1、脂质体佐剂疫苗研究进展脂质体佐剂疫苗研究进展嘉义学譬珠喜校曼 519041646000)纛亲综述孙万邦审校泸州医学院(陈咏梅.?-255?-摘要脂质体作为蛋白质及多肽抗原的佐剂和载体已被广泛应用.通过综述脂质体在细菌,病毒,寄生虫和肿瘤疫苗中的研究应用,提示脂质体在疫苗的研制中具有广阔的应用前景.关 t 词脂质体佐剂疫苗疫苗接种防治疾病是一种非常有效的方法,但某些传统疫苗能引起不同程度的副作用.多肽亚单位疫苗以提取免疫原组分制备,可减少副作用,而亚单位免疫原组分分子小,纯度高,免疫原性弱,运用既安全又有效的佐剂来增强疫苗效果已成为当前急待解决的问题.1965 年首次制成脂质体以来,研究者们对其
2、用作疫苗的佐剂和载体已做了大量研究.随着人用脂质体疫苗资料的进一步积累,脂质体可望在不久的将来成为继铝佐剂之后又一种被批准用于人类疫苗的新型佐剂.本文主要就国外脂质体疫苗的研究进展进行简要综述.1 脂质体用作疫苗佐剂的优点脂质体是一层或多层脂质双分子膜以同心圆的形式包封而成,兼具佐剂和载体功能,类似细胞膜的微球体.大量研究表明,脂质体作为疫苗佐剂具有以下优点1:(1)抗原与脂质体单纯混合就可增强抗原的免疫原性,若包裹或锚定在脂质体上则更强;(2)可将抗原天然靶向网状内皮系统优先被巨噬细胞等抗原递呈细胞(APC)所摄取,并对包裹的抗原有缓释作用;(3) 副作用小, 程度轻,无全身毒性反应,可生物
3、降解,本身无毒性和免疫原性,尚未发现脂质体疫苗诱导变态反应和自身抗体的现象;(4) 可改变免疫应答的类型和方式,可同时诱导体液和细胞免疫,明显优于细胞免疫诱导力差的铝佐剂,增强体液免疫表现在抗体的亚型转换,滴度升高,持续时间长,还可产生免疫记忆;(5)脂质体中可包入单磷脂酰脂质 A(MPL),白细胞介素 2(IL 一2),IL 一 12,干扰素(IFN 一 ),粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)等瞳,发挥协同作用,刺激和促进 APC 对抗原的加工,递呈及免疫细胞间相互作用,进一步增强体液和细胞免疫,同时减少了常规佐剂的用量,毒性以及抗原的用量;(6) 脂质体具有抗原递呈作用,在无 AP
4、C 及主要组织相容性复合体(MHC)分子时,脂质体内高浓度抗原亦可激活某些 T 细胞,此现象也被其他实验室所证明,为免疫学注入了新理论.2 脂质体佐剂疫苗的应用2.1 细菌类脂质体佐剂疫苗2.1.1 结核病脂质体佐剂疫苗 Sinha 等口用冻融法制备脂质体包裹结核杆菌 H37Ra株培养物滤液中分离的 30kDa 的分泌蛋白免疫动物获得几乎与弗氏不完全佐剂(IFA)相同的保护效果,但其生存率比对照组更高,感染 3O 天后各器官中细菌数下降得更多,脂质体可有效代替 IFA 递呈 H37Ra 的 30kDa分泌蛋白.Lima 等用阳离子脂质体包裹结核杆菌 65kDa 热休克蛋白(hsp65),质粒D
5、NA 及其他蛋白质抗原,都产生了类似BCG 的保护性免疫 ,诱生了抗原反应性 T 细胞,以 CD8 细胞毒性 T 细胞(CTL)为主.然而注射用 IFA 包裹的蛋白质抗原的保护作李成文(1971 一), 男,硕士生,泸州医学院免疫学讲师,研究方向为分子免疫一256 一用弱,hsp65 及脂质体包裹的 hsp65 接种后 8个月期间保护作用逐渐减弱,而用脂质体包裹的?hsp65 一 DNA 或 BCG 在此期间的保护作用则能维持.2.1.2 鼠疫杆菌脂质体佐剂疫苗脂质体包裹纯化的鼠疫杆菌 F1 亚单位抗原通过鼻腔或肌肉途径免疫,均能获得高滴度血清抗体和粘膜 sIgA,并能抵抗经鼻腔或肌肉侵入的
6、110 的细菌感染5.BacaEstrada6 等用脂质体将灭活的鼠疫杆菌全菌包裹后经鼻粘膜免疫小鼠,发现小鼠粘膜分泌液(肺和鼻冲洗液)中特异性 IgA 和 IgG 滴度和肺部特异性抗体分泌细胞数明显增高,脾脏中抗原特异性细胞增殖应答增强,细胞分泌 IFN 一 7也明显增加.2.1.3 破伤风和白喉脂质体佐剂疫苗阴离子脂质体包裹破伤风类毒素和/或白喉类毒素能提高其免疫保护作用,成人志愿者口服两者混合物后特异性循环抗毒素明显增加,经鼻腔吸入途径在小动物模型显示出有效性,并且已进入早期临床试验口.Naito 等用冻干法制备的破伤风脂质体疫苗可在37保存 6 个月.2.1.4 脑膜炎球菌脂质体佐剂疫
