1、酵 母 细 胞 自 溶 条 件 的 研 究姚 晓 红 1 吴 逸 飞 1 汤 江 武 1 叶 有 标 2 余 志 宏 21. 浙 江 省 农 业 科 学 院 植 物 保 护 与 微 生 物 研 究 所2. 浙 江 衢 州 出 入 境 检 验 检 疫 局 摘 要 研 究 NaCl 添 加 量 、 pH、 温 度 及 时 间 等 条 件 对 酵 母 培 养 物 液 体 摇 瓶 的 自 溶 效 果 的 影 响 ,确 定 其 最 佳 自 溶 条 件 :不 添 加 NaCl ,pH 5. 0 ,温 度 50 ,自 溶 40 h ,自 溶 后 样 品 中 游 离 氨 基 酸 含 量 从初 始 0 提 高
2、到 1. 068 g/ 100 mL ,可 溶 性 蛋 白 含 量 从 初 始 0 提 高 到 1. 237 g/ 100 mL ,分 别 比 单 因 素 条件 下 自 溶 时 提 高 2. 96 倍 和 1. 15 倍 。关 键 词 酵 母 液 体 培 养 自 溶 条 件 游 离 氨 基 酸 可 溶 性 蛋 白中 图 分 类 号 :S852. 6 文 献 标 识 码 :A 文 章 编 号 :1002 - 2813 (2007) 12 - 0005 - 04酵 母 菌 体 具 有 坚 固 的 细 胞 壁 ,用 作 饲 料 中 消 化率 低 ,适 口 性 差 ,因 此 ,有 必 要 对 其 进
3、行 预 处 理 。 酵母 自 溶 的 目 的 是 提 高 酵 母 的 适 口 性 和 可 消 化 性 ,减少 酵 母 生 命 活 动 带 来 的 损 失 。 此 外 ,自 溶 使 酵 母 乳黏 度 降 低 ,消 除 泡 沫 和 排 除 空 气 及 CO2 ,有 利 于 进 行干 燥 、 自 溶 指 标 及 检 测 方 法 建 立 。酵 母 自 溶 是 借 助 酵 母 菌 体 的 内 源 酶 (蛋 白 酶 、 核酸 酶 和 碳 水 化 合 物 水 解 酶 等 ) 将 菌 体 的 高 分 子 物 质水 解 成 小 分 子 而 溶 解 出 菌 体 外 的 过 程 。 在 自 溶 物 中分 别 含 有
4、 原 有 的 菌 体 和 自 溶 时 降 解 出 来 的 可 溶 性 物质 ,其 中 包 括 游 离 氨 基 酸 、 核 苷 酸 、 肽 、 糖 分 、 B 族 维生 素 、 麦 角 甾 醇 及 各 种 香 味 成 分 。 文 章 对 影 响 酵 母自 溶 的 因 素 和 条 件 进 行 较 深 入 的 研 究 和 探 讨 。1 材 料 与 方 法1. 1 材 料酵 母 摇 瓶 :于 500 mL PDA 液 体 培 养 基 中 接 一 环酵 母 斜 面 菌 种 ,于 28 ,220 r/ min 培 养 20 h。1. 2 方 法1. 2. 1 工 艺 流 程酵 母 摇 瓶 (多 瓶 ) 倒
5、 入 干 净 的 大 瓶 中 混 匀 准确 量 取 30 mL 于 50 mL 离 心 管 中 ,5 000 r/ min 离 心5 min 弃 上 清 加 入 30 mL 无 菌 水 清 洗 ,5 000 r/ min离 心 5 min 弃 上 清 再 加 入 30 mL 无 菌水 清 洗 ,5 000 r/ min 离 心 5 min 弃 上 清 得 到 酵 母泥 自 溶 (测 定 初 时 游 离 氨 基 酸 和 蛋 白 基 本 为 零 )收 稿 日 期 :2007 - 09 - 04(添 加 NaCl、 pH、 温 度 和 时 间 ) 加 热 灭 酶 ( 8095 ,10 min) 混
6、匀 测 定 比 浊 度 离 心 分 离(5 000 r/ min ,10 min) 上 清 液 测 定 游 离 氨 基 酸 和蛋 白 质 含 量 。1. 2. 2 自 溶 条 件 的 研 究1. 2. 2. 1 NaCl 添 加 对 酵 母 自 溶 效 果 的 影 响向 装 有 制 备 好 酵 母 泥 的 各 个 离 心 管 中 ,分 别 加入 NaCl 1 %、 2 %、 3 %和 4 % ,以 不 添 加 NaCl 作 对照 ,加 入 蒸 馏 水 30 mL ,每 重 复 3 管 ,置 于 50 水 浴中 ,自 溶 24 h ,加 热 灭 酶 ,测 定 各 项 指 标 。1. 2. 2.
