1、 1食品生物化学实验指导高建华 曹劲松 宁正祥 编华南理工大学二 O O 六 年 三 月目 录第一部分 普通试验实验一 果胶的制备和特性测定- 1一、从果皮中提取果胶 -1二、果酱的制备 - 1实验二 卵磷脂提取、鉴定及乳化特性试验 - 2实验三 蛋白质的盐析透析 - 5一、蛋白质的盐析 - 5二、蛋白质的透析 - 6实验四 氨基酸纸电泳分离鉴定 - 7实验五 激活剂、抑制剂、温度及 PH 对酶活性的影响 - 9一、激活剂、抑制剂对唾液淀粉酶活力的影响 - 102二、温度和 pH 值对 -液化淀粉酶活力的影响 - 10实验六 果蔬中过氧化物酶活力测定 - 12实验七 酶催化转氨基反应的纸层析鉴
2、定 - 14实验八 焦糖的制备极其性质 - 17实验九 酶促褐变的抑制及叶绿素的性质 - 19第二部分 综合设计性实验：一、酵母蔗糖酶的分离纯化实验一 活性干酵母蔗糖酶的提取 - 23实验二 蔗糖酶的分级沉淀提取 - 25实验三 蔗糖酶的葡聚糖凝胶层析法脱盐 - 28实验四 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶 - 30实验五 蔗糖酶的交联葡聚糖凝胶色谱分离纯化 - 35实验六 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离测定蔗糖酶纯度 - 38实验七 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量 - 43实验八 蔗糖酶的酶活特性研究 -辅助性实验45实验一 蔗糖酶活力测定 - 46实验二 Folin-酚法测定蛋白质含量 -
3、 48实验三 考马斯亮蓝染料比色法测定蛋白质含量 - 50实验四 紫外吸收法测定蛋白质浓度 - 51附表： 调整硫酸铵溶液饱和度计算表附表 1 0下由 S1 提高到 S2 时每 100mL 样品加固体硫酸铵的克数 - 533附表 2 室温下由 S1 提高到 S2 时每升加固体硫酸铵的克数 -二、天然活性物质植物黄酮的提取及应用实验一 藤茶植物黄酮的提取 -实验二 重结晶法纯化黄酮提取物-实验三 植物黄酮重结晶晶体形态观察-实验四 紫外分光光度法测定总黄酮含量-实验五 高效液相色谱法测定蛇葡萄属植物黄酮的含量-实验六 植物黄酮稳定性试验-实验七 植物黄酮在油脂中的抗氧化活性测定-辅助性实验：实验
4、一 油脂过氧化物值的测定-实验二 油脂酸价的测定-54555658606266677072实验一 果胶的制备和特性测定一、果胶的制备（一） 目的要求 了解果胶的基本结构、果胶的分类及提取原理和方法。（二） 实验原理 果胶物质可分为三类，原果胶、果胶及果胶酸，其基本结构是不同程度甲酯化和被钠、钾离子中和的 -半乳糖醛酸以 1,4-苷键形成的聚合物，分子量高达 200000 左右。原果胶不溶于水，主要存在于出生细胞壁中，在一定温度经稀酸长时加热条件下，果皮层细胞壁的原果胶发生水解，由于结构甲酯化程度降低及部分苷键断裂而转变成水溶性果胶。水溶性果胶经脱水干制有利于保藏和运输，果胶干制有直接干燥法和沉
5、淀脱水两种方法。直接干燥通常是把浓缩的果胶水溶液通过喷雾干燥获得。沉淀脱水则是根据果胶不溶于高浓度乙醇特性，采用乙醇沉淀提取。乙醇沉淀提取果胶，控制酒精浓度极为关键，浓度太高或太低都是不利的，浓度过高等于水分减少，水溶性的非胶物质没有机会溶解在水4中，会随果胶一起沉淀出来，使果胶纯度降低；反之如果乙醇浓度太低，水分含量过高，果胶沉淀不完全，因此用乙醇沉淀提取果胶，乙醇用量最好为 55%60%左右。果胶溶液中存在有微量电解质时，加入乙醇果胶将以海绵絮状沉淀析出，反之不易聚集析出。柑橘类果皮是提取果胶的优良原料，新鲜果皮含果胶约 1.5%3%，干果皮则含9%-18%，柠檬皮果胶含量更多，新鲜果皮内
