1、多管发酵法测定水中大肠菌群,考查内容：一、预习报告（包括提问）二、操作（无菌操作，随机抽看）三、实验报告,实验十一(综合实验）,多管发酵法测定水中大肠菌群,一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料 四、实验步骤 五、实验报告,一、实验目的,1、学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法。2、了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性。,发酵法： 又称多管发酵法或三步发酵法1) 初发酵（推测试验）：将不同稀释度的水样，分别接种于含有乳糖等糖类的培养液中（3倍或1倍乳糖液），经37 C培养24 h，观察产酸产气情况，培养基内加有溴甲酚紫作为PH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色，以初步判断是否有大
2、肠菌群存在。,二、实验原理,2）平皿分离（证实试验）,水中除大肠菌群外，尚有其它细菌可能引起糖类发酵，因此需要进一步证实。将初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美兰培养基，37 C培养24 h，根据菌落特征（带核心的、有金属光泽的深紫色菌落），挑取可能为大肠菌群的菌落制片，经革兰氏染色，进一步证实是否为大肠菌群。,3） 复发酵试验(完成实验）,将上述可能为大肠菌群的菌落再次转接入1倍乳糖培养液中，经37 C培养24 h，产酸产气者即最后确证为存在大肠菌群。产酸、产气分别记为阳性反应，不产酸、产气则记为阴性反应；根据阳性管数量，查表求得水体大肠菌群的数量。,三、实验材料,1、培养基：乳糖蛋白胨发酵管
3、（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管），伊红美蓝琼脂平板，灭菌水。 2、仪器或其他用具：载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭菌试管等。,四、操作步骤,1水样的采取 实验室提供水样 2河水的检查 （1）初（步）发酵实验 水样的稀释： 10-1与10-2 接种：分别吸取1ml 10-2 、 10-1和原水样接入装有10ml普通浓度乳糖蛋白胨发酵管 ；另取10ml原水样接入装有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管 ，混匀后，37 培养24 h，24 h未产气的继续培养48 h。,（2）平板分离将经24 h和48 h培养后产酸产气的发酵管，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37 培养1824 h，将符合下列特征的菌落进行染色镜检。深紫黑色，有金属光泽；紫黑色，不带或略带金属光泽；淡紫红色，中心颜色较深。,（3）复发酵试验将镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌株重复初步发酵试验。并根据初发酵管试验的阳性管查表，即得大肠菌群数。,图1 多管发酵测定水中大肠菌群的操作步骤和结果解释,五、思考题,1.实验结果报告河水水样：阳性结果记“”，阴性结果记“”。查表6获得每升水样中总大肠菌群是多少？ 2.思考题 （1） 何谓大肠菌群，它主要包括哪些细菌属？ （2） 为什么EMB培养基的琼脂平板能够作为检测大肠菌群的鉴别平板？,
