1、TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD q P C R q P C R q P C R q P C R 系 统 系 统 系 统 系 统 “ 从 从 从 从RNA 提 取 到 荧 光 定 量 提 取 到 荧 光 定 量 提 取 到 荧 光 定 量 提 取 到 荧 光 定 量PCR” 解 决 方 案 解 决 方 案 解 决 方 案 解 决 方 案内 容 概 要 内 容 概 要 内 容 概 要 内 容 概 要 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量PCR 的 原 理 的 原 理 的
2、 原 理 的 原 理 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量PCR 的 标 记 方 法 的 标 记 方 法 的 标 记 方 法 的 标 记 方 法 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量PCR 解 析 方 法 解 析 方 法 解 析 方 法 解 析 方 法 SYBR 法 实 验 流 程 及 注 意 事 项 法 实 验 流 程 及 注 意 事 项 法 实 验 流 程 及 注 意 事 项 法 实 验 流 程 及 注 意 事 项 TIANGEN 公 司 荧 光 定 量 产 品 选 择 指 南 公 司 荧 光 定 量 产 品 选 择 指 南 公 司 荧
3、光 定 量 产 品 选 择 指 南 公 司 荧 光 定 量 产 品 选 择 指 南实 时 定 量 实 时 定 量 实 时 定 量 实 时 定 量PCR 技 术 技 术 技 术 技 术 ： ： ： ： 利 用 荧 光 信 号 的 变 化 实 时 检 测PCR 扩 增 反 应 中 每 一 个 循 环 扩 增 产 物 量 的 变 化 ， 通 过Ct 值 和 标 准 曲 线 的 关 系 对 起 始 模 板 进 行 定 量 分 析 与 常 规 与 常 规 与 常 规 与 常 规 PCR 技 术 比 较 技 术 比 较 技 术 比 较 技 术 比 较 ： ： ： ： 对PCR 扩 增 反 应 的 终 点
4、产 物 进 行 定 量 和 定 性 分 析 ， 无 法 对 起 始 模 板 准 确 定 量 ， 无 法 对 扩 增 反 应 实 时 检 测 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量PCR 原 理 原 理 原 理 原 理 定义 定义 定义 定义 扩 增 曲 线 扩 增 曲 线 扩 增 曲 线 扩 增 曲 线 荧 光 阈 值 荧 光 阈 值 荧 光 阈 值 荧 光 阈 值 Ct 值 值 值 值 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量PCR 原 理 原 理 原 理 原 理 常用名词概念 常用名词概念 常用名词概念 常用名词概念Cycle （ （ （ （
5、循 环 数 循 环 数 循 环 数 循 环 数 ） ） ） ） Rn （ （ （ （ 荧 光 强 度 荧 光 强 度 荧 光 强 度 荧 光 强 度 ） ） ） ） Baseline Log liner phase 平 台 期 平 台 期 平 台 期 平 台 期 荧光基团 荧光检测元件 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量PCR 原 理 原 理 原 理 原 理 扩增曲线 扩增曲线 扩增曲线 扩增曲线Cycle （ （ （ （ 循 环 数 循 环 数 循 环 数 循 环 数 ） ） ） ） Rn （ （ （ （ 荧 光 强 度 荧 光 强 度 荧 光 强 度 荧 光 强
6、 度 ） ） ） ） Baseline Log liner phase 前15 个 循 环 信 号 作 为 荧 光 本 底 信 号 （baseline ） 荧 光 域 值 的 缺 省 设 置 是 3 15 个 循 环 的 荧 光 信 号 的 标 准 偏 差 的10 倍 手 动 设 置 ： 大 于 荧 光 背 景 值 和 阴 性 对 照 的 荧 光 最 高 值 ； 进 入 指 数 期 的 最 初 阶 段 真 正 的 信 号: 荧 光 信 号 超 过 域 值 Threshold 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量PCR 原 理 原 理 原 理 原 理 荧光域值 荧光域值