6、含 2.5%5.5%，干果皮内含量高达 30%40%。（三）试剂及材料1、0.5%HCl 溶液 量取 12mL 浓盐酸，加水稀释至 1000mL。2、1mol/LNaOH 溶液 称取 40gNaOH，用水溶解并稀释至 1000mL。3、95%乙醇。4、柑桔皮和柚子皮。（四）操作方法1、称取 50100g 果皮，分切，把果皮放入沸水中煮沸 3 分钟，而后用清水漂洗，以除去色素、苦味等非胶物质，并把多余水分除去。2、把上述处理后的果皮放入 600mL 烧杯中，加入 0.5%HCl 200300 mL，一般以浸没果皮为度，在搅拌条件下保持微沸提取 20min。3、趁热用 4 层纱布过滤，用少量 50
7、的热水分次将滤渣洗涤 23 次，合并滤液，冷却至室温。4、用 1mol/LNaOH 调整滤液的 PH 值至 34。5、缓缓向提取液加入 95%乙醇约 300 mL，并略加搅拌，待果胶呈棉絮状沉淀后，用四层纱布过滤，压干除去大量水分，滤渣则为粗制的果胶产品。二、果酱的制备（一）目的要求 了解果胶的性质和用途（二）实验原理 果胶是亲水性多糖， 在 PH=3-3.5、蔗糖含量为 65%70%、0.7%1%的果胶水溶液经煮沸冷却后，可形成具有一定强度的三维网状结构凝胶，其主要作用力是分子间的氢键及静电引力。在凝胶过程中，溶液中的水含量对凝胶影响很大，过量的水阻碍果胶形成凝胶。果胶水化后和水分子形成稳定
8、的溶胶，由于氢键的作用水分子被果胶紧紧地结合起来不易分离，向果胶溶液中添加糖类，其目的在于脱水，糖溶解时形成夺取水分的势能，促使果胶粒周围的水化层发生变化，使原来果胶表面吸附水减少，胶粒与胶粒易于结合成为链状胶束，促进果胶形成凝胶。在果胶-糖溶液分散体系内添加一定量的酸，可起到中和果胶所带的负电荷，减少了果胶分子变成阴离子的作用，促进它聚结成网状结构，而形成凝胶。果酱、果冻等食品就是利用这些特性生产的。（三）试剂及材料5白砂糖、柠檬酸、柠檬酸钠、自制果胶。（四）操作方法1、配方蔗糖 70g、柠檬酸 0.5 g、柠檬酸钠 0.4 g、水 20 g、自制果胶适量。2、将柠檬酸、柠檬酸钠溶解于 20
9、 g 水中，用蔗糖把果胶充分拌匀，加入柠檬酸水溶液。3、在不断搅拌下，小火加热至沸，保温熬煮约 1015min，待水分含量为一定时，以溶胶糖液以挂珠为度，冷却、观察、描述形成凝胶的体态。三、实验结果讨论分析。四、思考题1、提取果胶前，用沸水处理果皮的目的是什么？2、沉淀提取果胶前，为何需调整果胶溶液 PH 值？3、若提取的果胶溶液含水量过大，采用何种方法浓缩果胶提取液，以减少乙醇用量？4、提取果胶后，采用何种方法回收乙醇？正确绘制回收乙醇的实验装置图。5、用什么简易方法测定回收乙醇的浓度？6、果胶形成凝胶所需的条件是什么？实验二、卵磷脂提取、鉴定及乳化特性试验一、目的要求 学习提取卵磷脂的方法
10、，了解卵磷脂的乳化特性性质。二、实验原理磷脂是分子中含磷酸的复合脂，分为磷酸甘油脂和鞘氨醇磷脂类，其醇类物质分别为甘油和鞘氨醇。磷脂酰胆碱属磷酸甘油脂，俗名为卵磷脂，在生物体内以及食品工业应用中起着重要的作用。卵磷脂是一种在动、植物中分布及广的磷脂，如植物的种子、动物的卵、脑及神经组织均含有之，其中大豆中含量约为 2.0%、卵黄中含量高达 8%10%、 。卵磷脂在细胞中以游离态或与蛋白质结合成不稳定的化合物存在，易溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂，不溶于丙酮。本实验采用乙醇提取蛋黄中的卵磷脂。纯卵磷脂为白色的蜡状物，与空气接触后，因结构含不饱和脂肪酸被氧化后而呈黄色至黄棕色，粗制品中色素的存在可
