1、大肠菌群(M.R.N.)的测定一、实验目的： （1）了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义 （2）学习并掌握大肠菌群的检验原理和方法，以判别食品的卫生质量 二、实验原理：大肠菌群系指一群能在 37经 24h 能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。 食品中大肠菌群数系以每 100g（或 ml）检样内大肠菌群最近似数（the most probable number-简称 MPN）表示。 最近似数（ most pro
2、bable number-简称 MPN）法是一种将样品“多次（管）稀释至无菌”的计数方法。将 3 个稀释梯度的检样稀释液接种于 9 支或 15 支试管培养基中，每个稀释度接种 3 支或 5 支。经培养后，根据结果查阅 MPN 检索表，就可得到原样品中微生物的估计数量。MPN 测定方法尤其适用于带菌量极少、其他方法不能检测的食品。如水、乳制品及其他食品中大肠菌群的计数。三、材料1、样品乳、肉、禽蛋制品、饮料、糕点、发酵调味品或其他食品。 2、菌种大肠埃希氏菌（Escherichia coli）产气肠杆菌（Enterobacteria aerogenes）3、培养基及试剂单料乳糖胆盐发酵管、双料乳
3、糖胆盐发酵管、乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂（EMB ） 、革兰氏染色液、蛋白陈水、靛基质试剂、麦康凯(MA)4、其它设备和材料温箱(36 土 1)、水浴锅(44 土 0.5)、天平、显微镜、均质器或乳钵、温度计、平皿、试管、发酵管、吸管、载玻片、接种针。四、实验步骤(一)检验程序大肠菌群检验程序见图(二)操作步骤1采样及稀释（具体材料）以无菌操作鲜橙多饮料（具体根据实验室提供的确定）25g(或 25mL)放于含有225mL 灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内( 瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成 1：10 的均匀稀释液。固体检样最好用无菌均质器，以8000r mj
4、n10000rmin 的速度处理 1min，做成 1：10 的稀释液。用 1mL 灭菌吸管吸取 1：10 稀释液 1mL，注入含有 9mL 灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇混匀，做成 1：100 的稀释液，换用 1 支 lmL 灭菌吸管，按上述操作依次作 10 倍递增稀释液。根据食品卫生要求或对检验样品污染情况的估计,选择三个稀释度，每个稀释度接种3 管。也可直接用样品接种。2乳糖初发酵试验即通常所说的假定试验。其目的在于检查样品中有无发酵乳糖产生气体的细菌。将待校样品接种子乳糖服盐发酵管内，接种量在 1mL 以上者，用双料乳糖胆盐发酵管1mL 及 1mL 以下者，用单料乳糖发酵管。每一
5、个稀释度接种 3 管，置(36 土 1)培养箱内，培养(24 土 2)h，的所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产生者，则按下列程序进行。如有产生者，则按下列程序进行。3分离培养将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂板，置(36 土 1)温箱内，培养 18h24h，：然后取出，观察菌落形态并作革兰氏染色镜检和复发酵试验。4乳糖复发酵试验即通常所说的证实试验，其目的在于证明从乳糖初酪管试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽孢杆菌，确能发酵乳糖产生气体。在上述的选择性培养基上，挑取可疑大肠菌群 12 个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置(36 士 l)的温箱内培养 (2
6、4 土 2)h，观察产气情况。凡乳糖发酵管产气革兰氏染色为阴性反应的无芽胞杆菌，即报告为大肠杆菌阳性；凡糖发酵管不产气或革兰氏染色为阳性，则报告为大肠杆菌为阴性。5报告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查 MPN 检索表(见表 54)，报告每 100mL(8)食品中大肠菌群的最可能数。5.1 试验结果表 接种量 管号 发酵反应结果 有无典型菌落 革兰氏染色结果 复发酵反应结果 最后结论 +或-120.1ml3120.01ml3120.001ml3注：填写初发酵与复发酵结果应以下列符号表示。“-”表示不产酸也不产气，培养基为紫色；“+”表示只产酸而不产气，培养基变黄色；“”表示产酸又产气，培养基变黄
7、，并有气泡。5.2 结果报告 根据证实大肠菌群的阳性管数,查 MPN 检索表(见附录 )报告每 100ml(克)大肠菌群的最可能数.6.附件1g 检样中最近似值(MPN) 表使用三管法，接种量分别为 0.1，0.01 和 0.00lg。大肠菌群 MPN 检索表阳性管数 MPN 95%可信限1ml（g）3 0.1ml（g）3 0.01ml（g）3100 ml（g） 下限 上限000000000123303060905 900000111101233060901205 13000002222012360901201600000333301239013016019011110000012340701
8、1015051020021011111111012370110150190103023036011112222012311015020024030 3601111333301231602002402902222000001239014020026010303603702222111101231502002703403070440890222222220123210280350420401004701500222233330123290360440530333300000123230390640950407015012001300380033331111012343075012001600701
9、403002100230038003333222201239301500210029001503003503800440047003333333301232400460011000240003607101500130002400048000注：本表采用 3 个稀释度0.1g(mL)、0.0lg(mL)和 0.001g(mL)，每个稀释度接种 3 管。表内所列检样量如改用 1g(mL)、0.10(mL)和 0.01g(mL)时，表内数字应相应降低 10 倍：如改用 0.01g(mL)、0.001g(mL)和 0.0001g(mL)时，则表内数字应相应增加 10 倍，其余类推。查表注意:在 MPN 检索表第一栏阳性管数下面列出的 1ml(g),系指原样品的 1ml(g)数,并非样品稀释后的 1ml(g)数,对固体样品更应注意.如固体样品 1g 经 10 倍稀释后,虽加入 1ml 量,但实际其中只含有 0.1g 样品,故应按 0.1g 计,不应按 1ml 计.
