1、一、分子生物学研究的内容a) 生物大分子的化学结构、大小、形状和三维结构，以及大分子之间的相互作用。b) 生物大分子结构与功能的关系，以及生物学现象的分子生物学过程。c) 生物大分子在细胞成分中的组织结构方式，活细胞在合成大分子时的物理化学过程。d) 生物信息传递和代谢调节的分子生物学过程二、生物化学与分子生物学的关系与区别 分子生物学从分子水平研究生命现象，生物化学从分子水平研究生命化学现象，二者互相渗透。 分子生物学主要研究核酸、蛋白质和其他大分子的结构和功能，以及其相互作用，着重遗传信息传递和代谢调节问题。生物化学代谢过程。 分子生物学采用物理学、生物化学和遗传学相结合的方法，生物化学采
2、用生物化学和化学的研究方法三、分子生物学研究方法 X 射线衍射法 核磁共振技术 基因表达谱研究技术 DNA 芯片技术 蛋白质谱研究技术 蛋白质鉴定的数据库搜索法第二章 遗传信息的传递1.中心法则的基本内容2核酸的化学组成3DNA 的二级结构4DNA 的超螺旋结构二 维持 DNA 双螺旋的力1氢键 GC 之间有三条氢键，AT 之间有两条氢键，这是 DNA 双螺旋结构的重要特征之一，DNA 的许多物理性质如变性、复性以及 Tm 值等都与此有关。2.碱基堆集力 ： DNA 同一条链相邻碱基之间的非特异性作用力，包括疏水作用力和范德华力。氢键与碱基堆集力的协同作用 已经堆基的碱基更容易发生氢键的键合，
3、相应地已经被氢键定向的碱基更容易堆集。 两种作用力相互协同，形成一种非常稳定的结构。如果一种作用力被消除，另一种作用力也大为减弱。3.不稳定因素磷酸基团间的静电斥力带负电荷的磷酸基的静电斥力，所以 DNA 需要保存在含 Na+ 生理盐条件 。 碱基分子内能 物体的内能是物体内全部分子的分子动能与分子势能之和。 温度升高，碱基分子内能增加时，碱基的定向排列遭受破坏，消弱了碱基的氢键结合力和碱基的堆集力，会使 DNA 的双螺旋结构受到破坏三变性(denaturation概念：在某些理化因素作用下，DNA 分子互补碱基对之间的氢键断裂，DNA 双螺旋结构松散，变成单链的过程。1.常用的变性方法热变性
4、 应用广泛，特别是用于变性动力学研究 缺点：高温引起磷酸二酯键的断裂，得到长短不一的单链碱变性pH11.3 时，全部氢键被淘汰无热变性的缺点，为制备单链 DNA 的首选方法 2.核酸变性程度的鉴定紫外测定法： 原理： 嘌呤碱、嘧啶碱存在共轭双键，碱基、核苷、核苷酸、核酸在 240-290nm 处有强烈的紫外吸收，最大吸收峰在 260nm 处 紫外光吸收值：1 双链 DNA A260=1.002 单链 DNA A260=1.373 自由碱基 A260=1.603.熔解曲线与 Tm 值缓慢而均匀地增加 DNA 溶液的温度（现可做到 0.1 分）可根据各点的 A260值绘制成 DNA 的熔解曲线熔链
5、温度 Tm：OD 增加值的中点温度(一般为 85-95) 或 DNA 双螺旋结构失去一半时的温度4.影响 DNA Tm 值大小的因素 G-C 含量：Tm 值计算公式：Tm69.3+0.41 (G+C)%GC%=（Tm-69.3）2.44 介质中的离子强度： DNA 保存在高浓度的缓冲液中，如 1mol/LNaCl 中。5.DNA 复性(renaturation) 变性 DNA 在适当条件下，分开的两条单链分子按照碱基互补原则重新恢复天然的双螺旋构象的现象，又称为退火（annealing DNA 的复性的条件有两个：（1）有足够的盐浓度以消除磷酸基的静电斥力；（2）有足够高的温度以破坏无规则的链
6、内氢键，但又不能太高， 一般使用比 Tm 值低 2025 。复性的机制 一般认为需要 1020 个碱基对，特别是富含 GC 的节段首先形成一个（或几个）双螺旋核心，这一步叫成核作用。然后两条单链的其余部分就会迅速形成双螺旋结构6.复性的影响因子： 温度和时间：低于 Tm 值 25左右 (60-65) DNA 浓度： DNA 片段的大小： DNA 顺序的复杂性； 反应溶液中的离子强度四DNA 的超螺旋结构(三级结构 绝大多数原核生物及病毒的完整 DNA 分子都是共价封闭环(covalently closed circle, CCC)分子。这种双螺旋环状分子再度螺旋化成为超螺旋. 真核生物线状 D
