1、生物化学实验教案侯沁文目 录实验一 糖的颜色反应 1实验二 糖的还原作用 3实验三 多糖的实验 4实验四 糖的旋光性和变旋现象 5实验五 血糖的定量测定（葡萄糖氧化酶法） 7实验六 人血清中总胆固醇的测定 8实验七 牛奶中粗脂肪含量的测定 9实验八 牛奶中酪蛋白的提取 11实验九 牛奶中酪蛋白含量的测定 12实验十 氨基酸的纸层析 14实验十一 醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质 16实验十二 蛋白质的颜色反应 18实验十三 蛋白质的沉淀反应 20实验十四 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量 .21实验十五 双缩脲法测定蛋白质浓度 22实验十六 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度 24实
2、验十七 紫外光吸收法测定蛋白质浓度 25实验十八 血清谷丙转氨酶的测定 27实验十九 过氧化物酶的作用 28实验二十 溶菌酶的提纯结晶 29实验二十一 酵母 RNA 的提取 .30实验二十二 RNA 的定量测定（苔黑酚法） 31实验二十三 DNA 的提取及含量测定 32实验二十四 荞麦中总黄酮的定性定量研究 321实验一 糖的颜色反应实验目的及要求 1. 掌握莫式（Molisch）试验鉴定糖的原理和方法。2. 掌握塞式（Seliwanoff）试验鉴定酮糖的原理和方法。3. 掌握杜式(Tollen)试验鉴定酮糖的原理和方法。实验原理1莫式试验：糖经无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物
3、，后者在浓无机酸作用下，能与 -萘酚生成紫红色缩合物。2塞式试验：酮糖在浓酸的作用下，脱水生成 5-羟甲基糠醛，后者与间苯二酚作用，呈红色反应；有时亦同时产生棕红色沉淀，此沉淀溶于乙醇，成鲜红色溶液。3杜式试验：戊糖在浓酸溶液中脱水生成糠醛，后者与间苯三酚结合成樱桃红色物质。实验仪器及用品仪器：水浴锅。器皿：吸管、试管。实验药品：蔗糖、葡萄糖、淀粉、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、-萘酚、浓硫酸、95% 乙醇、间苯二酚、盐酸、间苯三酚。实验试剂莫式试剂：-萘酚 5g,溶于 95%乙醇并稀释至 100ml。现用现配，并贮于棕色试剂瓶中。塞式试剂：间苯二酚 50mg，溶于 100ml 盐酸（V H2O：V
4、 HCl=2:1），现用现配。杜式试剂：2%间苯三酚乙醇溶液（ 2g 间苯三酚溶于 100ml95%乙醇中）3ml,缓缓加入浓盐酸15ml 及蒸馏水 9ml。临用时配制。实验内容及步骤一、莫式实验于 4 支试管中，分别加入 1 ml1%葡萄糖溶液、1% 蔗糖溶液、1%淀粉溶液和少许纤维素（棉花或滤纸浸在 1 ml 水中），然后各加莫式试剂 2 滴，摇匀，将试管倾斜，沿管壁慢慢加入浓硫酸 1.5 ml（切勿振摇！），硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，观察液面交界处有无紫色环出现。二、塞式试验于 4 支试管中，分别加入 0.5 ml1%葡萄糖溶液、1% 蔗糖溶液、1%果糖溶液，然后各加塞式试剂
5、2.5ml，摇匀，同时置沸水浴内，比较各管颜色及红色出现的先后顺序。 三、杜式试验2于 3 支试管中加入杜式试剂 1ml，再分别加入 1 滴 1%葡萄糖溶液、1%半乳糖溶液和 1%阿拉伯糖溶液，混匀。将试管同时放入沸水浴中，观察颜色的变化，并记录颜色变化的时间。四、实验现象记录仔细观察实验中的颜色变化，对于塞式试验和杜式试验还需记录下颜色变化的时间。3实验二 糖的还原作用实验目的及要求 掌握糖的还原反应来鉴定糖的原理和方法。实验原理费林(Fehling)试剂和本尼迪(Benedict)试剂均为含 Cu2+的碱性溶液，能使具有自由醛基或酮基的糖氧化，其本身则被还原成红色或黄色的 Cu2O，此法常