7、 荧光域值 荧光域值 平 台 期 平 台 期 平 台 期 平 台 期Ct 值 的 值 的 值 的 值 的 定 义 定 义 定 义 定 义 ： ： ： ： PCR 扩 增 过 程 中 ， 扩 增 产 物 的 荧 光 信 号 达 到 设 定 的 阈 值 时 所 经 过 的 扩 增 循 环 次 数 Cycle （ （ （ （ 循 环 数 循 环 数 循 环 数 循 环 数 ） ） ） ） Rn （ （ （ （ 荧 光 强 度 荧 光 强 度 荧 光 强 度 荧 光 强 度 ） ） ） ） 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量PCR 原 理 原 理 原 理 原 理 Ct Ct
8、 Ct Ct值 值 值 值理 想 的PCR 反 应 X n X 0 2 n * X n ： ： ： ： 第 第 第 第n 次 循 环 后 扩 增 产 物 数 量 次 循 环 后 扩 增 产 物 数 量 次 循 环 后 扩 增 产 物 数 量 次 循 环 后 扩 增 产 物 数 量 X 0 ： ： ： ： 起 始 模 板 数 量 起 始 模 板 数 量 起 始 模 板 数 量 起 始 模 板 数 量 n ： ： ： ： 扩 增 循 环 数 扩 增 循 环 数 扩 增 循 环 数 扩 增 循 环 数 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量PCR 原 理 原 理 原 理 原
9、理 Ct Ct Ct Ct值定量的数学原理 值定量的数学原理 值定量的数学原理 值定量的数学原理非 理 想 的PCR 反 应 X n X 0 （1 En ） n * X n ： ： ： ： 第 第 第 第n 次 循 环 后 扩 增 产 物 数 量 次 循 环 后 扩 增 产 物 数 量 次 循 环 后 扩 增 产 物 数 量 次 循 环 后 扩 增 产 物 数 量 X 0 ： ： ： ： 起 始 模 板 数 量 起 始 模 板 数 量 起 始 模 板 数 量 起 始 模 板 数 量 n ： ： ： ： 扩 增 循 环 数 扩 增 循 环 数 扩 增 循 环 数 扩 增 循 环 数 En ： ：
10、 ： ： 扩 增 效 率 扩 增 效 率 扩 增 效 率 扩 增 效 率 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量PCR 原 理 原 理 原 理 原 理 Ct Ct Ct Ct值定量的数学原理 值定量的数学原理 值定量的数学原理 值定量的数学原理在 扩 增 产 物 达 到 荧 光 阈 值 时 X Ct X 0 （1 En ） Ct M （1 ） * X Ct ： ： ： ： 荧 光 扩 增 信 号 达 到 阈 值 时 扩 增 产 物 的 量 荧 光 扩 增 信 号 达 到 阈 值 时 扩 增 产 物 的 量 荧 光 扩 增 信 号 达 到 阈 值 时 扩 增 产 物 的
11、量 荧 光 扩 增 信 号 达 到 阈 值 时 扩 增 产 物 的 量 ， ， ， ， 在 阈 值 设 定 以 后 在 阈 值 设 定 以 后 在 阈 值 设 定 以 后 在 阈 值 设 定 以 后 ， ， ， ， 它 是 一 个 常 数 它 是 一 个 常 数 它 是 一 个 常 数 它 是 一 个 常 数 ， ， ， ， 定 为 定 为 定 为 定 为M 方 程 式 （1 ） 两 边 同 取 对 数 得 ： LogM LogX 0 * （ （ （ （1 En ） Ct （2 ） 整 理 方 程 式 （2 ） ： LogX 0 Log M Ct Log （1 En ） 荧 光 定 量 荧 光
12、 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量PCR 原 理 原 理 原 理 原 理 Ct Ct Ct Ct值定量的数学原理 值定量的数学原理 值定量的数学原理 值定量的数学原理Cycle number Ck 10 4 Ck 10 2 Sample Log of DNA concentration 起 始 模 板DNA 量 越 多 ， 荧 光 达 到 域 值 的 循 环 数 越 少 ， 即 Ct 值 越 小 。 Log 模 板 起 始 浓 度 与Ct 值 呈 线 性 关 系 。 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量PCR 原 理 原 理 原 理 原 理 Ct Ct Ct C