7、NA 与蛋白质结合以环状的形成存在。 超螺旋结构是 DNA 三级结构的主要形式。 超螺旋是有方向的，有正超螺旋和负超螺旋两种。DNA 生物合成1.DNA 复制方式： 半保留复制子代 DNA 分子双链的一条链总是来源于亲代 DNA，采用半保留方式复制，原核生物及真核生物都采用该方式。 DNA 复制属性复制原点、复制子、复制叉、复制速度。2.DNA 复制酶学基础 底物(dAMPdGMPdCMPdTMP)和 dNTP 模板 DNA 聚合酶 其他酶和蛋白质因子3.DNA 复制过程 复制起始 复制的延伸 复制的终止4.原核生物和真核生物 DNA 复制的比较 相同点：1）半保留复制方式 2）半不连续复制3
8、） DNA 螺旋酶, SSBP4） RNA 引物不同点：1） 复制起点（单、多）2）复制子（大小、多少）3）复制叉移动的速度 4）冈崎片段的大小5）端粒和端粒酶6）DNA 聚合酶RNA 生物合成1.原核生物转录机制终止子不依赖 因子/强终止子(1) 一个反向重复序列， 可形成茎环结构，阻止 RNA pol 的前进；(2) 茎区域内富含 G-C，使茎环不易解开；(3) 3端上有 6 个 U，和模板形成的连续 U-A 配对较易打开，便于 RNA 释放。2.真核生物转录机制依赖 因子 (1) 没有固定的特征，也可形成茎环结构，但不是都能形成稳定的发夹； (2) 茎中的 G、C 含量少。 (3) 3端
9、寡聚 U 数量不定； (4) 靠与 的共同作用而实现终止。 茎环的存在可使 RNA 聚合酶暂停一下，若此时 因子追上来和其结合，那么转录即可终止，若无 因子聚合酶还可越过终止进行“通读”。3.原核前体 mRNA 的加工 原核生物的 mRNA 很少经过加工，由于转录和翻译偶联，一般情况下一边转录一边就进行翻译，中间没有可加工的间歇时间。 但在少数情况下多顺反子 mRNA 先被内切酶切成较小的单位再作为翻译的模板。4.真核生物前体 RNA 的加工1. 5端加帽2. 3端的产生和多腺苷酸化3. mRNA 内部甲基化4. RNA 剪接5. RNA 编辑遗传密码1.通用三联体密码1. 密码子的简并性2.
10、 密码子的通用性和特殊性3. 密码子的阅读方向4. 密码子与反密码子的作用反密码子与 mRNA 相应的三联体密码子碱基互密反补 摆动性：mRNA 密码子的前两位碱基和 tRNA 的反密码严格配对，而密码子第三位碱基与反密码子第一位碱基不严格遵守配对规则。tRNA1.tRNA 结构三叶草结构2.tRNA 的功能1)解读 mRNA 的遗传信息2)运输的工具，运载氨基酸tRNA 有两个关键部位： 3端 CCA：接受氨基酸，形成氨酰-tRNA。与 mRNA 结合部位反密码子部位3.氨酰 tRNA 合成酶（AARS ） 模板 mRNA 只能识别特异的 tRNA 而不是 AA。氨基酸进入蛋白质合成途径是通
11、过氨酰-tRNA 合成酶(AARS) ，这种酶将氨基酸和特异的 tRNA 连接起来，成为氨基酰 tRNA 。 原核生物中 AARS 有 20 种，对 AA 及 tRNA 高度专一，准确结合； 大小：40kDa100kDa 之间，有单聚体、二聚体和四聚体。 4.AARS 识别 tRNA 的反应： 需要三种底物 AA tRNA ATP 因此有三个位点AA binding site tRNA binding siteATP site 反应：活化：氨基酸+ATP+E氨基酰-ATP-E+PPi转移：氨基酰-ATP-E +tRNAaa-tRNA+AMP+E5.翻译过程1 起始组成过程：30S+50S+mR
12、NA+fMet- tRNAfmet 70S-mRNA-fMet- tRNAfmet+GDP+Pi起始复合物- 70S 三元复合物起始因子(Initiation factor，IF） Ecoli 三种: IF1 IF2 IF3 。 IF 的性质特点：IF不同形式 MWGTP结合能力生物学活性IF-19500 -无特异功能，但具有加强 IF2 和 IF3 的活性作用。IF-2IF-2aIF-2b11700085000+生成 IF-2.GTP.fMet-tRNAfmet 与前起始复合物结合形成 30S 三元复合物IF-3IF-3aIF-32066819997-1. 使得 30S 与 mRNA 结合，