6、用作还原糖的定性或定量测定。实验仪器及用品实验仪器：水浴锅实验器皿：吸管、试管实验试剂：硫酸酮、氢氧化钠、酒石酸钾钠、柠檬酸钠、无水碳酸钠、淀粉、蔗糖、葡萄糖。实验试剂1. 费林试剂试剂 A：CuSO 45H2O 34.5 g,溶于蒸馏水并稀释至 500 ml。试剂 B：氢氧化钠 125 g，酒石酸钾钠 137 g，溶于蒸馏水并稀释至 500 ml。临用时将试剂 A 与试剂 B 等体积混合。2. 本尼迪试剂：柠檬酸钠（Na 3C6H3O711H2O）及 50 g 无水碳酸钠，溶于 400 ml 蒸馏水中。另溶解 8.5 g 硫酸铜于 50 ml 热水中。将硫酸铜溶液缓缓加入柠檬酸钠 -碳酸钠溶
7、液中，边加边搅拌，如有沉淀可过滤。此混合液可长期使用。实验内容及步骤于 3 支试管中加入费林试剂 A 和 B 各 1 ml，混匀，分别加入 1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和 1%淀粉溶液 1 ml，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，观察各管的变化。另取 3 支试管，分别加入 1%葡萄糖溶液、1% 蔗糖溶液和 1%淀粉溶液 1 ml，然后每支试管加本尼迪试剂 2 ml，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，和上面结果比较。4实验三 多糖的实验实验目的及要求 1熟悉淀粉多糖的碘试验反应原理和方法。2进一步了解淀粉的水解过程。实验原理淀粉广泛分布于植物界，谷、果实、种子、块茎中含量丰富，工业用的淀粉主要来
8、源于玉米、山芋、马铃薯。本实验以马铃薯为原料，利用淀粉不溶或难溶于水的性质来制备淀粉。淀粉遇碘呈蓝色，是由于碘被吸附在淀粉上，形成复合物，此复合物不稳定，极易被醇、氢氧化钠和加热等使颜色褪去，其他多糖与碘呈特异的颜色，此类呈色物质极不稳定。淀粉在酸催化下加热，逐步水解成分子较小的糖，最后水解成葡萄糖。实验仪器及用品器材：研钵、布氏漏斗、抽滤瓶、表面皿、白瓷板、胶头滴管、电炉、石棉网、纱布、试管、烧杯、吸管、量筒、试管夹。试剂：碘化钾、碘、淀粉、氢氧化钠、本尼迪试剂，浓硫酸、碳酸钠。实验内容及步骤一、马铃薯淀粉的制备将马铃薯去皮，在研钵中充分研碎，加水混合，用纱布过滤，除去粗颗粒，滤液中的淀粉很
9、快沉到底部，多次用水洗淀粉，抽滤，滤饼放在表面皿上，在空气干燥中即得。二、淀粉与碘的反应1置少量自制淀粉于白瓷板上，加 1-3 滴稀碘液（配制 2%碘化钾溶液，加入适量碘，使溶液呈淡黄棕色即可），观察颜色变化。2取试管 1 支，加 0.1%淀粉 5 ml，再加 2 滴稀碘液，摇匀后，观察其颜色变化。将管内液体分成 3 份，其中 1 份加热，观察颜色是否褪去。冷却后，颜色是否全部恢复。另 2 份加入乙醇或10%NaOH 溶液，观察颜色变化并解释之。三、淀粉的水解反应在一小烧杯中加入 1%淀粉溶液 25 ml 及 20%硫酸 1 ml，放在石棉网上小火加热，微沸后每隔两分钟取出反应液 2 滴置于白
10、瓷板上做碘试验。与此同时另取反应液三滴，用 10%碳酸钠中和后，做本尼迪试验，记录试验结果并解释之。5实验四 糖的旋光性和变旋现象实验目的及要求1了解糖的变旋现象，掌握用糖的旋光性测定糖浓度的方法。2学会使用旋光仪。实验原理光是一种电磁波，光波振动的方向与光的前进方向垂直。普通光的光波在各个不同的方向上振动。但如果让它通过一个尼科尔(Nicol)棱镜（用冰洲石制成的棱镜），则透过棱镜的光就只在一个方向（偏振面）上振动，这种光就叫做平面偏振光。偏振光能完全通过晶轴与其偏振面平行的尼科尔棱镜，而不能通过晶轴与其偏振面垂直的尼科尔棱镜。当平面偏振光通过某种介质时，有的介质对偏振光没有作用，即透过介质
