究所 （NIHNIAID）Men 等获得的 rDENV430（3UTR，303 183）在减毒的同时没有改变病毒增殖特性 ， 且在猴体内能产生与原毒株相同水平的抗体 。 这表明可在 3UTR 进行缺失突变 ，从而构建既可减毒又具免疫原性的减毒活毒株 。 2001 年Durbin 等6构建的减毒活疫苗株 rDENV430（3UTR，172 143）经 期临床试验证明具有较好的
17、安全性 、稳定性和免疫原性 ， 但其减毒不稳定且不良反应严重 。 为了进一步降低 3UTR 缺失突变减毒活疫苗的不良反应 ，Julie 及 Peter等对 rDENV430 进行了改造 ，在其 NS5 和 NS3 编码区进行了点突变 ， 所获得的突变株接种志愿者后均诱导出很好的免疫保护作用 ，且副反应大大降低 。422 衣壳蛋白缺失突变疫苗 2002 年 Kofler 等发现缺失黄病毒属蜱传脑炎病毒 （TBE） 衣壳蛋白内部疏水序列后 ，在减毒的同时不影响其增殖能力 ，且具有较高的免疫原性 。 2007 年朱武洋等7通过缺失中国分离株 DENV 2-43 的衣壳蛋白疏水序列 ， 成功获得减毒充
18、分且能在小鼠体内产生中和抗体的减毒活疫苗株 ，为 DENV 新型减毒活疫苗的研究提供了新思路 。423 减毒嵌合疫苗 嵌合疫苗是指将病毒保护性抗原基因取代非致病的或弱毒性的活病毒载体基因组相应位置而得到的一类疫苗形式 。 DENV 结构蛋白基因 C-PrM-E 或PrM-E 是常用的靶基因 ，DENV 病毒株 、DENV 减毒活疫苗株 、 黄热病病毒减毒株及乙型脑炎减毒活疫苗株的全长感染性 cDNA 克隆是常用的载体 。 美国疾病预防控制中心与Aventis Pasteur 公司以 DENV 2-PDK-53 减毒株为骨架分别构建表达了 DENV 1、DENV 3 和 DENV 4 的 prM
19、-E 的型间嵌合病毒 DENV 12、DENV 32 和 DENV 42。 免疫小鼠实验表明其具有良好的免疫原性和保护作用 ， 目前正进行临床前期实验 。2003 年 Whitehead 等 以 DENV 430 为 载 体 ， 用DENV 2 的 C-prM-E 及 prM-E 替代 DENV 430 嵌合载体的相应部分获得嵌合病毒 rDENV2430。 将 rDENV2430 接种 20 例健康成人志愿者 ， 表明该疫苗有良好的安全性和免疫原性 。 Acambis 和 Sanofi Pasteur 以 YFl7DcDNA为 遗 传 骨 架 ， 用 DENV 4 个 型 的 prM-E 基
20、因 代 替YFl7DcDNA 的相应基因构建了各型 DENV 的种间嵌合减毒疫苗株 。 Morrison 等8把用这些疫苗株配伍成的 4 价疫苗 3 次接种 33 例健康成人志愿者进行 期临床试验 ，志愿者表现良好的耐受性 ，无明显不良反应 ，说明其应用前景良好 ，目前已进入 期临床 。以上研究结果表明 ， 以 PDK53、YF17D 等为载体构建的 DENV 嵌合病毒疫苗株 ， 在减毒的同时具有免疫原性 ，是潜在的 DENV 减毒疫苗候选株 。 同时 ， 嵌合疫苗具有多价疫苗的特征 ，不需多次接种 。 但嵌合疫苗生长缓慢 ，复制能力低 ，不能表达完整的抗原成分 ， 因而在构建嵌合疫苗时要考虑
21、其复制能力和免疫原性 。5 结语DENV 疫苗的研究已有 50 多年的历史 ，但至今尚未成功 。究其原因 ，一是 DENV 感染存在 ADE 现象 ，因此要求所研制的疫苗对 4 个血清型的 DENV 均具有均衡的免疫保护作用 ， 这无疑增加了疫苗研制的难度 。 二是 DENV 致病与免疫机制未明 ， 难以正确评价疫苗诱导的免疫保护作用和免疫病理反应 。 三是缺乏合适的动物模型 。 近年来 ，分子生物学和基因工程技术在疫苗研制中的应用 ， 极大地推动了DENV 疫苗研究的进程 ， 目前 DENV 疫苗已取得了重要进3469实 用医学杂志 2011 年第 27 卷第 19 期展 ，一些新型 DEN
22、V 疫苗已进入临床试验阶段 。 相信随着DENV 致病与免疫机制的进一步阐明和动物模型的成熟和完善 ，DENV 疫苗研制必将快速向前发展 。6 参考文献Robert Putnak J， Coller B A， Vess G， et al An evaluation ofdengue type-2 inactivated， recombinant subunit， and live-attenuated vaccine candidates in the rhesus macaque modelJ Vaccine， 2005，23（35）：44424452Liu W Q， Jiang H N，
23、Zhou J M， et al Recombinant denguevirus-like particles from Pichia pastoris： efficient productionand immunological properties J Virus Genes， 2010，40（2）：5359Leng C H， Liu S J， Tsai J P， et al A novel dengue vaccinecandidate that induces cross-neutralizing antibodies and memoryimmunity J Microbes Infe
24、ct， 2009，11（4）：288295Kitchener S， Nissen M， Nasveld P， et al Immunogenicity andsafety of two live-attenuated teravalent dengue vaccineformulations in healthy Australian adults J Vaccine， 2006，24（2）：12381241Sun W， Cunningham D， Wasserman S S， et al Phase 2clinical trial of three formulations of tetra