13、t值与模板起始量的关系 值与模板起始量的关系 值与模板起始量的关系 值与模板起始量的关系线性关系 线性关系 线性关系 线性关系、 、 、 、扩增效率确认 扩增效率确认 扩增效率确认 扩增效率确认 检测灵敏度确认 检测灵敏度确认 检测灵敏度确认 检测灵敏度确认 标准曲线斜率 标准曲线斜率 标准曲线斜率 标准曲线斜率: : : : - - - -3 3 3 3 - - - -3.5 3.5 3.5 3.5 35Cycles 35Cycles 35Cycles 35Cycles内 内 内 内可得到好的定量结果 可得到好的定量结果 可得到好的定量结果 可得到好的定量结果 如果采用 如果采用 如果采用
14、如果采用SYBR SYBR SYBR SYBR检测方法 检测方法 检测方法 检测方法， ， ， ，30Cycles 30Cycles 30Cycles 30Cycles内无非特异性产物扩增 内无非特异性产物扩增 内无非特异性产物扩增 内无非特异性产物扩增 35 Cycles 35 Cycles 35 Cycles 35 Cycles内无引物二聚体产生 内无引物二聚体产生 内无引物二聚体产生 内无引物二聚体产生 相关系数 相关系数 相关系数 相关系数（ （ （ （R R R R 2 2 2 2 ）： ）： ）： ）：大于 大于 大于 大于0.98 0.98 0.98 0.98 荧 光 定 量 荧
15、 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量PCR 反 应 有 效 性 的 确 认 反 应 有 效 性 的 确 认 反 应 有 效 性 的 确 认 反 应 有 效 性 的 确 认 PCR PCR PCR PCR扩增效率 扩增效率 扩增效率 扩增效率（ （ （ （E E E E） ） ） ）:0.9 :0.9 :0.9 :0.9- - - -1.2 1.2 1.2 1.2 定 性 分 析 研 究 定 性 分 析 研 究 定 性 分 析 研 究 定 性 分 析 研 究 ： ： ： ： 杂 合 或 纯 合 子 鉴 定 ， （SNPs ） 分 析 等 绝 对 定 量 研 究 绝 对 定 量 研 究 绝
16、 对 定 量 研 究 绝 对 定 量 研 究 ： ： ： ： 病 毒 和 病 原 菌 定 量 分 析 ， 基 因 拷 贝 数 定 量 ， GMO 定 量 检 测 等 相 对 定 量 研 究 相 对 定 量 研 究 相 对 定 量 研 究 相 对 定 量 研 究 ： ： ： ：mRNA 表 达 量 分 析 ，siRNA 效 果 确 认 ， 基 因 芯 片 结 果 验 证 ， 差 异 显 示 结 果 验 证 等 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量PCR 技 术 的 应 用 技 术 的 应 用 技 术 的 应 用 技 术 的 应 用内 容 概 要 内 容 概 要 内 容
17、概 要 内 容 概 要 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量PCR 的 原 理 的 原 理 的 原 理 的 原 理 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量PCR 的 标 记 方 法 的 标 记 方 法 的 标 记 方 法 的 标 记 方 法 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量PCR 的 解 析 方 法 的 解 析 方 法 的 解 析 方 法 的 解 析 方 法 SYBR 法 实 验 流 程 及 注 意 事 项 法 实 验 流 程 及 注 意 事 项 法 实 验 流 程 及 注 意 事 项 法 实 验 流 程 及 注
18、意 事 项 TIANGEN 公 司 荧 光 定 量 产 品 选 择 指 南 公 司 荧 光 定 量 产 品 选 择 指 南 公 司 荧 光 定 量 产 品 选 择 指 南 公 司 荧 光 定 量 产 品 选 择 指 南非 特 异 性 荧 光 标 记 非 特 异 性 荧 光 标 记 非 特 异 性 荧 光 标 记 非 特 异 性 荧 光 标 记 SYBR Green I 特 异 性 荧 光 标 记 特 异 性 荧 光 标 记 特 异 性 荧 光 标 记 特 异 性 荧 光 标 记 TaqMan Probe 分 子 信 标 常 用 荧 光 标 记 方 法 常 用 荧 光 标 记 方 法 常 用 荧