11、的偏振光的偏振面保持不变。而有的介质却能使偏振光的偏振面发生旋转。这种能旋转偏振光的偏振面的性质叫做旋光性。具有旋光性的物质叫做旋光性物质或光活性物质。具有不对称结构的手性化合物都有旋光性。6能使偏振光的偏振面向右旋的物质，叫做右旋物质；反之，叫做左旋物质。通常用“d“（拉丁文 dextro 的缩写， “右“的意思）或“+“表示右旋；用“l“（拉丁文 laevo 的缩写，“ 左“的意思）或“-“表示左旋。偏振光的偏振面被旋光物质所旋转的角度，叫做旋光度，用“表示。旋光度的大小不仅取决于物质的本性，还与溶液的浓度、液层的厚度、光的波长、测定温度以及溶剂的性质等等有关。偏振光通过厚度为 1dm，浓
12、度含有 1g/ml 的待测物质的溶液所测得的旋光度称为比旋光度 ，它是物质的一个特性常数，如下式所示：t=/cl式中 t：测定时的温度；：测定时所用光源的波长；：实测的旋光度；c：溶液的浓度（g/ml）；l：玻管的长度（dm）。一个有旋光性的溶液放置后其比旋光度改变的现象称为变旋。变旋的原因是糖从 -型变为 -型或由 -型变为 -型。一切单糖都有变旋现象。无 -，-型的糖类即无变旋性。实验仪器及用品仪器：旋光仪、电子天平。器皿：容量瓶、烧杯、玻棒。试剂：未知浓度的蔗糖溶液、10%葡萄糖溶液。实验内容及步骤一、利用糖的旋光性测定糖的浓度1转开样品管螺母，洗净玻管，然后向管中注满蒸馏水，盖上玻片，
13、注意管中不能有气泡，玻片上的水渍必须擦干。2把样品放入旋光仪内，打开电源，待钠光源稳定 1-2min 后，转动刻度盘，使目镜中两半圆的亮度相等，记下刻度盘的读书，以此为零点。3用蔗糖代替蒸馏水测其旋光度，并按公式计算出蔗糖的浓度。二、糖的变旋现象用新配制的 10%葡萄糖溶液按上法测其旋光度并计算比旋光度，以后每隔 2h 测定其旋光度，计算比旋光度直至比旋光度不再改变，说明 -，-型互变已达平衡。7实验五 血糖的定量测定（葡萄糖氧化酶法）实验目的及要求掌握葡萄糖氧化酶法测定血糖含量的原理和方法。实验原理D-葡糖糖 D-葡萄糖酸+ H 2O2实验仪器及试剂试管、移液管、UNICO-2000 型分光
14、光度计、恒温水浴锅。酶试剂：葡萄糖氧化酶（GOD）、过氧化物酶（POD）、4-氨基安替吡啉（4-AAP）。酚试剂：苯酚。 标准葡萄糖溶液：100 mg/dL (5.55 mmol/L) 。实验步骤按下表加入各反应物：加入物（ml） 空白管 标准管 测定管葡萄糖标准液 0.020 _血清样品 0.020酶试剂 1.50 1.50 1.50酚试剂 1.50 1.50 1.50混匀，37保温 15min，以空白管调零，505nm 波长处测定各管吸光度值。计算 血糖含量=A 样 /A 标 标准溶液浓度实验注意事项1. 分离血清要求使用未溶血样品，否则测定结果偏大。2. 要求在 30 min 内分离血清
15、，糖酵解在全血中以 7%/h 进行。3. 样本在 4-8可稳定 24h,样本放置时间过长会使结果偏低。GODPODH2O2+4-AAP+苯酚红色醌化物+H 2O8实验六 人血清中总胆固醇的测定实验目的及要求学会利用氧化酶法测定血清中总胆固醇含量的原理和方法。实验原理胆固醇脂+H 2O 胆固醇+游离脂肪酸胆固醇+O 2 4-胆甾烯酮+H 2O22H2O2+4-AA+4-氯仿 醌亚胺（红色）+4H 2OCEH：胆固醇脂酶 POD：过氧化物酶 CHOD：胆固醇氧化酶 4-AA：4-氨基安替吡啉醌亚胺在 500nm 有特征吸收，且生成量与样本中的胆固醇含量成正比，可通过测定标准品反应生成的醌亚胺的吸光