25、valent live attenuateddengue vaccine in flavivirus-nave adults J Hum Vaccin，2009，5（1）：3340Durbin A P， Whitehead S S， McArthur J， et al rDEN430，a live attenuated dengue virus type 4 vaccine candidate， issafe， immunogenic， and highly infectious in healthy adultvolunteers J J Infect Dis， 2005，191（5）：71
26、0718Zhu W Y， Qin C F， Chen S P， et al Attenuated dengue 2viruses with deletions in capsid protein derived from aninfectious full-length cDNA clone J Virus Res， 2007，126（4）：226232Morrison D， Legg T J， Billings C W， et al A noveltetravalent dengue vaccine is well tolerated and immunogenicagainst all 4
27、 serotypes in flavivirus-naive adults J J InfectDis， 2010，201（1）：370377（收稿 ：20110702 编辑 ：黄月薪 ）1234登革病毒 （DENV）是黄病毒属的单股正链 RNA 病毒 ，其基因组全长约为 107 kb，包含一个开放读码框架 ，编码3 种结构蛋白和 7 种非结构蛋白 。 依据 E 蛋白的抗原性不同 ，DENV 分为 4 个血清型 （DENV 1 4）。 DENV 主要以埃及伊蚊和白纹伊蚊为传播媒介 ，引起登革热 （DF）和登革出血热 （DHF）。 DF 是一种急性自限性疾病 ，而 DHF 是 DENV感染的重症
28、表现 ，伴随血小板减少和毛细血管渗漏 ，甚至可能发展成威胁生命的登革休克综合征 （DSS）。 随着人口流动性增加和全球温暖化 ，DENV 的流行区域也不断扩大 ，全球有大约 25 亿人面临 DENV 感染的威胁1。 但目前尚无理想疫苗和有效药物用于防治 DENV 感染 ， 亦缺乏合适的动物模型用于 DENV 致病机制的研究及疫苗和抗病毒药物的评估 。 既往研究中 ，一些学者相继建立了 DENV 感染的动物模型 ，本文仅就 DENV 感染小鼠模型做一综述 。1 免疫缺陷小鼠严重联合免疫缺陷 （SCID）小鼠 ，1983 年由美国 Bosma等2首先从 CB-17 近交系小鼠中发现 ，是位于第 1
29、6 号染色体的单个隐性基因 scid 发生突变所致 。 SCID 小鼠胸腺 、脾脏 、 淋巴结中的 T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞大大减少 ，细胞免疫和体液免疫功能缺陷 ， 但巨噬细胞和 NK 细胞功能未受影响 ， 已广泛应用于异种免疫功能重建 ， 人类自身免疫性疾病和免疫缺陷性疾病以及病毒学和肿瘤学等研究 。Wu 等3首次将 SCID 小鼠用于 DENV 动物模型的研究 ，将人外周血淋巴细胞 （hu-PBL）以静脉注射的方式移植入 SCID 小鼠体内以重建小鼠的免疫系统 ， 确认移植成功后以 DENV 1 攻毒 。 然而 ，小鼠感染后发病时间分散 （24 53 d），且发病率低 （13 28）
30、，说明该模型对 DENV 敏感性低 ，其应用受到了限制 。此后 ，诸多学者在此基础上将该模型加以改进 ，主要是将可作为 DENV 靶细胞的人类细胞系移植入 SCID 小鼠体内 ，确认移植成功后再进行攻毒 。例如 ，Lin 等4将人慢性粒细胞白血病细胞 K562 移植入 SCID 小鼠腹腔内 ，3 4 周后于形成肿瘤的部位注射 DENV 2（PL046 株 ），攻毒后 1 2 周小鼠表现出衰弱及四肢麻痹等症状 ，并于 2 4 周后死亡 ，脑组织及外周血中检测到高滴度的 DENV 2。 而腹腔植入已感染同种病毒的 K562 的 SCID 小鼠并未产生任何症状 。 之后 An 等5将人类肝癌细胞 H
31、epG2 细胞移植入 SCID小鼠脾脏建立动物模型 ， 通过检测小鼠血清中的人血清白蛋白 （hALB）确定移植成功 。 研究发现 ，该模型对 DENV 的敏感性较高 ：腹腔内接种 DENV 2（Tr 1751 株 ）后出现厌食 、低体温 、 后肢麻痹等症状 ； 感染后 11 d 病毒血症发生率100（1038 1057PFUmL）；5 d 血小板数开始减少 ，13 18 d 降至最低 ，部分凝血时间延长 ，红细胞比容增加 ；感染后期血清肿瘤坏死因子及尿素氮含量明显增加 。 上述症状与人类的 DHF 症状非常相似 ，因此该模型对研究 DENV 的致病机制具有较好的价值 。 此后又有研究6将 HuH-7 细胞移植到 SCID 小鼠腹腔后制成的模型用于 DENV 疫苗的评价 ，肿瘤部位注射 DENV 4 后出现病毒血症 ，另外在肝脏及doi：103969jissn1006-5725.2011.19.006作者单位 ：100069 北京市 ， 首都医科大学基础医学院病原生物学系通信作者 ：安静 E-mail：anjing60yahoocomcn登革病毒感染小鼠模型研究进展王娟 高娜 吴娜 安静56783470