11、使之呈淡黄色。卵磷脂中的胆碱基在碱性条件下可分解成三甲胺，三甲胺有特异的鱼腥味，利用此性质可鉴别卵磷脂。在生物体中的作用是保持细胞膜的通透性，控制动物体内脂肝代谢，防止脂肪肝的形成。在食品工业中广泛充当乳化剂、抗氧化剂和营养添加剂。使互不相溶的两种液体中的一种呈微滴状分散在另一种液体中的作用称为乳化剂。这6两种不同的液体称为“相” ，在体系中量大的称为连续相，量小的为分散相，能使互不相溶的两相中的一相分散在另一相中的物质称为乳化剂。由卵磷脂的分子结构可知： CH2OCR1OCR2CH2OPHOCH22NOHC3卵磷脂分子中的 R1 脂肪酸为硬脂酸或软脂酸， R2 脂肪酸为油酸、亚油酸、亚麻酸及
12、花生四烯酸等不饱和脂肪酸。脂肪酸残基端具有憎水性，其胆碱残基端具亲水性，因此是一种天然的乳化剂。在乳化过程中，当少量的油与乳化剂一起在大量水中用高速搅拌混合机混合，油滴将以微滴状分散在水相中，在细滴的表面上乳化剂以亲油的非极性端相对，而以其亲水的极性端伸向水中。由于极性相斥，体系中微滴之间的斥力比相互间的引力要大，因而形成稳定的乳浊液。乳浊液的稳定性与系统中各组分间的比例、乳化剂种类及其用量、乳化的机械条件等密切相关。食品工业中可从大豆油精练过程中获得廉价卵磷脂。三、试剂及材料1、95%乙醇2、10%NaOH 溶液 称取 10g 氢氧化钠，用蒸馏水溶解并稀释至 100mL。3、鸡蛋4、花生油四
13、、仪器设备1、电热恒温水浴锅2、磁力搅拌器3、高速电动搅拌机4、摄像显微系统（由电脑、摄像头、显微镜、摄像控制软件组成）五、操作方法（一）卵磷脂的提取选新鲜鸡蛋一个，轻轻在鸡蛋两头击破一小孔，让蛋清从小孔流出，破壳取出蛋黄置小烧杯内，捣烂，搅拌下加入 50 95%乙醇 60 mL， ，保温提取 5min，冷却过滤，将滤液置于瓷蒸发皿，水浴蒸干，残留物即为卵磷脂。（二）鉴定卵磷脂1、三甲胺试验：取少量本实验提取的卵磷脂于试管内，加入 2mL 10%NaOH ,混匀，水浴加热，嗅之是否产生鱼腥味。2、丙酮溶解试验：加入约 5m l 丙酮于装有卵磷脂提取物的瓷蒸发皿，不断用玻棒搅拌卵磷脂观察其在丙酮
14、中的溶解情况。同时也是提纯卵磷脂的过程。7（三）乳化试验：1、乳化液制备：按下表选择乳化液制备方法。序号 蒸馏水 花生油 卵磷脂 乳化处理方法及处理时间1 100mL 1mL /2 100mL 1mL 适量2、利用显微摄像系统观察油脂在水中的乳化效果并对乳化液与非乳化液进行摄像，根据油脂在水相中的分散情况，评价油脂乳化试验的效果。乳化效果摄像操作步骤：（1）水平放置显微镜，开启并调节照明光源，装上合适的目、旋上适当的低倍物镜。 （2）用点滴管取少量乳化液滴在载玻片上，小心把盛有样品的载玻片放上光学显微镜的物台，用标本固定夹固定。移动标本移动器，使观察的部位对准聚光器上面的透镜中心。（3）上下移
15、动显微镜的粗调选钮，使物镜下至距离标本片最低的位置，但不能接触载玻片以免损坏镜头或标本。（4）用眼睛在目镜上观察，两手向上慢慢旋动粗调使显微镜上升至视野中出现较清晰的被检物。（5）移动载片标本，寻找具有代表性的被检物点放在视野中心，反复调整微调旋钮使被检物至最清晰为止。（6）把摄像头放入摄像连接管，拉开摄像光路开关，进入电脑摄像软件应用程序，把鼠标移至 USB2.0 相机 菜单，出现 连接 按钮，点击 连接 调整显微镜微粗细调旋钮至要检测的图象在视屏中清晰为止 点击 捉捕图象键 ，对图象进行摄像 对摄影像片进行保存。点击 视屏键 可以返回图象观察状态，重新对另一图象进行摄像。（7）测量摄像图中
16、物体的大小：进入 DN-2 应用软件调处所存图片文件点击 测量菜单 选择 线测量 键 从测定物的起点拉动鼠标把测量连线连至测定物终点，从屏幕中可直接读出物体相关长度值（单位：m） 点击 融合 键，将测量值标注在图片中保存测量图片结果。（8）打印分析摄像图谱。3、乳化结果记录乳化液处理静置 15min 后，观察比较各乳化实验结果并记录。乳化剂种类油水分散处理方法及条件描述油水乳化体系感官分析描述显微镜观察油水乳化体系情况（油滴分散、大小等）无8卵磷脂六、实验结果讨论分析七、思考题1、 向卵磷脂粗品添加丙酮的作用是什么？可去除何种杂质？2、乳化过程要形成稳定的乳浊液，可采用什么仪器方法实现？3、使