19、 光 标 记 方 法 常 用 荧 光 标 记 方 法SYBR Green I 染 料 法 染 料 法 染 料 法 染 料 法原理 原理 原理 原理 SYBR Green I 是 一 种 结 合 于 所 有dsDNA 双 螺 旋 小 沟 区 域 的 具 有 绿 色 激 发 波 长 的 染 料 。 SYBR Green I SYBR Green I SYBR Green I SYBR Green I SYBR Green I SYBR Green I SYBR Green I SYBR Green I热 热 热 热 热 热 热 热 变 变 变 变 变 变 变 变 性 性 性 性 性 性 性 性 引
20、物退火 引物退火 引物退火 引物退火 引物退火 引物退火 引物退火 引物退火 延伸反应 延伸反应 延伸反应 延伸反应 延伸反应 延伸反应 延伸反应 延伸反应 SYBR Green I 染 料 法 染 料 法 染 料 法 染 料 法作用机理 作用机理 作用机理 作用机理问 题 点 问 题 点 问 题 点 问 题 点 ： ： ： ： SYBR Green I 与 任 何 双 链 与 任 何 双 链 与 任 何 双 链 与 任 何 双 链DNA 进 行 结 合 后 散 发 荧 光 进 行 结 合 后 散 发 荧 光 进 行 结 合 后 散 发 荧 光 进 行 结 合 后 散 发 荧 光 ， ， ，
21、， 因 因 因 因 此 如 果 反 应 体 系 中 有 非 特 异 性 扩 增 或 引 物 二 聚 体 的 产 生 此 如 果 反 应 体 系 中 有 非 特 异 性 扩 增 或 引 物 二 聚 体 的 产 生 此 如 果 反 应 体 系 中 有 非 特 异 性 扩 增 或 引 物 二 聚 体 的 产 生 此 如 果 反 应 体 系 中 有 非 特 异 性 扩 增 或 引 物 二 聚 体 的 产 生 ， ， ， ， 也 将 也 将 也 将 也 将 同 时 被 检 测 同 时 被 检 测 同 时 被 检 测 同 时 被 检 测 ， ， ， ， 从 而 可 能 导 致 检 测 结 果 不 准 确
22、从 而 可 能 导 致 检 测 结 果 不 准 确 从 而 可 能 导 致 检 测 结 果 不 准 确 从 而 可 能 导 致 检 测 结 果 不 准 确 。 。 。 。 SYBR Green I 染 料 法 染 料 法 染 料 法 染 料 法问题点与关键点 问题点与关键点 问题点与关键点 问题点与关键点 关 键 点 关 键 点 关 键 点 关 键 点 ： ： ： ： 设 计 合 适 引 物 设 计 合 适 引 物 设 计 合 适 引 物 设 计 合 适 引 物 ， ， ， ， 防 止 非 特 异 性 扩 增 防 止 非 特 异 性 扩 增 防 止 非 特 异 性 扩 增 防 止 非 特 异
23、性 扩 增 ！ ！ ！ ！将 温 度 与 荧 光 强 度 的 变 化 求 导 将 温 度 与 荧 光 强 度 的 变 化 求 导 将 温 度 与 荧 光 强 度 的 变 化 求 导 将 温 度 与 荧 光 强 度 的 变 化 求 导 将 温 度 与 荧 光 强 度 的 变 化 求 导 将 温 度 与 荧 光 强 度 的 变 化 求 导 将 温 度 与 荧 光 强 度 的 变 化 求 导 将 温 度 与 荧 光 强 度 的 变 化 求 导 ( (- -dI/dT dI/dT) ) 原 始 图 谱 原 始 图 谱 原 始 图 谱 原 始 图 谱 对 数 图 谱 对 数 图 谱 对 数 图 谱 对
24、数 图 谱 SYBR Green I 染 料 法 染 料 法 染 料 法 染 料 法融解曲线 融解曲线 融解曲线 融解曲线融 解 曲 线 分 析 融 解 曲 线 分 析 融 解 曲 线 分 析 融 解 曲 线 分 析 ， ， ， ， 单 一 峰 单 一 峰 单 一 峰 单 一 峰 无 非 特 异 性 荧 光 无 非 特 异 性 荧 光 无 非 特 异 性 荧 光 无 非 特 异 性 荧 光 定 量 准 确 定 量 准 确 定 量 准 确 定 量 准 确 融 解 曲 线 分 析 融 解 曲 线 分 析 融 解 曲 线 分 析 融 解 曲 线 分 析 ， ， ， ， 出 现 杂 峰 出 现 杂 峰
