分子生物学第05章核酸的分子操作

1、解代谢,蛋白,整体性,例：,（E, H）,二、机体物质代谢不断受到精细调节,机体有精细的调节机制，调节代谢的强度、方向和速度,内外环境不断变化,影响机体代谢,适应环境的变化,三、各组织、器官物质代谢各具特色,结构不同,酶系的种类、含量不同,不同的组织、器官,代谢途径不同、功能各异,四、体内各种代谢物均具有共同的代谢池,例如：,五、ATP是机体储存能量和消耗能量的共同形式,营养物分解,六、NADPH提供合成代谢所需的还原当量,例如：,乙酰CoA,NADPH + H +,脂酸、胆固醇,磷酸戊糖途径,氧化反应,还原反应,物质代谢的相互联系 Metabolic Interrelationships,第二节,一、各种能量物质的代谢相互联系相互制约,三大营养素各自代谢途径,共同中间产物,共同代谢途径,三大营养素可在体内氧化供能。
,从能量供应的角度看，三大营养素可以互相代替，并互相制约。
一般情况下，机体优先利用燃料的次序是糖原（50-70%）、脂肪（10-40%）和蛋白质。
供能以糖及脂为主，并尽量节约蛋白质的消耗。
,饥饿时：,肝糖原分解 ，肌糖原分解,肝糖异生，蛋。

2、pUTP ，-32pATP 。
国内供应商：北京福瑞 国外供应商： UK,标记单体,在分子克隆操作中用于标记核酸分子的标记物主要是放射性同位素，如32P，33P和35S 。
在掺入核苷酸的标记过程中，只有三磷酸核苷酸的位磷酸整合到核酸链中，因此使用 位磷酸被标记的三磷酸核苷酸，如 - 32 PdATP 。
而在标记 5 末端磷酸基团的反应中一般使用位磷酸被标记的 ATP 。
放射性的信号通过X- 光片放射自显影或磷屏扫描获取。
,核酸探针标记法,1.双链DNA探针 切口平移法 首先用DNAase I 在探针DNA双链上造成缺口，然后借助于E.coli DNA聚合酶I的53外切酶活性，切去带有5-磷酸的核苷酸；同时利用该酶53聚合酶活性，使同位素标记的互补核苷酸补入缺口。
这两种活性同时作用，缺口不断向3方向移动，DNA链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。
最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸,产生均匀标记的探针。
切口平移反应受几种因素的影响: (a) 产物的比活性取决于。

3、性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。
,一、分子杂交与印迹技术的原理,（一）印迹技术,利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。
这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹技术。
,用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。
,（二）探针技术,二、印迹技术的类别及应用,（一）DNA印迹 (Southern Blotting),（二）RNA印迹 (Northern Blotting),（三）蛋白质的印迹 (Western Blotting),用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。
,用于RNA的定性定量分析。
,用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
,其他： 斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridizatio。

4、性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。
,一、分子杂交与印迹技术的原理,复性,RNA,DNA,（一）印迹技术 （二）探针技术,探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。
,二、印迹技术的类别及应用,（一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。
,（二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。
,（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
,其他 斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip),三种印迹技术的比较,。

5、donuclease),能够水解核酸分子内磷酸二酯键的酶 一般的核酸内切酶专一性不强（专一性强的不多，如，牛胰核酸酶：嘧啶核苷酸嘧啶核苷-3-磷酸）， 限制性内切酶具有很强的碱基专一性。
,限制性内切酶(restrietion endonuclease),概念：原核生物体内一类能识别双链DNA上特定的一段核苷酸序列并在特定位点切断DNA两条链的核酸内切酶。
,限制性内切酶具有很强的碱基专一性。
识别位点：个碱基的回文序列 切割结果： 平头末端(cohesive end)：切口齐的 粘性末端(blunt end)：切口交错,生物学功能：降解外面侵入的DNA，而不降解自身细胞中的DNA。
应用：基因工程的工具酶,分子手术刀,第二节 嘌呤和嘧啶的分解,一、嘌呤的分解,氧化降解：A、G 尿酸； 不同的动物将尿酸直排或进行不同程度继续降解排出体外。
浓度过高 尿结石、痛风,黄嘌呤氧化酶（肝、小肠、肾）：黄嘌呤 尿酸； 人类、灵长类动物排尿酸于尿中，但大多数的N尿素；而鸟类、爬行动物、昆虫的N尿酸； 尿酸水溶性差 过多则结晶沉积（关节、软组织、肾）。

6、子、修复突变的DNA分子和不同DNA分子间重组等一系列重要的生命反应过程。
在重组DNA技术中，它们被用来在人工控制的条件下（体外）工作。
值得一提的是，绝大多数这类酶促反应是无法用其它方法来替代完成的，这种不可替代性使这些工具酶在重组DNA技术中占据了极其重要的地位。
,限制性内切酶的发现,20世纪50年代初有两个实验室在研究噬菌体的宿主范围时相继发现，当一个噬菌体从其天然宿主，如E. coli的品系A，转到另一个品系B时，往往不能生长。
但如果进行大量的感染，则有个别噬菌体能生存下来。
研究表明，噬菌体在非天然宿主品系中不能生存，是因为噬菌体的DNA被降解了，而细菌自身的DNA却不被降解。
为了解释这种现象，人们提出了限制修饰酶假说。
,限制修饰假说,限制修饰假说认为，细菌细胞中含有两种酶，一种是限制性核酸内切酶，一种是DNA甲基化酶，这两种酶成对出现，二者对DNA分子有相同的识别序列。
DNA甲基化酶在识别序列处特定的核苷酸上甲基化。
限制性内切酶只能切割非甲基化的DNA，而不能切割不完全甲基化和完全甲基化的DNA。
因此，非甲基化的外来DNA会被限制性内切酶降解。
,限制修饰假说图示,有A甲。