17、用生物显微镜的操作要点是什么？实验三、蛋白质的盐析透析一、蛋白质盐析（一）目的要求 了解蛋白质的沉淀作用，加深对影响蛋白质胶体分子稳定性因素的认识。（二）实验原理水溶液中蛋白质分子由于表面生成水化层及蛋白质分子上某些基团离子化而使蛋白质分子表面带有电荷，增加了水化层的厚度而成为稳定的亲水胶体颗粒，水膜和电荷一旦被除去，蛋白质颗粒将由于失去电荷和脱水而发生沉淀。向蛋白质溶液中加入无机盐（如硫酸铵、硫酸镁、氯化钠等）后，蛋白质便从溶液中沉淀析出，这种沉淀作用称为蛋白质盐析。其过程是一个可逆过程，当除去引起蛋白质沉淀因素后，被盐析的蛋白质仍可重新溶于水中，其天然性质不发生变化。用不同浓度的盐可将不同
18、种类蛋白质从混合溶液中分别沉淀的过程，称为蛋白质的分级盐析。例如蛋清溶液中的球蛋白可被半饱和的硫酸铵溶液沉淀提取，饱和的硫酸铵溶液可使清蛋白沉淀析出。因此，盐析法常被用于分离和提取各种蛋白质及酶制剂。（三）试剂及材料1、10%蛋清溶液 选新鲜鸡蛋，轻轻在蛋壳上击破一小孔，取出蛋清，按新鲜鸡蛋清1 份，九份 0.9%NaCl 溶液的比例稀释配制蛋清液，混匀，用四层纱布过滤后备用。2、饱和硫酸铵溶液 称取 76.6g 硫酸铵溶于 100mL 25 蒸馏水中。3、固体硫酸铵。（四）操作方法1、取两支试管，分别加入 10%蛋清溶液 5 mL，饱和硫酸铵 5 mL，静置 5min，观察有否沉淀物产生，沉
19、淀物为何物？2、取其一试管，用点滴管弃去上清夜，加水至沉淀物，观察沉淀是否会再溶解，说明9沉淀反应是否可逆。3、用滤纸把另一试管的沉淀混合物过滤，向滤液中添加固体硫酸铵至溶液饱和，注意观察溶液有否蛋白质沉淀产生，此沉淀又为何物？注意：把溶液中硫酸铵固体沉淀与蛋白质沉淀区别开来。二、蛋白质的透析（一）目的要求 学习透析的基本原理和方法（二）实验原理 透析是利用小分子能通过，而大分子不能透过半透膜的原理，把不同性质的物质彼此分开的一种手段。透析过程中因蛋白质分子体积很大，不能透过半透膜，而溶液中的无机盐小分子则能透过半透膜进入水中，不断更换透析用水即可将蛋白质与小分子物质完全分开。蛋白质和酶的提取
20、过程，常用此法使之脱盐。如果透析时间过长，可采用低温条件下进行，以防止微生物滋长、样品变质或降解。透析袋材料通常有火棉胶、商品化透析袋等。利用硝酸银和双缩脲反应的透析结果进行检验：Cl AgAgClCuSO4HNa2SO4 （三）试剂及材料1、氯化钠蛋清溶液 取一个鸡蛋清蛋白，加入 30%NaCl 溶液 100mL、250 mL 蒸馏水混合均匀后，四层纱布过滤。2、1%AgNO 3 称取 1g AgNO3 ,溶解于 100 mL 水中，贮存棕色瓶保存。3、1%CuSO4 称取 1g CuSO4，用水溶解并稀释至 100mL。4、10%NaOH 称取 10g NaOH，用水溶解并稀释至 100m
21、L。5、5%火棉胶 分析纯。（四）操作方法1、透析袋的制备 直接把 5%火棉胶试剂约 10 mL 倒入洁净、干燥的 100mL 三角锥瓶底部，然后徐徐转动三角瓶，使火棉胶由底部至瓶口均匀分布于瓶内壁，同时弃去多余的火棉胶，将三角瓶倒置，自然风干 10min。小心剥离三角瓶口薄胶，引自来水沿瓶内壁与袋膜间流入，使透析袋与瓶壁逐渐分离，取出透析袋，同时检查透析袋的完好性。2、透析 把 10mL 氯化钠蛋清液注入透析袋内，扎紧透析袋顶部，系于一横放在盛有蒸馏水的烧杯的玻璃棒上，调节水位使透析袋完全浸没蒸馏水中。3、透析情况检验（1）无机盐透析检验：透析 10 min 后，自烧杯中取透析用水 2 mL