13、形成前起始复合物 。2.解离活性，使 70S 核糖体颗粒解离为 30S 和 50S亚基。30S 亚基与 mRNA 的结合IF3+30S- - 30S-IF3 + mRNA- 30S-IF3-mRNA（30S 复合物）IF3赋予 30S 亚基与 mRNA 结合的能力。（30S 亚基没有与 mRNA 主动结合的能力）IF3 使 30S 亚基不能与 50S 亚基结合，保证解离状态30S 亚基与 mRNA 的结合。SD（5-AGGAGG-3）与 16S rRNA 的 3 端(3-UCCUCC-5）,使 AUG定位在 P 位上。30S 复合物中，起始密码子位于 P 位点，只有 fMet-tRNAfMet
14、 能进入起始 tRNA 的结合IF2 + fMet-tRNAf IF2-fMet-tRNAf 30S-IF3-mRNA-30S-IF3-mRNA-IF2-fMet-tRNAf-GTP 70S 起始复合物的形成过程 a、 IF3 先游离30S-IF3-mRNA-IF2-fMet-tRNAf-GTP 与 50S 亚基的结合导致。b、 70S 起始复合物形成 50S 亚基的结合激活 IF2 的 GTP 酶活性，水解 GTP 并解离下来（IF1、IF2 ） 。 GTP 水解释放的能量改变两者的构象形成 70S 起始复合物： 30S-mRNA-fMet-tRNA-50S c、 Met 的甲酰基除去 合成
15、到 1530 个 AA 去甲酰基酶（细菌、线粒体） ； 氨肽酶去除 Met。2 延伸延伸的三个阶段： 进位反应：主要是密码子-反密码子的识别； 转肽反应：肽链的形成； 移位反应：tRNA 和 mRNA 相对核糖体的移动。1)进位 氨基酰-tRNA 与核糖体结合，进入 A 位的过程。 过程：3 终止 包括：肽链释放， tRNA 逐出，核糖体与 mRNA 解聚。 3.1 终止密码 UAA,UGA,UAG；3.2 释放因子(releasing factor,RF)释放因子 MWGTP结合生物学活性能力RF1 36000 识别 UAA 和 UAGRF2 38000 识别 UAA 和 UGARF3 46
16、000 +刺激 RF1，RF2 的活性,与 GTP 结合，使转肽酶构象改变，发挥酯酶活性，水解多肽、脱离 tRNA终止过程a. RF1、RF2 作用于 A 位点（P 位被肽酰-tRNA 所占据） ，识别终止密码子；b. RF3 作用改变肽基转移酶构象，从而改变肽基转移特性，发挥水解酶作用，将肽链从结合在核糖体上的 tRNA 的 CCA 末端上水解下来，mRNA 与核糖体分离，tRNA 脱落。c. RF3 与 GTP 结合为肽基转移及随后的核糖体释放提供能量。d. 同时核糖体在 IF-3 作用下，解离出大、小亚基 mRNA 翻译的多肽链没有功能，称为新生蛋白质或蛋白质前体，需要经过加工改造才能成
17、为有功能的蛋白质。 mRNA 的信息阅读： 5端向 3端， 肽链延伸：从 N 端到 C 端。真核生物的基因组结构一 真核生物基因组的大小二 真核生物基因组的基因数量三 真核生物基因组的非重复序列和重复序列四 细胞器基因组真核生物基因组的非重复序列和重复序列：1. 高度重复序列 2. 中度重复序列 3. 非重复序列 细胞器基因组：1.线粒体基因组2.叶绿体基因组第二节 断裂基因一 断裂基因由外显子与内含子组成二 外显子三 内含子第三节 基因家族和基因簇一 基因家族1. 基因家族的成因2. 基因家族的特点3. 假基因4. 常见基因家族第四节 真核生物基因组的包装一.染色质的结构单位：核小体由核心颗