7、苗Wright 等用脂质体包裹的脑膜炎球菌外膜蛋白(proB) 免疫动物,保护作用明显增强,用脂质体包裹的重组外膜蛋白 1(P1)免疫 Balb/c 小鼠 ,获得了高滴度的抗 P1 的亚类特异性抗体.2.2 病毒类脂质体佐剂疫苗2.2.1 人类免疫缺陷病毒(HIV)脂质体疫苗目前,预防艾滋病最迫切的任务之一就是研制出对世界上各流行 HIV 株都有效的疫苗.HIV 脂质体疫苗经志愿者临床试验表明,几乎无副反应和毒性,是安全有效的,都能产生抗原特异性抗体和 CTLg.Huang等103 报道,在体外,负载 HIV 一 1 蛋白质一脂质体复合物和 CD.的树突状细胞(Dc) 可诱导HIV 一 1 特
8、异性 CD8T 细胞应答,用脂质体国外医学预防,诊断,治疗用生物制品分册和日本血凝病毒(HVJ)包裹 HIVgp160,经鼻粘膜免疫小鼠发现其具有很强的免疫保护作用,在 HIV 感染的不同时相都能产生抗原特异性免疫应答.Okuda 等113 用阳离子脂质体包裹 HIV 一 1 质粒,亲代小鼠接种 DNA 后,发现胚胎组织中有注入的 HIV 一 1 质粒,其后代经 DNA 疫苗免疫后将诱生更强的免疫应答,表明经 HIV 一 1DNA 接种后的亲代可以把抗原特异性免疫传给其后代.研究发现用甘露糖一阳离子脂质体包裹 HIV 一 1DNA 将明显增强疫苗诱生 HIV 特异性迟发型超敏反应(DTH)和
9、CTL 能力.2.2.2 流感脂质体疫苗流感病毒的亚单位抗原成分主要是血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA).Joseph 等 D 幻用脂质体包裹 NA,HA 和含免疫刺激序列的寡脱氧核苷酸(ISSODN)经肌肉或鼻粘膜免疫小鼠 312周后发现免疫效果较单独亚单位疫苗强 30多倍,主要表现在以下几个方面:抗原特异性血清和粘膜 IgG2a 和 IgA;脾细胞增殖反应,细胞毒性和 IFN 一 7 分泌;DTH;抗病毒保护作用.说明脂质体包裹 ISSODN 后能提高其固有的佐剂活性.NinomiyaLl. 等认为甲型流感病毒的核蛋白(NP)在保护免疫中起重要作用,CD.与 CD.配体结合可使 DC 活化
10、,使非粘膜区的幼稚型 CD8T 细胞分化成为抗原特异性 CTL.用脂质体包裹 NP 和抗CD.单克隆抗体(mAb)经鼻粘膜免疫可降低肺部病毒复制,MHCI 和 MHC1 分子均不缺乏的小鼠经免疫后都能抵抗病毒感染.Babai 等乜用脂质体包裹甲型流感病毒 NA,HA 和 IL 一 2 或 IFN 一 7 或 GMCSF 免疫小鼠在幼龄鼠和大龄鼠都能诱生高滴度的抗 NA和抗 HA 抗体,并能维持至少 6 个月,还可为不同亚型病毒感染提供部分保护.Gluk 等用脂质体包裹 NA,HA 和大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)经鼻免疫,效果好 ,在成人志愿者试验已进入 I 期临床评价.将编码 HA 的质粒包裹
11、在脂质体中免疫小鼠,也可获得高滴度的血清 IgA.2.2.3 乙型肝炎脂质体疫苗 Kim 等口 H将 HBsAg 分别包裹在阳离子,阴离子脂质体中进行免疫,发现阳离子脂质体包裹的抗原在注射部位的停留作用强于阴离子脂质体,但后者产生抗体的作用强于前者,可能与其高淋巴器官靶向性有关.脂质体包裹的HBsAg 疫苗正在进行 I 期临床试验.Zhou等口用脂质体包裹 HBsAg,B72 和重组腺病毒后免疫 C57 小鼠,获得了针对 HBsAg的温和的体液免疫应答,用常规剂量加强一次可得到增强,诱生的细胞免疫应答则明显增强.惕外,Shizuma 等口明报道了用阳离子脂质体包裹丙型肝炎病毒(HCV)DNA