7、2 pH对 酵 母 自 溶 效 果 的 影 响向 装 有 制 备 好 酵 母 泥 的 各 个 离 心 管 中 ,分 别 加入 pH 4. 0、 5. 0、 6. 0、 7. 0 和 8. 0 的 缓 冲 液 30 mL ,以蒸 馏 水 为 对 照 ,不 添 加 NaCl ,每 重 复 3 管 ,置 于 50 水 浴 中 ,自 溶 24 h ,加 热 灭 酶 ,测 定 各 项 指 标 。1. 2. 2. 3 温 度 对 酵 母 自 溶 效 果 的 影 响向 装 有 制 备 好 酵 母 泥 的 各 个 离 心 管 中 ,加 入30 mL pH 5. 0 醋 酸 醋 酸 钠 缓 冲 液 ,不 添 加
8、 NaCl ,每重 复 3 管 ,分 别 于 40、 50、 55、 60 和 70 水 浴 中 自 溶24 h ,加 热 灭 酶 ,测 定 各 项 指 标 。1. 2. 2. 4 时 间 对 酵 母 自 溶 效 果 的 影 响向 装 有 制 备 好 酵 母 泥 的 各 个 离 心 管 中 ,加 入30 mL pH 5. 0 醋 酸 醋 酸 钠 缓 冲 液 ,不 添 加 NaCl ,每重 复 3 管 ,于 50 水 浴 自 溶 ,每 4 h 取 样 测 定 ,连 续测 定 至 56 h。科 学 试 验 与 研 究 饲 料 研 究 FEED RESEARCH NO. 12 ,2007 5 1.
9、2. 2. 5 自 溶 条 件 正 交 试 验自 溶 条 件 的 优 化 采 用 4 因 素 3 水 平 L9 (34) 正 交试 验 ,共 设 9 个 处 理 ,每 处 理 有 3 个 重 复 试 验 , 各 参数 的 水 平 值 根 据 单 因 素 试 验 的 结 果 。 选 择 NaCl 添加 量 、 pH、 温 度 及 时 间 做 正 交 试 验 , 最 后 筛 选 出 优 化组 合 。1. 2. 3 检 测 方 法酵 母 菌 数 测 定 光 电 比 浊 法 。游 离 氨 基 酸 总 量 测 定 茚 三 酮 法 。蛋 白 质 含 量 测 定 Folin - 酚 法 。2 结 果 与 分
10、 析2. 1 酵 母 自 溶 条 件 的 研 究2. 1. 1 NaCl 添 加 对 酵 母 自 溶 效 果 的 影 响资 料 表 明 ,NaCl 能 有 效 促 进 酵 母 细 胞 自 溶 ,还具 有 防 腐 、 调 味 和 除 臭 作 用 ,是 理 想 的 质 壁 分 离 剂 。因 此 ,试 验 中 选 择 NaCl 添 加 量 分 别 为 1 %、 2 %、3 %和 4 % ,以 不 添 加 NaCl 作 对 照 ,结 果 见 图 1 和2。图 1 NaCl 对 酵 母 自 溶 前 后 比 浊 度 下 降 的 影 响注 :以 自 溶 前 0 小 时 的 比 浊 度 为 100 %计 算
11、比 浊 度 的 下 降 率图 2 NaCl 对 酵 母 自 溶 后 游 离 氨 基 酸 和 蛋 白 质 含 量 的 影 响比 浊 度 表 示 菌 液 中 的 菌 数 量 ,文 章 中 比 浊 度 下降 率 表 示 自 溶 前 后 菌 数 的 减 少 率 。 从 图 1 和 2 可见 ,随 NaCl 添 加 量 的 增 加 ,酵 母 自 溶 后 的 比 浊 度 下降 率 逐 渐 减 少 ,自 溶 后 的 蛋 白 质 和 游 离 氨 基 酸 含 量也 随 之 逐 渐 减 少 ,而 不 添 加 NaCl 的 对 照 组 从 比 浊 度下 降 率 及 自 溶 后 蛋 白 质 和 游 离 氨 基 酸 含