18、粒和连结 DNA 两部分组成： 每个核小体单位包括约 200bp 的 DNA、一个组蛋白核心和一个 H1； 组蛋白核心：由 H2A、H2B、H3 、H4 各两分子形成八聚体； DNA 分子以左手螺旋缠绕在核心颗粒表面，每圈 80bp，共 1.75 圈，约 146bp，两端被 H1 锁合； 相邻核心颗粒之间为一段 60bp 的连接线 DNA。 -第五章 原核生物基因的表达调控第一节 基因表达调控的概念基因表达：储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。 基因表达调控：对基因表达过程的调节。 生物的基因表达不是杂乱无章的，而是受着严密、精确调控:1.5 原核生物基因表达调控环节：
19、 转录水平上的调控； 转录后水平上的调控：a. mRNA 加工成熟水平上的调控 ；b. 翻译水平上的调控 。2 结构基因和调控基因 结构基因（structural gene）：编码蛋白质或 RNA 的任何基因。 原核生物的结构基因一般成簇排列，真核生物独立存在。 调控基因（regulator gene）：参与其他基因表达调控的 RNA 或蛋白质的编码基因。 其编码产物与 DNA 上的特定位点结合调控基因表达第二节 大肠杆菌乳糖操纵子的正负调控H32-H42 八 聚 体 2H2A-H2B 核 心 颗 粒 染 色 质 小 体 ( 166bp) 146bp 核 小 体 DNA 166bp ( 200
20、bp) H1 20bp DNA连 接 区 (常 为 32 34bp) 图 10-10 核 小 体 的 组 成 一、操纵子与操纵子模型原核生物基因表达调控主要发生在转录水平，转录调控的基本单元是操纵子。1、操纵子的概念：根据操纵子学说，很多功能上相关的结构基因在染色体上串连排列，由一个共同的控制区来操纵这些基因的转录。包含这些结构基因和控制区的整个核苷酸序列就称为操纵子 2、操纵子结构由启动子（P） 、操纵基因（O） 、调控基因、结构基因所组成。二、正调控与负调控 1、在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白(activator)，激活蛋白结合与DNA 的启动子及 RNA 聚合酶后，转录才会
21、进行。（1）在正控诱导系统中，诱导物的存在使激活蛋白处于活性状态，转录进行。（2）在正控阻遏系统中，效应物分子的存在使激活蛋白处于非活性状态，转录不进行2、在负转录调控系统中，调节基因的物质是阻遏蛋白(repressor)阻止结构基因转录。其作用部位是操纵区。它与操纵区结合，转录受阻。（1）负控诱导系统阻遏蛋白不与诱导物结合时，阻遏蛋白与操纵区相结合，结构基因不转录，阻遏蛋白结合上诱导物时，阻遏蛋白与操纵区分离，结构基因转录。（2）负控阻遏系统阻遏蛋白与效应物结合时，结构基因不转录。名词 正调控 负调控 诱导 阻遏 激活蛋白 阻遏蛋白 诱导物 辅阻遏物调控模式1、可诱导负调控2、可诱导正调控3
22、、可阻遏负调控4、可阻遏正调控三、大肠杆菌乳糖操纵子的负调控 （一）大肠杆菌的乳糖利用系统 大肠杆菌的乳糖代谢需要有 -半乳糖苷酶（-galactosidase）的催化 。这种酶能把乳糖水解为半乳糖和葡萄糖 .另外有半乳糖苷透性酶和巯基半乳糖苷转乙酰酶。三种酶协同作用，使得乳糖得以分解和利用。乳糖操纵子的结构和功能结构基因3 个不同结构基因能够产生 3 种不同的酶.操纵基因是结构基因的开关.通过对 RNA 聚合酶阻抑与否来控制结构基因的转录或停止.启动子 是 RNA 聚合酶与 DNA 结合的部位 ,可识别转录起始点.调节基因能产生阻遏物.通过阻遏物与操纵基因的结合与否来控制操纵基因的关闭和开启
23、二）乳糖操纵子的调控机制1、没有乳糖时，具有活性的阻遏物和操纵基因结合，转录不能进行。2、有乳糖时，乳糖与阻遏物结合，使阻遏物发生构象变化而失活，不能与操纵子结合，结构基因正常转录，进而再翻译出蛋白质。四、大肠杆菌乳糖操纵子的正调控1、葡萄糖敏感操纵子有一些控制某一种糖如乳糖、半乳糖、阿拉伯糖和麦芽糖等分解代谢的操纵子，当培养基含有葡萄糖时，会阻止这些操纵子的功能，称为葡萄糖敏感操纵子。例如：当大肠杆菌生长的培养基中既有葡萄糖又有乳糖的条件，只利用葡萄糖，而不利用乳糖。换句话说，只要在培养基中有葡萄糖存在，便可抑制了利用其他各种酶的产生，称为分解物阻遏。 2、CAP-cAMP 调控另外一种起调