25、 出 现 杂 峰 出 现 杂 峰 其 他 产 物 出 现 非 特 异 性 荧 其 他 产 物 出 现 非 特 异 性 荧 其 他 产 物 出 现 非 特 异 性 荧 其 他 产 物 出 现 非 特 异 性 荧 光 光 光 光 ， ， ， ， 因 此 定 量 不 准 确 因 此 定 量 不 准 确 因 此 定 量 不 准 确 因 此 定 量 不 准 确 SYBR Green I 染 料 法 染 料 法 染 料 法 染 料 法融解曲线 融解曲线 融解曲线 融解曲线特异性产物 特异性产物 特异性产物 特异性产物 特异性产物 特异性产物 特异性产物 特异性产物 非特异产物 非特异产物 非特异产物 非特
26、异产物 非特异产物 非特异产物 非特异产物 非特异产物/ /引物二聚体 引物二聚体 引物二聚体 引物二聚体 引物二聚体 引物二聚体 引物二聚体 引物二聚体 SYBR Green I 染 料 法 染 料 法 染 料 法 染 料 法融解曲线 融解曲线 融解曲线 融解曲线Taqman 探 针 法 探 针 法 探 针 法 探 针 法原理 原理 原理 原理 5 端 标 记 有 报 告 基 团(Reporter, R) ， 如FAM 、VIC 等 3 端 标 记 有 荧 光 淬 灭 基 团 (Quencher, Q) 探 针 完 整 ，R 发 射 的 荧 光 能 量 被Q 基 团 吸 收 ， 无 荧 光
27、， R 与Q 分 开 ， 发 荧 光 Taq 酶 有 5 3 外 切 核 酸 酶 活 性 ， 可 水 解 探 针Taqman 探 针 法 探 针 法 探 针 法 探 针 法工作机理 工作机理 工作机理 工作机理 热变性 热变性 热变性 热变性 热变性 热变性 热变性 热变性 引物和探针与模板退火 引物和探针与模板退火 引物和探针与模板退火 引物和探针与模板退火 引物和探针与模板退火 引物和探针与模板退火 引物和探针与模板退火 引物和探针与模板退火 延伸反应 延伸反应 延伸反应 延伸反应 延伸反应 延伸反应 延伸反应 延伸反应 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 报告基团 报告基团
28、报告基团 报告基团 报告基团 报告基团 报告基团 报告基团 淬灭基团 淬灭基团 淬灭基团 淬灭基团 淬灭基团 淬灭基团 淬灭基团 淬灭基团 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA聚合酶 聚合酶 聚合酶 聚合酶 聚合酶 聚合酶 聚合酶 聚合酶 引物 引物 引物 引物 引物 引物 引物 引物 R R R R R R R RTaqman 探 针 法 探 针 法 探 针 法 探 针 法设计原则 设计原则 设计原则 设计原则 特 特 特 特 特 特 特 特 异 异 异 异 异 异 异 异 性 性 性 性 性 性 性 性 互 互 互
29、互 互 互 互 互 补 补 补 补 补 补 补 补 性 性 性 性 性 性 性 性 5 5 5 5 5 5 5 5 末端序列 末端序列 末端序列 末端序列 末端序列 末端序列 末端序列 末端序列 序 序 序 序 序 序 序 序 列 列 列 列 列 列 列 列 Tm Tm Tm Tm Tm Tm Tm Tm 值 值 值 值 值 值 值 值 Probe Probe Probe Probe Probe Probe Probe Probe 长度 长度 长度 长度 长度 长度 长度 长度 BLAST BLAST BLAST BLAST BLAST BLAST BLAST BLAST检索确认 检索确认 检
30、索确认 检索确认 检索确认 检索确认 检索确认 检索确认Probe Probe Probe Probe Probe Probe Probe Probe特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 特异性 Probe Probe Probe Probe Probe Probe Probe Probe内部或 内部或 内部或 内部或 内部或 内部或 内部或 内部或Probe Probe Probe Probe Probe Probe Probe Probe与两条引物之间避免 与两条引物之间避免 与两条引物之间避免 与两条引物之间避免 与两条引物之间避免 与两条引物之间避免 与两条引物之间避