22、 于试管中，用1%AgNO3 检验氯离子是否能被透析出。10（2）蛋白质透析检验：自烧杯中另取透析用水 2 mL 于试管中，加入 2 mL 10%NaOH，摇匀，再加 1%CuSO4 数滴，进行双缩脲反应，检验蛋白质是否被透析出。（3）不断更换烧杯中的蒸馏水以加速透析进行，经数小时侯烧杯中的水不再有氯离子检出为止，则表明透析完成。因为蛋清溶液中的清蛋白不溶于纯水，此时可观察到透析袋中有蛋白沉淀出现。三、实验结果讨论分析。四、思考题1、制作透析袋时能否用采用热风干燥加速其成膜？为什么？2、高浓度的硫酸铵对蛋白质溶解度有何影响，为什么？3、盐析与透析在蛋白质、生物酶提取纯化中的意义。4、蛋白质可逆
23、沉淀反应与不可逆沉淀反应的区别在哪里？举例说明。实验四、氨基酸纸电泳分离鉴定一、目的要求 通过电泳分离氨基酸，了解氨基酸的性质以及电泳分离技术的应用。二、实验原理 带电粒子（胶体或分子）在直流电场作用下，能向异性电极迁移，这种现象称为电泳。带电粒子之所以能在电场的作用下迁移，是因为在一定 PH 环境条件下，不同的物质所带的电荷种类、数量不同，在一定的电场作用下，就以不同的速度向不同的电极方向移动，从而达到分离混合物和鉴定未知物的目的。带电粒子在电场内移动的方向及电泳速度，除取决于粒子的分子量和电荷量外，还与电场强度、溶液 PH、缓冲溶液的离子强度以及电渗等因素有关。电泳是离子在电场中通过介质的
24、移动，按支持介质的不同可分为：（1）纸电泳：以滤纸、玻璃纤维等为支持物。 （2）凝胶电泳：以聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、淀粉凝胶等为支持物。 （3）薄膜电泳：醋酸纤维素为支持物。氨基酸分离选用滤纸为支持介质进行电泳。氨基酸在水溶液中通常解离成两性离子，它在酸性和碱性介质中的变化可用下式表示： CHORN3HORCHOHN3HORCHN2在酸性介质中，氨基酸主要以阳离子状态存在，电泳时向阴极移动；在碱性介质中，氨基酸主要以阴离子状态存在，电泳时向阳极移动，当介质的 PH 值为氨基酸的等电点时，11氨基酸以中性偶极离子存在，电泳时不向阴阳电极移动。实验在 pH=5.9 的缓冲溶液中进行，一张被 P
25、H5.9 缓冲溶液所湿润的滤纸的两端加上直流电压，在电场的作用下，加在滤纸支持介质的各种氨基酸样品，由于所带电荷性质不同，分别向正负极方向移动，电泳体系缓冲溶液偏离氨基酸的等电点越远，氨基酸所带的电荷越多，离子移动的速度也就越快，因各氨基酸迁移的速度均不相同，从而达到分离的目的。三、试剂及材料1、PH5.9 0.025mol/L 邻苯二甲酸氢钾氢氧化钠缓冲溶液 称取邻苯二甲酸氢钾5.10g，加水溶液至 950mL ,用氢氧化钠调整 PH=5.9，补水至 1000mL 。2、氨基酸溶液 0.5%亮氨酸、 0.5%赖氨酸、0.5%天门冬氨酸。3、氨基酸混合液。4、氨基酸显色液 0.1%茚三酮丙酮溶
26、液。四、仪器设备 中压电泳仪、电泳槽。五、操作方法1、 电泳滤纸的裁剪 取层析滤纸裁成 25025mm 的滤纸条，用铅笔在滤纸的中心位置标记样品电泳时的起始位置，在滤纸的两端标上正负极符号。如下图所示。（+） （-）2、 向电泳槽添加适量的缓冲溶液，要求两槽缓冲液液面保持同一水平。3、 接上电泳仪主机，中压条件下预热 10min。关闭电泳仪电源。4、 用 PH5.9 缓冲液湿润滤纸条，然后用电吹风把多余的缓冲液吹干，把滤纸条按正负极方向横架于电泳槽的支位上，滤纸面尽量绷直，滤纸两端下垂紧贴在定位板，末端浸入缓冲液约 10mm 深。注意滤纸条不应接触电极，两滤纸间应保持一定间距。5、用微量进样器
27、吸取氨基酸样品 4l ，一次把样品点在滤纸的起始点（）上，然后正确连接主机与电泳槽的正负极连线，盖上电泳槽盖子。6、开启主机电源，调整电泳电压至 300V，记录电泳初始电压。注意电泳过程电流的变化，如电泳电流接近仪器的最大额定工作电流时，可把电压略调低使电流不超过20mA。7、30min 后电泳结束，记录电泳终止电压，关闭电源，迅速把滤纸条从电泳槽中取出，用电吹风挥干其缓冲溶液。8、用喷雾器对滤纸均匀喷洒茚三酮显色剂，立即用热风吹干，在滤纸上可显示清晰的氨基酸显色斑点。标记电泳图谱氨基酸斑点位置，分析判断为何种氨基酸。注：在纸电泳中，由于滤纸常含有一定量的羧基而带负电荷，使与纸相接触的水溶液带