24、节作用的诱导物为 cAMP（环化腺苷酸）分析一组实验几种情况：（1）当培养基中含用大量葡萄糖时，cAMP 水平明显下降。（2）当以乳糖为唯一碳源时， cAMP 水平明显上升， -半乳糖苷酶的合成增加。3）当有乳糖和葡萄糖为碳源时，如果加入 cAMP ， - 半乳糖苷酶的合成速率大大提高。结论：？cAMP 浓度能影响到 -半乳糖苷酶的合成速率。主要是 cAMP 能激活 CAP（分解物基因激活蛋白） ，起转录因子的作用。3、lac 操纵子的正调控机制（1） cAMP-CAP 复合物与 DNA 结合，改变 DNA 结构，促进了 RNA 聚合酶结合区的解链，从而促进 RNA 聚合酶和启动子结合，使转录
25、能力增强。（2） cAMP-CAP 复合物的形成取决于 AMP 的浓度，当以葡萄糖为能源时，由于其抑制腺苷酸环化酶的活性，ATP 不能转化为 cAMP， cAMP 浓度下降，不能形成 cAMP-CAP复合物，乳糖结构基因不能被转录。(因为细胞中有葡萄糖作为能源，就没有必要需要对乳糖利用的几种酶了) 四、色氨酸操纵子的转录调控及衰减作用1色氨酸操纵子模型：操纵子：包括色氨酸合成有关的 5 种酶的结构基因；大量色氨酸时：大肠杆菌 5 种酶的转录同时受到抑制；色氨酸不足时：这种酶的基因开始转录；色氨酸：作为阻遏物而不是诱导物参与调控结构基因的转录。 trp 操纵子是一个典型的可阻遏操纵元模型 (re
26、pressible operon)。 色氨酸操纵子模型结构：5 种结构基因：trpE、D 、C 、B、A ；调控结构：启动子、操纵子、前导序列、弱化子；阻遏物 trpR 基因：与 trp 操纵子相距较远； 2.色氨酸操纵子的负调控： . 阻遏调控：trpR 基因编码无辅基阻遏物 与色氨酸结合 形成有活性的色氨酸阻遏物 与操作子结合 阻止转录；色氨酸不足：阻遏物三维空间结构发生变化 ，不能与操作子结合，操纵元开始转录；色氨酸浓度升高：色氨酸与阻遏物结合，空间结构发生变化，可与操作子结合，阻止转录。 . 弱化子调控：当有色氨酸存在而 trp 操纵子受抑制时，仍有一段前导序列发生转录，可能存在另一种
27、的机制来抑制 trp 操纵元的转录。色氨酸高浓度存在时，转录的前导序列 140bp 长，其中有一 28bp 的弱化子区域；形成发夹结构，为内部终止子，RNA 酶从 DNA 上脱落，不能转录；色氨酸低浓度或不存在时，RNA 聚合酶能通过弱化子区域，转录完整的多顺反子 mRNA 序列；第七章 基因突变和修复第一节 基因突变一、基因突变的类型1. 碱基置换和移码突变2. 同义突变、错义突变和无义突变3. 自发突变和诱发突变4. 点突变和染色体变异5. 突变和回复突变1.碱基置换和移码突变 移码转换和颠换 突变转换（transition）:一种嘌呤-嘧啶对被另一种嘌呤-嘧啶对所替换。颠换（transv
28、ertion）:一种嘌呤-嘧啶对被另一种嘧啶- 嘌呤对所替换 。移码突变（frame-shift mutation基因组 DNA 链中插入或缺失 1 个或几个碱基对，从而使自插入或缺失的那一点以下的三联体密码的组合发生改变，进而使其编码的氨基酸种类和序列发生变化。 无义突变（non-sense mutation）碱基替换使编码氨基酸的密码变成终止密码 UAA、UAG 或 UGA。 错义突变（missense mutation）碱基替换使编码某种氨基酸的密码子变成编码另一种氨基酸的密码子，从而使多肽链的氨基酸种类和序列发生改变。3.自发突变和诱发突变 自发突变：主要来源于复制错误及 DNA 自发
29、水解和脱氨等产生的自发损伤。 （碱基的互变异构、脱氨作用、脱嘌呤脱嘧啶、碱基修饰与链断裂） 诱发突变:物理、化学或生物因素诱发产生的突变。 碱基类似物某些碱基类似物可以取代碱基而插入 DNA 分子引起突变 。 芳香族化合物 吖啶类和焦宁类等扁平分子构型的芳香族化合物可以嵌入 DNA 的核苷酸序列中，导致碱基插入或丢失的移码突变。二、基因突变的特点1. 普遍性2. 基因自发突变频率很低（10-6-10-9）3. 多数基因突变对生物体有害4. 基因突变的随机性和不定向性第三节 直接修复一 DNA 聚合酶的校正功能二 嘧啶二聚体的光复活修复三 烷基转移酶介导的修复一、 DNA 聚合酶的校正功能 原核