31、免 与两条引物之间避免3base 3base 3base 3base 3base 3base 3base 3base以上的互补序列 以上的互补序列 以上的互补序列 以上的互补序列 以上的互补序列 以上的互补序列 以上的互补序列 以上的互补序列 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针 探针5 5 5 5 5 5 5 5 末端的第一个碱基不能是 末端的第一个碱基不能是 末端的第一个碱基不能是 末端的第一个碱基不能是 末端的第一个碱基不能是 末端的第一个碱基不能是 末端的第一个碱基不能是 末端的第一个碱基不能是G G G G G G G G 目的序列 目的序列 目的序列 目的序列 目的序列 目的序
32、列 目的序列 目的序列GC GC GC GC GC GC GC GC含量相对较高的区域设计 含量相对较高的区域设计 含量相对较高的区域设计 含量相对较高的区域设计 含量相对较高的区域设计 含量相对较高的区域设计 含量相对较高的区域设计 含量相对较高的区域设计 整体上碱基不能过偏 整体上碱基不能过偏 整体上碱基不能过偏 整体上碱基不能过偏 整体上碱基不能过偏 整体上碱基不能过偏 整体上碱基不能过偏 整体上碱基不能过偏 个别部分避免 个别部分避免 个别部分避免 个别部分避免 个别部分避免 个别部分避免 个别部分避免 个别部分避免GC rich GC rich GC rich GC rich GC
33、rich GC rich GC rich GC rich或 或 或 或 或 或 或 或AT rich ( AT rich ( AT rich ( AT rich ( AT rich ( AT rich ( AT rich ( AT rich (特别是 特别是 特别是 特别是 特别是 特别是 特别是 特别是3 3 3 3 3 3 3 3 端 端 端 端 端 端 端 端) ) ) ) ) ) ) )避免 避免 避免 避免 避免 避免 避免 避免T/C T/C T/C T/C T/C T/C T/C T/C连续 连续 连续 连续， ， ， ， 连续 连续 连续 连续， ， ， ，A/C A/C A/
34、C A/C A/C A/C A/C A/C连续 连续 连续 连续 连续 连续 连续 连续) ) ) ) ) ) ) ) 探针的 探针的 探针的 探针的 探针的 探针的 探针的 探针的Tm Tm Tm Tm Tm Tm Tm Tm比 比 比 比 比 比 比 比引物高 引物高 引物高 引物高 引物高 引物高 引物高 引物高8 8 8 8 8 8 8 8- - - - - - - -10 10 10 10 10 10 10 10 20 20 20 20 20 20 20 20- - - - - - - -24bp 24bp 24bp 24bp 24bp 24bp 24bp 24bp FAM, HEX
35、, TET, FAM, HEX, TET, FAM, HEX, TET, FAM, HEX, TET, FAM, HEX, TET, FAM, HEX, TET, FAM, HEX, TET, FAM, HEX, TET, JOE, TAMRA, ROX JOE, TAMRA, ROX JOE, TAMRA, ROX JOE, TAMRA, ROX JOE, TAMRA, ROX JOE, TAMRA, ROX JOE, TAMRA, ROX JOE, TAMRA, ROX等 等 等 等 等 等 等 等 非 非 非 非 非 非 非 非荧光物质 荧光物质 荧光物质 荧光物质 荧光物质 荧光物质
36、荧光物质 荧光物质 Eclipse Eclipse Eclipse Eclipse Eclipse Eclipse Eclipse Eclipse FAM, HEX, TET, JOE FAM, HEX, TET, JOE FAM, HEX, TET, JOE FAM, HEX, TET, JOE FAM, HEX, TET, JOE FAM, HEX, TET, JOE FAM, HEX, TET, JOE FAM, HEX, TET, JOE等 等 等 等 等 等 等 等 荧光物质 荧光物质 荧光物质 荧光物质 荧光物质 荧光物质 荧光物质 荧光物质 TAMRA TAMRA TAMRA T