28、正电荷，使液体向负极移动。此时，粒子实际电泳的速度是粒子本身电泳速度与由于水溶液移动而产生电渗速度的迭加。因12此，若粒子原来向负极移动，则表面速度将比电泳速度快；若原来向正极移动，则表面速度将比电泳速度慢，所以，中性物质有时在电场中也可能向负极移动。六、实验结果讨论分析要求绘出电泳谱图，分析各氨基酸向正负极移动的原理。七、思考题1、 实验中若电泳缓冲液的 PH 改变为 2.9，电泳图谱各氨基酸斑点的位置将发生什么变化？2、 蛋白质 A 的 PI=5.5，蛋白质 B 的 PI=6.9，电泳介质 PH=7.0，电泳时各蛋白向哪个电极方向迁移？为什么？3、记录电泳过程电参数的变化有何意义？4、实验
29、中哪些步骤须除去滤纸多余的缓冲液或须对滤纸进行热风干燥，其目的是什么？实验五 激活剂、抑制剂、温度及 PH 对酶活性的影响一、目的要求 通过实验加深对酶性质的认识，了解测定 -淀粉酶活力的方法。二、实验原理 酶是生物体内具有催化作用的蛋白质，通常称为生物催化剂。酶催化的反应称为酶促反应。生物催化剂催化生化反应时具有：催化效率好、有高度的专一性、反应条件温和、催化活力与辅基，辅酶，金属离子有关等特点。能提高酶活力的物质，称为激活剂。激活剂对酶的作用有一定的选择性，其种类多为无机离子和简单的有机化合物。使酶的活力中心的化学性质发生变化，导致酶的催化作用受抑制或丧失的物质称为酶抑制剂。氯离子为唾液淀
30、粉酶的激活剂，铜离子为其抑制剂。应注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。如氯化钠达到约 30%浓度时可抑制唾液淀粉酶的活性。酶促反应中，反应速度达到最大值时的温度和 PH 值称为某种酶作用时的最适温度和PH 值。温度对酶反应的影响是双重的：一方面随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大反应速度为止；另一方面随着温度的不断升高，而使酶逐步变性从而使反应速度降低。同样，反应中某一 PH 范围内酶活力可达最高，在最适 PH 的两侧活性骤然下降，其变化趋势呈钟形曲线变化。食品级 -淀粉酶是一种由微生物发酵生产而制备的微生物酶制剂，主要由枯草
31、芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉等微生物产生。但不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的最适温度、PH、对淀粉的水解程度，以及产物的性质等均有差异。-淀粉酶属水解酶，作为生13物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的 -1,4 糖苷键，迅速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉与碘的反应逐渐消失，这种作用称为液化作用，生产上又称 -淀粉酶为液化淀粉酶。-淀粉酶不能水解淀粉支链的 -1,6 糖苷键，因此最终水解产物是麦芽糖、葡萄糖和 -1,6 键的寡糖。本实验通过淀粉遇碘显蓝色，糊精按其分子量的大小遇碘显紫蓝、紫红、红棕色，较小的糊精（少于 6 个葡萄糖单位）遇碘不显色的呈色反应，