30、生物 DNA 聚合酶 3-5外切校对活性 真核生物 DNA 聚合酶 3-5外切校对活性第四节 错配修复系统一 错配修复系统根据不同甲基化程度识别模板链和新生链第五节 切除修复系统一 碱基切除修复1.DNA 糖基化酶的作用2.AP 内切酶的作用3.氧化碱基的修复第六节 重组修复一 同源重组修复第八章 基因重组和转座第一节 同源重组一、同源重组的分子机制1. 同源重组的条件交换区具有相同或相似的序列双链 DNA 分子间互补配对重组酶的存在异源双链区的形成二、同源重组的酶学机制-Rec ABCD、 RuvABC 途径 Rec BCD 蛋白在 chi 位点 3侧的一条链上产生切口。 Rec BCD 蛋
31、白同时具有解螺旋酶的活性，使 chi 位点附件切口的 DNA 解链 单链区被 Rec A 蛋白和 SSB 蛋白覆盖 RecA 蛋白使单链 DNA 取代双链 DNA 中的同源部分 Dloop 区域的 DNA 产生切口，新切口的 3端（ the tail of newly nicked DNA ）与另一条 DNA 的单链区互补配对 DNA 连接酶封闭切口，形成 Holliday junction RuvA 和 RuvB 发动迁移反应 RuvC 拆分重组中间体第二节 位点特异性重组 位点特异性重组最典型的列子是 噬菌体对 E.coli 的整合。在裂解周期， DNA是以环状分子独立存在于细菌的细胞质中
32、；在溶原化状态时的 DNA 是整合在细菌的染色体中。称为原噬菌体。通过位点特异性重组这两种状态是可以相互转变的。 进入溶原状态时游离的 DNA 必须整合（intergrated）到宿主的 DNA 中；从溶原周期进入裂解周期时原噬菌体 DNA 须从宿主的染色体中切离出来。 噬菌体 的整合和切离是在特异位点即附着位点(attatchment sites, att ) 通过重组完成的，若这个位点发生突变就会失去功能而抑制整合。第三节 转座（transposition）一、原核转座子的类型 .插入序列（IS）:IS 家族的结构：两端都有短的正向重复序列（direct repeats, DR） ，略长的
33、反向重复序列（inverted repeats，IR）以及 1kb 左右的编码区，它仅编码和转座有关的转座酶。对靶的选择有三种形式：随机选择，热点选择和特异位点的选择。 2.复合转座子 ： 复合转座子含有一个中心序列和位于两侧的臂（arm） 。 除了和自身转座有关的基因外，中心序列含有抗药性基因等遗传信息。 复合转座子两端的臂由 IS 序列组成。有的二侧组件相同（如 Tn903） ，有的不同（如 Tn10） 。有的方向相同（如 Tn9） ，有的方向相反（如Tn903，10，5） 。有的皆有功能（如 Tn903，10） ，有的仅右侧组件有功能 3.Tn A 家族: TnA 是复制型转座的转座子。
34、 长约 5kb 左右，中部的编码区不仅编码抗性基因，还编码转座酶和解离酶。 两端具有末端反向重复序列，而不是 IS，长约 38bp 左右，任一个缺失都会阻止转座。 靶位点具有 5bp 的正向重复序列。 TnA 家族都带有抗性标记 二转座机制：转座子插入到 DNA 上新的位点，首先交错切开靶 DNA，再将转座子连接到靶 DNA 的凸出单链上，最后填补空缺完成转座。使用参差不齐的末端是各种转座子的共同特点根据转座子的机制，转座可分成三种不同的类型 ：1. 复制性转座2. 非复制型转座这类转座因子直接从原位点移到靶位点,同时在供体留下产生一个双链断裂的位点。这种类型的机制只需要转座酶。这个双链断裂位