37、AMRA TAMRA TAMRA TAMRA TAMRA 建议使用的 建议使用的 建议使用的 建议使用的 建议使用的 建议使用的 建议使用的 建议使用的5 5 5 5 5 5 5 5 报告基团 报告基团 报告基团 报告基团 报告基团 报告基团 报告基团 报告基团 淬灭基团性质 淬灭基团性质 淬灭基团性质 淬灭基团性质 淬灭基团性质 淬灭基团性质 淬灭基团性质 淬灭基团性质 3 3 3 3 3 3 3 3 淬灭基团 淬灭基团 淬灭基团 淬灭基团 淬灭基团 淬灭基团 淬灭基团 淬灭基团 Taqman 探 针 法 探 针 法 探 针 法 探 针 法荧光标记物的选择 荧光标记物的选择 荧光标记物的选择
38、 荧光标记物的选择实 时 荧 光 定 量 实 时 荧 光 定 量 实 时 荧 光 定 量 实 时 荧 光 定 量PCR 的 分 类 的 分 类 的 分 类 的 分 类 几 种 方 法 的 比 较 几 种 方 法 的 比 较 几 种 方 法 的 比 较 几 种 方 法 的 比 较 病原体检测，疾病耐药基 因研究,药物疗效考核,遗 传疾病的诊断 价格高 只适合特定目标 可以进行多重PCR 特异性高 重复性好 TaqMan 方法 适合科研中对各种目的基 因定量分析，基因表达量 的研究，转基因重组动植 物的研究 引物要求高 易出现非特异性带 不能进行多重PCR 适用性广 灵敏 方便 便宜 SYBR G
39、reen I 方法 适 适 适 适 用 用 用 用 范 范 范 范 围 围 围 围 缺 缺 缺 缺 点 点 点 点 优点 优点 优点 优点 方 方 方 方 法 法 法 法内 容 概 要 内 容 概 要 内 容 概 要 内 容 概 要 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量PCR 原 理 原 理 原 理 原 理 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量PCR 的 标 记 方 法 的 标 记 方 法 的 标 记 方 法 的 标 记 方 法 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量 荧 光 定 量PCR 的 解 析 方 法 的 解 析 方 法 的
40、解 析 方 法 的 解 析 方 法 SYBR 法 实 验 流 程 及 注 意 事 项 法 实 验 流 程 及 注 意 事 项 法 实 验 流 程 及 注 意 事 项 法 实 验 流 程 及 注 意 事 项 TIANGEN 公 司 荧 光 定 量 产 品 选 择 指 南 公 司 荧 光 定 量 产 品 选 择 指 南 公 司 荧 光 定 量 产 品 选 择 指 南 公 司 荧 光 定 量 产 品 选 择 指 南绝对定量解析方法 绝对定量解析方法 绝对定量解析方法 绝对定量解析方法 25 绝 对 定 量 的 定 义 绝 对 定 量 的 定 义 绝 对 定 量 的 定 义 绝 对 定 量 的 定 义
41、 Log （ 起 始 浓 度 ） 与 循 环 数 呈 线 性 关 系 ， 通 过 已 知 起 始 拷 贝 数 的 标 准 品 可 作 出 标 准 曲 线, 即 得 到 该 扩 增 反 应 存 在 的 线 性 关 系 根 据 样 品Ct 值 ， 就 可 以 计 算 出 样 品 中 所 含 的 模 板 量质 粒 标 准 品 的 制 备 质 粒 标 准 品 的 制 备 质 粒 标 准 品 的 制 备 质 粒 标 准 品 的 制 备 PCR PCR PCR PCR 目的基因克隆 目的基因克隆 目的基因克隆 目的基因克隆 质粒提取 质粒提取 质粒提取 质粒提取， ， ， ， 质粒提取 质粒提取 质粒提取
42、 质粒提取， ， ， ，OD OD OD OD OD OD OD OD值定量 值定量 值定量 值定量， ， ， ，将质粒梯度稀释作为标准品使用 将质粒梯度稀释作为标准品使用 将质粒梯度稀释作为标准品使用 将质粒梯度稀释作为标准品使用 值定量 值定量 值定量 值定量， ， ， ，将质粒梯度稀释作为标准品使用 将质粒梯度稀释作为标准品使用 将质粒梯度稀释作为标准品使用 将质粒梯度稀释作为标准品使用 目的基因 目的基因 目的基因 目的基因 目的基因 目的基因 目的基因 目的基因 目的基因 目的基因 目的基因 目的基因 目的基因 目的基因 目的基因 目的基因 目的基因 目的基因 目的基因 目的基因 目