32、来追踪 -淀粉酶作用于淀粉基质的水解过程，从而了解酶的性质以及动力学参数。三、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活力的影响（一）试剂及材料1、1：30 唾液淀粉酶配置 用蒸馏水漱口，1min 后收集唾液，以 1：30 倍蒸馏水稀释。2、0.2%可溶性淀粉 称取可溶性淀粉 0.2g，预加 20mL 蒸馏水调匀，然后倒入 80mL沸水中，继续煮沸至溶液透明，冷却后补水至 100mL。3、1%NaCl 溶液 称取 1.0 g 氯化钠，加水溶解稀释至 100mL 。4、1%CuSO4 溶液 称取 1.0 g 硫酸铜，加水溶解稀释至 100mL。5、标准稀碘液 称取 11g 碘，22g 碘化钾，置研钵中，加入适
33、量的水研磨至碘完全溶解，并加水稀释定容至 500mL。吸取 2mL 上述碘液，加入 10 g 碘化钾，用水稀释至 500 mL。（二）仪器设备 电热恒温水浴锅。（三）操作方法取试管 3 根，编号后按下表配置实验样液。试管序号0.2%可溶性淀粉1%NaCl 1%CuSO4 蒸馏水 1：30 唾液淀粉酶1 2.0 mL 1.0 mL / / 1.0 mL2 2.0 mL / 1.0 mL / 1.0 mL3 2.0 mL / / 1.0 mL混匀，放入37水浴中保温10min。立即加入唾液淀粉酶。1.0 mL用点滴管并不断从试管中吸取样液于比色白瓷板，用稀碘液检验试管内淀粉被淀粉酶水解的程度，记录
34、各试管内样液遇碘不显蓝色的先后顺序，解释实验现象的原因。四、温度与 PH 值对 -液化淀粉酶活力的影响（一）试剂与材料1、2%可溶性淀粉溶液 称取可溶性淀粉 2.0g（预先在 105烘干） ，预加 20mL 蒸馏水调匀，然后倾入 80mL 沸水中煮沸至溶液透明，冷却后定容至 100mL。2、PH4.0 、5.0、6.0、7.0、8.0 磷酸氢二钠柠檬酸缓冲溶液（1）0.2 mol /mL Na2HPO4 称取 35.60g Na2HPO4.2H2O，用水溶解定容至 100mL。（2）使用酸度计，用柠檬酸调整至所需的 PH 值。3、供试酶液的制备 称取固体 -液化淀粉酶 1.00g，加入 PH6
35、.0 磷酸氢二钠柠檬14酸缓冲溶液 100mL (缓冲液的加入量视酶活力大小而定，控制酶解反应在 5-10min 内完成)，于 40恒温水浴中活化 0.5 小时，然后用 3000rpm / min 离心机离心分离 5min，酶提取液于冰箱保存，供试验用。4、标准比色液 甲液：称取氯化钴（CoCl.6H2O）40.2439g、干燥重铬酸钾 0.4748 g，溶解并定容至500mL。乙液：称取铬黑 T 40.00mg，溶解并定容至 100mL。使用时取甲液 40.0mL、乙液 5.0 mL，混合。混合比色液宜放置冰箱保存，使用 7 天后重新配置。5、标准稀碘液。（二）仪器设备 电热恒温水浴锅。（三
36、）操作方法1、用滴管吸取一定量标准比色液于白色瓷比色板空穴中，作为判断酶解反应终点的标准色。2、不同温度对 -液化淀粉酶活力的影响 取 4 根 25200mm 试管，按下表配制反应溶液。试管序号 1 2 3 42%可溶性淀粉 20.0mL 20.0mL 20.0mL 20.0mLPH6.0 缓冲液 5.0mL 5.0mL 5.0mL 5.0mL把四根试管分别放入 50、60、70、80恒温水浴中预热 10min分别加供试酶液 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL50 60 70 80反应完成时间记录（min）加入供试酶液后，立即用秒表或手表记时，充分要匀，定时用点滴管从各反应试管中分
37、别吸取 1-2 滴反应液，滴入预先盛有 2/3 稀碘液的比色白瓷板孔穴内 ，从淀粉遇碘显色的变化情况，跟踪淀粉在淀粉酶作用下被水解的过程，当穴内颜色反应由紫色逐渐变为红棕色，与标准比色液的颜色相同时，即达反应终点，记录酶解反应完成所需时间。3、不同 PH 值对 -液化淀粉酶活力的影响 取 5 根 25200mm 试管，按下表配制反应溶液。试管序号 2%可溶性淀粉 缓冲溶液 供试酶液 反应完成时间记录（min）1 20mL PH4.0 5.0 mL 0.5 mL3 20mL PH6.0 5.0 mL 0.5 mL4 20mL PH7.0 5.0 mL 0.5 mL5 20mL PH8.0 5.0