16、度值，计算出样本中胆固醇的浓度。实验仪器及试剂试管、移液管、UNICO-2000 型分光光度计、恒温水浴锅。标准血清、样本血清、蒸馏水、酶试剂盒。实验步骤按下表加入各反应物：l 空白管 标准管 样本管酶试剂 2000 2000 2000蒸馏水 20 _ _标准血清 _ 20 _样本血清 _ _ 20A500nm各管混匀，37反应 6 min，以空白管校零。CEHCHODPODA 样本A标准标准血清浓度胆固醇含量=9实验七 牛奶中粗脂肪含量的测定实验目的及要求学习和掌握粗脂肪的定量测定法索氏提取法。实验原理本实验用重量法，利用脂肪能溶于脂溶性溶剂这一特性，用脂溶性溶剂将脂肪提取出来，借蒸发除去溶
17、剂后称量。整个提取过程均在索氏提取器中进行。通常使用的脂溶性溶剂为乙醚或沸点为 30C -60 C 的石油醚。用此法提取的脂溶性物质除脂肪外，还含有游离脂肪酸、磷脂、固醇、芳香油及某些色素等，故称为“粗脂肪” 。索氏提取器 (如图所示)利用溶剂回流及虹吸原理，使固体物质连续不断地被纯溶剂萃取，既节约溶利萃取效率又高。萃取前先将固体物质研碎，以增加固液接触的面积。然后将固体物质放在滤纸套内，置于提取器中，提取器的下端与盛有溶剂的圆底烧瓶相连，上面接回流冷凝管。加热圆底烧瓶，使溶剂沸腾，蒸气通过提取器的支管上升，被冷凝后滴入提取器中，溶剂和固体接触进行萃取，当溶剂面超过虹吸管的最高处时，含有萃取物
18、的溶剂虹吸回烧瓶，因而萃取出一部分物质，如此重复，使固体物质不断为纯的溶剂所萃取，将萃取出的物质富集在烧瓶中。实验仪器及试剂索氏提取器、干燥箱、电子分析天平、滤纸、棉线、干燥器、烘箱。 全脂牛奶、无水乙醚或石油醚。实验内容及步骤1、牛奶中水分含量的测定准确称取一定量牛奶，吸附于70过夜烘干的层析滤纸上，70烘干后（约20分钟）称量，计算水分含量。水分含量%=（M 牛奶 -M干物质 ）/M 牛奶 100%M干物质 =M带有干物质的层析滤纸 -M层析滤纸2、牛奶中粗脂肪含量的测定将洗净的索氏提取器小烧瓶用铅笔在磨口处编号，103-105烘干2小时，取出，置于干燥器中冷却，然后用电子分析天平称重，并
19、记录。将测完水分含量带有干物质的层析滤纸用定性滤纸包裹，称量后置索氏抽提瓶，连接已干燥至恒重的脂肪接受瓶，由冷凝管上端加入无水乙醚，加量为接受瓶的23体积，恒温水浴加热，控制水温，以每小时回流3-5 次为宜至抽提完全为止（用滤纸试） 。10取下接受瓶，在水浴上蒸干乙醚，再于100105干燥 2小时，取出放干燥器内冷却30分钟，称重，重复操作至恒重。取出滤纸包，于户外晾至无乙醚味，置入恒温箱内，烘干，然后移入干燥缸内冷却后称重，重复操作至恒重。计算 ：（1）粗脂肪含量%=（M 提取前纸包 -M提取后纸包 ）/M 干物质 100%（2）粗脂肪含量%=（M 接受瓶+粗脂肪 -M接受瓶 ）/M 干物质
20、 100%注意事项1、乙醚为易燃有机溶剂，实验室应保持通风并禁止任何明火。2、抽提用的乙醚或石油醚要求无水、无醇、无过氧化物，挥发残渣含量低。因水和醇可导致水溶性物质溶解，如水溶性盐类、糖类等，使得测定结果偏高，被测样品也要事先烘干。过氧化物会导致脂肪氧化，在烘干时也有引起爆炸的危险。3、装样品的滤纸筒一定要严密，不能往外漏样品，但也不要包得太紧影响溶剂渗透。放入滤纸筒时高度不要超过回流弯管，否则超过弯管的样品中的脂肪不能提尽，造成误差。11实验八 牛奶中酪蛋白的提取实验目的及要求掌握一种提取酪蛋白及检测牛乳质量的方法。实验原理酪蛋白是乳蛋白质中最丰富的一类蛋白质，占乳蛋白的 80%-82%，
21、酪蛋白不是单一的蛋白质，是一类含磷的复合蛋白质混合物，以一磷酸酯键与苏氨酸及丝氨酸的羟基相结合。它还含有胱氨酸和蛋氨酸这两种含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。它在牛乳中的含量约为 35g/L，比较稳定，利用这一性质可以检测牛乳中是否掺假。酪蛋白在其等电点（pH4.6）时由于静电荷为零，溶解度很低，利用这一性质，将牛乳调到pH4.6，酪蛋白就可从牛乳中分离出来。酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被用来从酪蛋白粗制品中将脂类杂质除去。实验仪器及用品温度计、布氏漏斗、pH 试纸、抽滤瓶、水浴锅、烧杯、量筒、表面皿、天平、离心机。市售全脂牛奶、无水乙醇、无水乙醚、pH4.7 乙酸钠缓冲液 0.2mol/L。实验内容