43、的基因 目的基因 目的基因 目的基因 质粒 质粒 质粒 质粒 目的基因 目的基因 目的基因 目的基因 目的基因 目的基因 目的基因 目的基因 基因组 基因组 基因组 基因组DNA DNA DNA DNA拷 贝 数 的 计 算 拷 贝 数 的 计 算 拷 贝 数 的 计 算 拷 贝 数 的 计 算 ： ： ： ： 待 测 样 本 浓 度 （ng/ul ） OD260 50 稀 释 倍 数 样 本 分 子 量= 碱 基 数 324 待 测 样 本 拷 贝 数 （copies/ul ）= 待 测 样 本 浓 度/ 样 本 分 子 量 6 10 14 倍 比 梯 度 稀 释 方 法 倍 比 梯 度 稀
44、 释 方 法 倍 比 梯 度 稀 释 方 法 倍 比 梯 度 稀 释 方 法 ： ： ： ： 1v 原 液( 标 准 品i) +9v 稀 释 缓 冲 液 ， 得 标 准 品ii 1v 标 准 品ii+9v 稀 释 缓 冲 液 ， 得 标 准 品iii 1v 标 准 品iii +9v 稀 释 缓 冲 液 ， 得 标 准 品iv 1v 标 准 品iv +9v 稀 释 缓 冲 液 ， 得 标 准 品v 质 粒 标 准 品 稀 释 方 法 与 拷 贝 数 计 算 质 粒 标 准 品 稀 释 方 法 与 拷 贝 数 计 算 质 粒 标 准 品 稀 释 方 法 与 拷 贝 数 计 算 质 粒 标 准 品
45、稀 释 方 法 与 拷 贝 数 计 算 标准品梯度的选择 标准品梯度的选择 标准品梯度的选择 标准品梯度的选择： ： ： ： 标准品梯度的选择 标准品梯度的选择 标准品梯度的选择 标准品梯度的选择： ： ： ：5 5 5 5 5 5 5 5 6 6 6 6 6 6 6 6个梯度 个梯度 个梯度 个梯度 个梯度 个梯度 个梯度 个梯度 标准品稀释倍数的选择 标准品稀释倍数的选择 标准品稀释倍数的选择 标准品稀释倍数的选择： ： ： ： 标准品稀释倍数的选择 标准品稀释倍数的选择 标准品稀释倍数的选择 标准品稀释倍数的选择： ： ： ：标准品稀 标准品稀 标准品稀 标准品稀 标准品稀 标准品稀 标
46、准品稀 标准品稀 释倍数通常为 释倍数通常为 释倍数通常为 释倍数通常为 释倍数通常为 释倍数通常为 释倍数通常为 释倍数通常为10 10 10 10 10 10 10 10 方 方 方 方 法 法 法 法： ： ： ：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测 试 试 试 试 剂 剂 剂 剂： ： ： ：TIANGEN公司探针法试剂RealMasterMix（Probe）（目录号：FP203） 标准品 标准品 标准品 标准品： ： ： ：质粒标准品浓度为10 6 、10 5 、10 4 、 10 3 ；2个重复；设阴性空白对照 实验步骤 实验步骤 实验步骤 实验步骤： ：
47、： ：提取HBV DNA； 设计特异引物； 设计TaqMan探针并标记探针； 荧光定量扩增； 结果分析：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数。 绝 对 定 量 实 验 例 绝 对 定 量 实 验 例 绝 对 定 量 实 验 例 绝 对 定 量 实 验 例乙肝病人血液中 乙肝病人血液中 乙肝病人血液中 乙肝病人血液中HBV HBV HBV HBV的绝对定量 的绝对定量 的绝对定量 的绝对定量0.05 20.5 20.45 20.56 ? ? ? ? 未知样品 空白对照 标准品 标准品 标准品 标准品 Sample Sample Sample Sample None None 0.10 1
48、8.77 18.92 18.63 510 6 0.12 22.28 22.46 22.11 510 5 0.04 25.19 25.14 25.25 510 4 0.16 28.41 28.64 28.18 510 3 STD STD STD STD Mean Ct Mean Ct Mean Ct Mean Ct Ct2 Ct2 Ct2 Ct2 Ct1 Ct1 Ct1 Ct1 copies/ml copies/ml copies/ml copies/ml 实验数据 实验数据 实验数据 实验数据 绝 对 定 量 实 验 例 绝 对 定 量 实 验 例 绝 对 定 量 实 验 例 绝 对 定 量 实 验 例乙肝病人血液中 乙肝病人血液中 乙肝病人血液中 乙肝病人血液中HBV HBV HBV HBV的绝对定量 的绝对定量 的绝对定量 的绝对