12、 量 来 说 ,均明 显 优 于 添 加 NaCl 的 试 验 组 。 这 项 试 验 结 果 与 钟文 辉 等 报 道 的 结 果 不 同 ,因 此 ,这 项 试 验 选 择 不 添 加NaCl。2. 1. 2 pH对 自 溶 效 果 的 影 响酵 母 细 胞 内 含 有 多 种 蛋 白 酶 ,pH影 响 这 些 酶 的活 性 ,从 而 影 响 蛋 白 质 的 降 解 程 度 。 据 报 道 ,酵 母 细胞 内 蛋 白 酶 的 适 宜 作 用 pH 一 般 在 5 8。 pH 大 于8 ,自 溶 过 程 中 易 变 黄 发 臭 。 因 此 ,选 择 pH 4. 0 8. 0进 行 自 溶 试
13、 验 ,结 果 见 图 3 和 4。图 3 pH对 酵 母 自 溶 前 后 比 浊 度 下 降 的 影 响注 :以 自 溶 前 0 小 时 的 比 浊 度 为 100 %计 算 比 浊 度 的 下 降 率图 4 pH对 酵 母 自 溶 后 游 离 氨 基 酸 和 蛋 白 质 含 量 的 影 响由 于 酵 母 自 溶 是 在 自 身 所 含 酶 的 参 与 下 进 行的 ,许 多 酶 催 化 反 应 属 于 广 义 的 酸 碱 催 化 ,各 种 酶 亦有 自 己 的 最 适 pH ,因 此 pH 的 变 化 将 会 影 响 蛋 白 质及 氨 基 酸 的 溢 出 。 从 图 3 和 4 可 见 ,
14、pH 5. 0 时 酵 母自 溶 的 效 果 最 好 ;游 离 氨 基 酸 和 蛋 白 质 溢 出 量 最 大 ,分 别 为 0. 266 和 0. 402 g/ 100 mL ,pH 6. 0 其 次 ,因 此 ,酵母 培 养 物 自 溶 的 pH选 择 为 pH 5. 0 6. 0 为 宜 。2. 1. 3 温 度 对 自 溶 效 果 的 影 响自 溶 温 度 一 般 控 制 在 40 60 。 低 于 35 自科 学 试 验 与 研 究6 饲 料 研 究 FEED RESEARCH NO. 12 ,2007溶 不 利 于 蛋 白 酶 发 挥 作 用 ,而 且 自 溶 过 程 中 易 发
15、生腐 败 变 质 。 温 度 过 高 ,则 会 使 酶 失 活 。 这 项 试 验 选择 40 70 进 行 酵 母 自 溶 试 验 ,结 果 见 图 5 和 6。图 5 温 度 对 酵 母 自 溶 前 后 比 浊 度 下 降 的 影 响注 :以 自 溶 前 0 小 时 的 比 浊 度 为 100 %计 算 比 浊 度 的 下 降 率图 6 温 度 对 酵 母 自 溶 后 游 离 氨 基 酸 和 蛋 白 质 含 量 的 影 响从 图 5 和 6 可 见 ,随 温 度 的 升 高 ,菌 数 的 减 少 量逐 渐 增 加 ,温 度 为 50 55 时 ,菌 数 减 少 量 达 到 最大 ,之 后
16、随 温 度 的 继 续 升 高 而 逐 渐 降 低 ;自 溶 后 游 离氨 基 酸 和 蛋 白 质 含 量 在 55 时 达 到 最 大 ,其 后 ,随温 度 的 升 高 而 逐 渐 减 少 。 因 此 ,自 溶 温 度 选 择 5055 最 适 宜 。2. 1. 4 时 间 对 自 溶 效 果 的 影 响从 图 7 和 8 可 见 ,随 时 间 的 延 长 ,比 浊 度 的 下 降率 逐 渐 增 加 ,到 48 h 菌 数 的 减 少 率 达 到 最 大 值 ;游离 氨 基 酸 和 蛋 白 质 含 量 随 时 间 的 延 长 不 断 提 高 。40 h后 ,游 离 氨 基 酸 含 量 增 加