35、点需要修复系统的识别和修复，否则将是致命的。3保守转座（conservative tranposition）Conservative transposition involves direct movement with no loss of nucleotide bonds 保守转座的转座因子从供体位点上切离，插入到靶位点上，供体位点恢复原状。这种因子的转座酶和 整合酶家族相关。注意：某些转座子只具有一种转座机制，而另一些可能具备两种途经,如 IS1 和 IS903 第九章 基因工程基因工程：在生物体外，通过对 DNA 分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入
36、受体细胞进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出所需要的基因产物。基因工程的别名 基因拼接技术或 DNA 重组技术操作环境 生物体外操作对象 基 因操作水平 DNA 分子水平基本过程 剪切拼接导入表达结果 人类需要的基因产物第一节 工具酶及相关技术一 用于基因克隆的核酸酶1. 宿主控制的限制与修饰2. 限制酶与修饰酶3. 限制修饰系统的类型、第二节 基因工程的载体载体(vector)是携带外源 DNA 进入宿主细胞进行扩增和表达的 DNA,它们一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建的。载体应具备以下条件：、能在适当的宿主细胞中复制；、具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克隆位点）以便外源
37、 DNA 插入；、具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子；、载体分子较小，以便体外基因操作，同时载体 DNA 与宿主 DNA 便于分离；、对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件。宿主细胞是基因克隆中重组 DNA 分子的繁殖场所，适当的宿主细胞，必须符以下条件：、 对载体的复制和扩增没有严格的限制；、 不存在特异的内切酶体系降解外源 DNA；、 在重组 DNA 增殖过程中，不会对它进行修饰；、 重组缺陷型，不会产生体内重组；、 容易导入重组 DNA 分子；、 符合重组 DNA 操作的安全标准。一、质粒载体质粒(plasmid)是存在于细菌染色体外的小的共价、
38、闭环双链 DNA 分子，能自主复制，并在细胞分裂时遗传给子代细胞。质粒可赋予宿主细胞一些遗传性状如抗药性等，通过质粒赋予细菌的表型可识别质粒的存在，这是筛选重组转化子的基础。1. 噬菌体是一种双链 DNA 噬菌体，基因组约为 50kb+。线性 噬菌体 DNA 分子的两端各有 12 碱基的互补单链序列，是天然的粘性末端，称为COS 位点。2.Cosmid 载体是人工建造的的含有 DNA 的 cos 序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。这是一类用于克隆大片段 DNA 的载体，它是由 噬菌体的 cos（cohesive ）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。3.Phasmid 载体由质粒载
39、体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列，称为噬菌粒（phagemid 或phasmid） 。其分子量一般都比 M13 载体的小，约为 3000bp，易于体外操作，可得到长达10kb 的外源 DNA 的单链序列；第三节 DNA 克隆一 基因克隆的全过程 获得目的 DNA 片段 将目的片段连接到载体上 将人工重组的 DNA 引导进入受体细胞 检出目的转化子 对目的转化子进行分析第四节 原核生物基因克隆和鉴定一 DNA 文库构建基因文库的概念基因文库的克隆数不完全切割二 检出目的克隆1. 平板杂交法2. 免疫学检测3. 遗传学检测第五节 聚合酶链式反应一 引物二 DNA 聚合酶三 RT-PCR第六节 原核生物基因克隆的应用一 DNA 序列分析