38、 mL恒温水浴 60预热10min。 0.5 mL15其它操作与温度对酶活力影响实验相同。五、结果计算和讨论淀粉酶活力单位定义为 在一定条件下，1 g 酶制剂 1 小时内液化可溶性淀粉的克数。 酶活力单位(U/g)= nt5.0260式中：20可溶性淀粉的用量（mL） ；t酶解反应完成所需的时间（min） ；0.5测定时稀释酶液用量（mL） ；0.02可溶性淀粉溶液的浓度（g/mL） ；n酶制剂稀释倍数1、不同温度对 -液化淀粉酶活力影响的结果记录实验结果 50 60 70 80酶活力（U/g）2、不同 pH 值对 -液化淀粉酶活力影响的结果记录实验结果 pH4.0 pH6.0 pH7.0 p
39、H8.0酶活力（U/g）分别以 PH 值、温度为横坐标，以酶活力单位为纵坐标，绘制 PH 值酶活力单位、温度酶活力单位图。讨论分析实验结果。六、思考题1、从实验操作技能方面考虑，做好本实验的操作要点是什么？2、实验过程中若激活剂或抑制剂的作用不明显，如何调整实验方案？3、进行酶的生化实验必须考虑控制哪些条件？为什么？4、生化反应用酶前对酶进行活力进行测定，对实验有何实际指导意义？5、酶在干燥状态下与在水溶液中保存，它的活性受温度的影响是否相同？实验六、果蔬中过氧化物酶活力测定16一、目的要求了解过氧化物酶的生物氧化作用，学习过氧化物酶的测定方法。二、实验原理过氧化物酶属氧化还原酶，能催化底物过
40、氧化氢对某些物质的氧化。反应中的供氢体可为各种多元酚（对甲酚、愈创木酚、间苯二酚）或芳香族胺（苯胺、联苯胺、邻苯二胺）以及 NADH2 NADFH2。其作用机理可分为以下几步：第一步 形成酶底物复合物过氧化物酶 + H2O2 酶复合物第二步 酶复合物转变成褐色的酶复合物酶复合物 + AH 酶复合物 + A第三步 酶复合物被还原，释放酶酶复合物 + AH 过氧化物酶 + A + H2O2AH 表示还原形供氢体。在一定条件下，酶复合物可生成产物（P）同时释放出酶，亦可与过量的过氧化氢形成稳定的复合物：酶复合物 + H2O2 酶复合物本实验以愈创木酚为供氢体，H2O2 为氢的受体，愈创木酚在过氧化物
41、酶催化作用下被氧化后，生成褐色的有色产物，根据酶活力大小与有色产物颜色的深浅成正比，在波长下测定其吸光值，可求出过氧化物酶的活力。OCH3H4H2O OOCH3CH3OCH3CH3 8H2O 以每分钟吸光度的变化值表示过氧化物酶活力大小，即以 A470/min.g 鲜重计算。测定过氧化物的实际意义在于，过氧化物广泛存在于植物组织中，在果蔬加工过程中的主要作用包括两个方面：（1）过氧化物酶氧化作用与果蔬原料，特别是非酸性蔬菜在保藏期产生不良风味有关；（2）过氧化物酶属最耐热的酶类，在果蔬加工中果蔬中过氧化物17酶活力大小常被用作衡量果蔬热处理灭酶是否充分的指标，因为当果蔬中的过氧化物酶在热烫中失活时，表明其它酶以活性形式存在的可能性以达到最小。三、试剂及材料1、30%过氧化氢。2、愈创木酚3、20 mmol/L 磷酸二氢钾溶液 称取 2.72g 磷酸二氢钾，用蒸馏水溶解并定容至100mL。4、100 mmol/L 磷酸 PH6.0 缓冲溶液 吸取 6.3 mL 磷酸加水至 100 mL，用氢氧化钠调整至所需的 PH。5、反应混合液 取 25 mL 磷酸缓冲溶液于烧杯中，加入愈创木酚 140l，于磁力搅拌器中搅拌至愈创木酚溶解，加入 30%过氧化氢 95l，混匀置冰箱保存备用。6、新鲜白菜梗。四、仪器设备 可见光分光光度计。五、操作方法1、酶液提取 取白菜梗 10g，加入磷酸盐溶
