1、微生物实验三 微生物培养基的配制和灭菌一、目的要求了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。二、实验材料药品： 牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO47H2O、FeSO47H2O 等。仪器：高压蒸汽灭菌锅、天平、牛角匙、电炉、pH 试纸、量筒、烧杯、漏斗、漏斗架、玻棒、三角瓶、带棉塞的无菌试管、吸管、报纸、绳索、棉花、标签等。三、 实验原理培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组分的营养物质调制而成的营养基质。人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个良好的营养条件。把一
2、定的培养基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的环境和场所。自然界中，微生物种类繁多，由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究上的目的不同，所以培养基在组成原料上也各有差异。 1.按组成成分可分为: 合成培养基、半合成培养基、天然培养基2.从培养基的物理状态可分为： 液体培养基：不加凝固剂固体培养基：加入 2%左右的凝固剂 半固体培养基：加入 0.20.5%凝固剂3.按用途分：基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基牛肉膏蛋白胨琼脂培养基:用于分离和培养细菌的基础培养基，又称天然培养基。配方如下：牛肉膏 3 g 蛋白胨 10 g 氯化钠 5 g 琼脂
3、20 g 自来水 1000 mL pH 7.27.4淀粉琼脂培养基（高氏一号） ，用于分离和培养放线菌，是一种合成培养基。配方如下：可溶性淀粉 20.0 g KNO3 1.0 g K2HPO4 0.5 g MgSO4 7H2O 0.5 g NaCl 0.5 g FeSO4 7H2O 0.01 g 琼脂 20 g 自来水 1000 mLpH 7.47.6查氏培养基，用于分离和培养霉菌，是一种合成培养基。配方如下：NaNO3 2.0 g K2HPO4 1.0 g KCl 0.5 g MgSO4 0.5 gFeSO4 0.01 g 蔗糖 30g琼脂 20 g 自来水 1000 mLpH 自然四、实验
4、过程1、培养基的配制步骤:称量：按照配方正确称取各种原料放在烧杯中。溶化：在烧杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。调 pH 值：用 1N NaOH 或 1 N HCl调 pH，用 pH 试纸对照。加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补水。分装：注意不要污染棉塞。包扎：包扎成捆，注明何种培养基。灭菌：培养基灭菌后必须在 37 0C 下恒温培养 24 h，确定无菌生长，方可使用。（2）加压蒸汽灭菌法原理：将待灭菌的物品放入灭菌锅，通过加热，使锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸
5、点增高，得到高于 100 0C 的温度。导致菌体蛋白质的凝固变性而达到灭菌的目的。干热灭菌法： 在电热烘箱（160170 0C ）中灭菌 2 h，适用于玻璃仪器吸管、培养基、试管等。过滤除菌法： 不能用加热灭菌的液体物质（如维生素、血清） ，一般可用细菌过滤器进行除菌。紫外线灭菌法： 一般 30 W 灯管，9 m3 空间，距地面 2 m 每次打开紫外线照射 0.5 h，就使室内空气灭菌。若照射紫外线时先喷洒石炭酸等化学消毒剂，可增强灭菌效果。紫外线虽有较强的杀菌力，但穿透力弱，即使一薄层玻璃或水层就能将大部分紫外线滤除，因此只适用于空气及表面杀菌。化学药剂消毒灭菌： 微生物实验室中常用的化学杀
6、菌剂有升汞、甲醛、高锰酸钾、酒精、碘酒、龙胆紫、石炭酸、漂白粉、新洁尔灭、煤酚皂溶液，它们有的是杀菌剂，有的是抑菌剂.加压蒸汽灭菌步骤：1.灭菌器内加入一定量的水，放入需灭菌的物品。2.接通电源，加热。3. 排冷空气，将排气阀打开，待排出大气后关闭排气阀。 4.当压力达时 0.1 MPa，温度 121 0C，维持 20 min。 5.灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品。6.摆试管斜面培养基。五、实验任务（2 人一组）：（1）配制 200 ml 的牛肉膏蛋白胨培养基，用 1 个大三角瓶装或者用 2 个小三角瓶装;（2）配制 100 ml 的高氏一号培养基，用 10 支试管分装（装量不超过管高的1/3);( 3 ) 配制 200 ml 的查氏培养基，用 1 个大三角瓶装或者用 2 个小三角瓶装;（4） 灭菌;（5） 摆试管斜面，斜面长度不超过试管总长的一半.六、思考题1. 培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？2. 配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？3.高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低“0”时才能打开排气阀，开盖取物？4.在使用高压灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素？