22、及步骤1、酪蛋白等电点沉淀将 100mL 牛乳放到 500mL 烧杯中，加热到 40，加入到同样 40的乙酸钠缓冲液中，调到pH4.7。此时有絮状的蛋白质沉淀析出。将悬浮液冷却至室温，放置分层 ，3000 r/min 离心 15 min，收集沉淀。2、水洗将 pH4.7 醋酸-醋酸钠缓冲溶液用蒸馏水稀释 10 倍，洗涤粗制品三次，离心 10 分钟，得到沉淀蛋白。 3、去脂向粗制品中加入 10 ml 无水乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中，用乙醚- 乙醇混合液洗涤沉淀两次，最后用乙醚洗沉淀 2 次，抽干。将沉淀从布氏漏斗中移去，在表面皿上摊开除去乙醚，干燥后得到的是酪蛋白纯品。准确称重
23、后，计算出每 100mL 牛 乳所制备出的酪蛋白质量（g/100 mL），并与理论产量（3.5g/100mL）相比较，求出实际获得百分率。12实验九 牛奶中酪蛋白含量的测定实验目的及要求1、学会用紫外吸收光谱法测定核酸蛋白混合物中蛋白质含量的方法。2、掌握 A224.0nm-A233.3nm 测定蛋白含量的原理和方法。实验原理蛋白质中含有酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光 280nm 波长处有最大吸收。核酸及其衍生物有吸收紫外线的性质，其最高吸收峰在 260nm 处。由于核酸在 280nm 处也有光吸收，因此当蛋白质和核酸共同存在时，测定其中任何一种物质均存在干扰。核酸在 230nm 波长
24、附近吸收值极小，如果将核酸测定值以 230nm 为中心，两侧存在对称而又相等的等吸收点，224nm 波长处的吸收值和 233.3nm 波长处的吸收值相等。蛋白质则不同，从 240nm 波长处向短波长处移动时，其吸收值对波长的减小吸收值呈线性增加。因此，在 240nm 以下短波长一侧的核酸等吸收点中，如果测定蛋白质和核酸混合光密度值，两点间的光密度之差和蛋白质成比例关系。该方法是格罗夫斯等 1968 年建立起来的，能够对浓度为 5-180 微克/毫升的样品作微量测定。该方法有快速，灵敏，不破坏样品原有性质的优点，在测定完蛋白质含量后可用于其他分析。实验仪器及试剂试管、移液管、容量瓶、烧杯、玻璃棒
25、、UNICO-2000 型分光光度计。 pH7 磷酸缓冲液。13实验内容及步骤用 pH7 的磷酸缓冲液溶解上次实验制得的酪蛋白，配置成 5-180g/ml的溶液，测定其在 224 nm 波长处和 233.3 nm 波长处的光密度值。按公式 C 蛋白质 （mg/ml）=(A 224-A233.3)210，计算浓度并反推回至每 100 ml 牛奶中的蛋白含量。注意事项1、在用紫外吸收光谱定量测定蛋白质时，280nm 波长处蛋白质吸收光谱主要由色氨酸和酪氨酸引起，但在 224-240nm 波长处的紫外吸收谱不仅由这些氨基酸引起，与苯丙氨酸，组氨酸，蛋氨酸，胱氨酸及半胱氨酸也有关，因此与其他吸收紫外线
26、的不纯物质共同存在时，就会受到显著影响，这一点也应引起注意。2、pH 值对核酸测定的等吸收点有影响。14实验十 氨基酸的纸层析实验目的及要求 了解并掌握氨基酸纸层析法的原理和方法。实验原理用滤纸为支持物进行层析的方法，称为纸层析法。纸层析所用的展层溶剂大多由水和有机溶剂组成，滤纸纤维与水的亲和力弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。溶剂由下向上移动的，称为上行法；由上向下的，称下行法。将样品点在滤纸上，进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，形成距原点距离不等的层析点，于是便将这些氨基酸分离开来。溶质在滤纸上的