17、 缓 慢 ;48 h 后 蛋 白 质 含量 增 加 缓 慢 ,由 于 自 溶 时 间 过 度 ,自 溶 物 中 略 带 氮味 。 因 此 ,选 择 44 48 h 为 最 佳 自 溶 时 间 。2. 1. 5 酵 母 自 溶 正 交 试 验2. 1. 5. 1 正 交 试 验 设 计为 提 高 酵 母 自 溶 程 度 ,就 上 述 NaCl 添 加 量 、 pH、温 度 和 时 间 作 正 交 试 验 ,选 用 L9 (34)正 交 表 ,共 设 有9 个 处 理 ,每 处 理 有 3 个 重 复 试 验 ,以 确 定 酵 母 自 溶的 最 佳 工 艺 条 件 ,具 体 水 平 设 置 见 表
18、 1。图 7 时 间 对 酵 母 自 溶 前 后 比 浊 度 的 影 响注 :以 自 溶 前 0 小 时 的 比 浊 度 为 100 %计 算 比 浊 度 的 下 降 率图 8 时 间 对 酵 母 自 溶 后 游 离 氨 基 酸 和 蛋 白 质 含 量 的 影 响表 1 正 交 试 验 因 素 水 平水 平 pH(A) NaCl 添 加 量/ %(B) 温 度/ (C) 时 间/ h(D)1 5. 0 0 45 402 5. 5 1 50 443 6. 0 2 55 482. 1. 5. 2 正 交 试 验 结 果 及 极 差 分 析对 自 溶 前 后 比 浊 度 降 低 率 的 影 响 因
19、素 依 次 为 温度 pH 时 间 NaCl 添 加 量 。 因 此 ,对 比 浊 度 的 降低 率 ,最 佳 自 溶 条 件 为 pH 5. 0 ,50 ,40 h ,不 添 加NaCl。对 自 溶 后 游 离 氨 基 酸 含 量 的 影 响 因 素 依 次 为 时间 pH 温 度 NaCl 添 加 量 。 因 此 ,对 游 离 氨 基 酸科 学 试 验 与 研 究 饲 料 研 究 FEED RESEARCH NO. 12 ,2007 7 的 最 佳 自 溶 条 件 为 pH 5. 0 ,温 度 50 ,40 h ,不 添 加NaCl。表 2 L9 (34)正 交 试 验 结 果处 理 比
20、浊 度 降 低率 / %自 溶 后 游 离氨 基 酸 含 量/ (g 100 mL - 1)自 溶 后 可 溶 性蛋 白 含 量/ (g 100 mL - 1)1 31. 01 0. 267 0. 4282 28. 01 0. 237 0. 4763 15. 21 0. 155 0. 3314 29. 34 0. 351 0. 6545 12. 55 0. 367 0. 4576 11. 70 0. 266 0. 3747 1. 02 0. 248 0. 3578 2. 66 0. 061 0. 1609 18. 52 0. 308 0. 325表 3 比 浊 度 极 差 分 析pH NaCl
21、 添 加 量/ % 温 度/ 时 间/ hK1 74. 23 59. 33 45. 37 62. 08K2 53. 59 43. 22 75. 87 38. 69K3 20. 16 45. 43 26. 74 47. 21K1 24. 74 19. 78 15. 12 20. 69K2 17. 86 14. 41 25. 29 12. 90K3 6. 72 15. 14 8. 91 15. 74R 18. 02 5. 37 16. 38 7. 79表 4 游 离 氨 基 酸 含 量 极 差 分 析pH NaCl 添 加 量/ % 温 度/ 时 间/ hK1 0. 659 0. 866 0. 5
22、94 0. 942K2 0. 984 0. 665 0. 896 0. 751K3 0. 617 0. 729 0. 770 0. 567K1 0. 220 0. 289 0. 198 0. 314K2 0. 328 0. 222 0. 299 0. 250K3 0. 206 0. 243 0. 257 0. 189R 0. 122 0. 067 0. 101 0. 125表 5 可 溶 性 蛋 白 含 量 极 差 分 析pH NaCl 添 加 量/ % 温 度/ 时 间/ hK1 1. 235 1. 439 0. 962 1. 210K2 1. 485 1. 093 1. 455 1. 20