12、在小鼠体内既能诱导抗 HCV 非结构蛋白 3(NS3)的 Thl 和 Th2 应答,还能分泌非特异性 IL 一12 产物.2.3 寄生虫脂质体疫苗2.3.1 疟疾脂质体疫苗疟疾脂质体疫苗经志愿者临床试验表明具有高度免疫原性和安全性,能产生抗原特异性抗体和 CTL9.Burghaus 等口发现疟原虫裂殖子膜蛋白 1(MSP 一 1)的 C 端有高度保守的 19kDa 氨基序列,能在体外识别抑制侵入红细胞的 mAb的表位,用脂质体包裹 MSP 一 1 后免疫动物可获得高滴度的抗 MSP 一 1 抗体.Heppner 等用脂质体包裹含有子孢子蛋白的重组疟原虫疫苗及 MPL,接种 17 名志愿者诱生了
13、较强的抗原特异性 CTL 应答.2.3.2 利什曼原虫脂质体疫苗 Afrin等口胡用阳离子,中性,阴离子脂质体分别包裹利什曼原虫前体鞭毛蛋白抗原(LAg),发现都能诱导非常明显的保护作用,接种动物主要表现为抗原特异性 DTH 和抗体应答增强.尤其是阳离子脂质体包裹的疫苗效果最强,其次是中性脂质体,最弱的是阴离子脂质体.Shimizu 等 n 妇用脂质体包裹 LAg 免疫易感的 BALB/c 小鼠,能明显抑制足垫肿胀,一257 一免疫小鼠局部淋巴结中寄生虫数目明显减少,免疫鼠的抗利什曼原虫的保护作用与抗原特异性 IgG2a/IgG1 比率增高一致 ,同时激发体液和细胞免疫,从而成为激发抗寄生虫感
14、染的保护性疫苗.2.4 肿瘤脂质体疫苗肿瘤疫苗疗法是将自体肿瘤,培养的肿瘤细胞或异体肿瘤细胞制成的疫苗,或以基因工程疫苗进行接种以激发其自身对肿瘤的特异性应答.Asada 等蜩利用 EB 病毒脂质体在自体瘤细胞疫苗中介导表达 IL 一 12,IL 一18 获得明显效果,CTL 和自然杀伤(NK)细胞的活性都得到明显增强.脂质体一成纤维细胞生长因子(FGF 一 2)肽疫苗能阻止 FGF 一 2介导的血管生成和肿瘤生长.针对肿瘤细胞低表达或不表达 B7 等协同刺激分子,不能为细胞活化提供足够的第二信号,导致无法有效诱导免疫应答问题,Westerman 等乜将含有 B72 分子的重组肿瘤膜脂质体作为
15、一种新型非细胞疫苗,发现其免疫原性明显增强.用脂质体包裹 IFN 一 7 和肿瘤细胞疫苗,研究证实在黑素瘤中延长在抗原递呈部位出现的时间是诱生系统免疫的关键.3 影响脂质体佐剂疫苗效果的因素3.1 脂质体的制备不同制备方法直接影响到疫苗抗原的包裹率及稳定性,也是脂质体疫苗发挥免疫作用的关键.影响因素主要有.:(1)脂质体疫苗微粒的粒径:粒径大于 300nm 缺乏血管通透性,不能通过肝血管的细胞间隙,易被网状内皮系统吞噬清除,而粒径小于 50nm 虽能增加靶部位的聚集和延长其在血中的半衰期,但易相互聚集融合致抗原渗漏,故粒径常控制在 80300nm 范围;(2)脂质体组分:以饱和磷脂为成膜材料的
16、稳定性高,加入胆固醇可增强膜稳定性,适量的维生素 E 与胆固醇有协同抗氧化作用,中性磷脂酰链越长,饱和度越高,其对可溶性抗原的免疫原性增强作用越明显;(3) 脂质体的电荷 :在脂质体中-258-加入带电荷的磷脂形成双分子层,可通过降低凝集和融合速率而改善脂质体的物理稳定性,用与抗原电极性相反的脂质体包裹可提高包裹率和稳定性;(4) 抗原的性质 :既非水溶性又不与双分子膜相互作用的抗原很难包入,脂溶性或与双分子膜相互作用的抗原包入脂质体后很少再溶到周围水相,水溶性抗原被包入内核水相中,经常在油相和水相间重新分布导致抗原渗漏;(5)包裹方法:目前脂质体的制备技术日趋成熟,其制备方法已有 1O 余种
17、,主要有薄膜分散法,注入法,逆相蒸发法,熔融法,复乳法,冷冻干燥法,冻融法,表面活性剂处理法,前脂质体法,空白前脂质体法,pH 及醋酸梯度法等,其中以冻融法包裹率最高.3.2 疫苗抗原与脂质体的结合方式抗原简单与脂质体混合不如将其包裹入内或共价交联在表面.包裹入内与共价交联在表面的抗原参与的免疫途径不同.近期研究认为,两者均激活 Thl 途径,只是表面交联时辅助诱导作用更强,常诱导细胞免疫应答,对疫苗的研究工作可能更有意义2.因而研制脂质体疫苗时应根据疫苗的保护反应类型选择抗原与脂质体的结合方式.4 结语由于脂质体无毒,无免疫原性,可生物降解,具有缓释效应及易实现靶向性等优点,脂质体疫苗目前已成为疫苗领域中的热点之一.但是由于脂质体结构受多种因素影响导致稳定性差,抗原包裹率低以及佐剂作用机理尚不十分清楚,这些都是今后脂质体疫苗仍需研究的主要方向.相信随着免疫学,分子生物学,微生物学等学科的迅速发展,脂质体