23、7K3 0. 842 1. 030 1. 145 1. 145K1 0. 412 0. 480 0. 321 0. 403K2 0. 495 0. 364 0. 485 0. 402K3 0. 281 0. 343 0. 382 0. 382R 0. 214 0. 137 0. 164 0. 021对 自 溶 后 可 溶 性 蛋 白 含 量 的 影 响 因 素 依 次 为pH 温 度 NaCl 添 加 量 时 间 。 因 此 ,对 可 溶 性 蛋白 的 最 佳 自 溶 条 件 是 pH 5. 0 ,温 度 50 ,40 h ,不 添加 NaCl。2. 1. 5. 3 正 交 试 验 小 结在
24、正 交 试 验 最 佳 条 件 下 ,即 pH 5. 0 ,温 度 50 ,不 添 加 NaCl 时 自 溶 40 h ,自 溶 后 样 品 中 可 溶 性 蛋 白含 量 为 1. 237 g/ 100 mL , 游 离 氨 基 酸 含 量 为1. 068 g/ 100 mL ,分 别 比 单 因 素 条 件 下 含 量 提 高 1. 15倍 和 2. 96倍 。3 小 结通 过 对 酵 母 培 养 物 摇 瓶 中 酵 母 的 多 次 洗 涤 、 离心 和 提 取 ,得 到 自 溶 初 始 的 酵 母 泥 ,经 多 次 重 复 测定 ,其 中 的 游 离 氨 基 酸 和 可 溶 性 蛋 白 的
25、 含 量 几 乎 为零 ,因 此 ,试 验 中 测 定 的 自 溶 后 游 离 氨 基 酸 和 可 溶 性蛋 白 含 量 应 为 自 溶 所 产 生 的 。对 酵 母 自 溶 条 件 的 研 究 ,首 先 通 过 单 因 子 试 验 ,确 定 最 适 自 溶 条 件 为 不 添 加 NaCl ,pH 5. 0 ,温 度55 ,时 间 为 44 48 h。 在 此 基 础 上 进 行 4 因 素 3水 平 的 正 交 试 验 ,筛 选 出 酵 母 的 最 佳 自 溶 条 件 为 :不添 加 NaCl ,pH 5. 0、 温 度 50 ,在 此 条 件 下 自 溶40 h ,自 溶 后 可 溶 性
26、 蛋 白 含 量 为 1. 237 g/ 100 mL ,游离 氨 基 酸 含 量 为 1. 068 g/ 100 mL ,分 别 比 单 因 素 条件 下 自 溶 时 提 高 1. 15 倍 和 2. 96 倍 。参 考 文 献1 钱 存 柔 ,黄 仪 秀 . 微 生 物 学 试 验 教 程 . 北 京 :北 京大 学 出 版 社 ,19992 沈 萍 ,范 秀 容 ,李 广 武 . 微 生 物 学 试 验 (第 3 版 ) .北 京 :高 等 教 育 出 版 社 ,19993 钟 文 辉 ,吴 小 荣 ,殷 蔚 中 . 废 弃 啤 酒 酵 母 自 溶 研究 . 郑 州 粮 食 学 院 学 报 ,1996 ,17 (1) :11 - 144 高 玉 荣 . 啤 酒 废 酵 母 自 溶 条 件 的 研 究 . 酿 酒 科技 ,2002 (2) :74 - 765 方 尚 玲 ,马 丽 ,吴 思 方 . 影 响 酵 母 自 溶 因 素 与 条件 的 研 究 . 粮 食 与 饲 料 工 业 ,2000 (3) :21 - 23通 讯 地 址 : 浙 江 省 杭 州 市 石 桥 路 198 号 310021科 学 试 验 与 研 究8 饲 料 研 究 FEED RESEARCH NO. 12 ,2007