27、移动速率用 Rf 表示：Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离只要条件不变，R f 是常数，故可根据 Rf 值作定性依据。实验仪器及用品实验器材：滤纸、烧杯、剪刀、层析缸、微量注射器（10l ）、电吹风、722 型分光光度计。实验试剂：氨基酸混合液碱相熔剂： V 正丁醇 :V12%氨水 :V95%乙醇 =13:3:3酸相溶剂： V 正丁醇 :V80%甲酸 :V 水 =15:3:2显色贮备液：V 0.4mol/L 茚三酮-异戊醇 :V 甲酸 :V 水 =20:1:5实验内容及步骤一、标准氨基酸单向上行层析法1滤纸准备；2点样；3展层和显色。二、混合氨基酸双向上行纸层析1.准备2点样；
28、3展层和显色；4定性鉴定与定量测量。三、数据记录和处理151计算出每种标准氨基酸的 Rf 值；2混合氨基酸的 Rf 值；3对照标准氨基酸的 Rf 值，指出氨基酸的名称。实验注意事项. 必须选用新华 1 号滤纸。. 点样时，样点的直径不能超出 0.5mm。16实验十一 醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质实验目的学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理。实验原理醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法。带电物质在电场力作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。由于各种蛋白质都有特定的等电点，如将蛋白质置于pH 值低于其等电点的溶液中，则蛋白质将带正电荷而向负极移动。反
29、之，则向正极移动。因为蛋白质分子在电场中移动的速度与其带电量、分子的形状及大小有关，所以，可用电泳法将不同的蛋白质分离开来。血清中含有多种蛋白质，它们的等电点都在 pH 7.5 以下。将血清置于 pH 8.6 的缓冲液电泳时，所有的血清蛋白都带有负电荷，在电场中将向正极移动。由于各种血清蛋白在相同pH 时所带电荷数量不等，分子颗粒大小不一，因而泳动速度不同，经电泳被分离开来。血清蛋白质的等电点和分子量见下表。蛋白质名称 等电点（pI） 相对分子质量清蛋白 4.88 69 0001-球蛋白 5.00 200 0002-球蛋白 5.06 300 000-球蛋白 5.12 9 000150 000-
30、球蛋白 6.857.50 156 000300 000本实验以醋酸纤维素薄膜（简称 CAM）为支持物分离血清中的不同蛋白质。它是一种良好的呈均一泡沫状疏松薄膜，厚约 120m，具有一定的吸水性。实验材料、仪器及试剂1材料：健康人血清或鸡血清。2仪器：电泳仪、电泳槽。3试剂：（1）醋酸纤维素薄膜；（2）pH8.6 巴比妥缓冲液（离子强度 0.060.07）：取巴比妥 0.83 克，巴比妥钠 6.38 克，加蒸馏水加热溶解后，定容至 500ml。17（3）染色液：取氨基黑 10 B 0.5 克，溶于 50ml 甲醇中，再加冰醋酸 10ml，蒸馏水 40ml 混匀。（4）漂洗液：95%乙醇 4.5m
31、l，冰醋酸 5ml，蒸馏水 50ml 混合。（5）透明液：95%乙醇 80ml，冰醋酸 20ml 混合。实验方法1准备薄膜：将切割整齐的 2.56cm 的薄膜条，浸入巴比妥缓冲液中浸透后，取出，用吸水纸吸去多余缓冲液。2点样：仔细辩认薄膜的粗糙面与光滑面，在粗糙面距离薄膜一端 1.5cm 处，用铅笔轻轻划一条直线。用玻棒蘸上血清样品，涂于盖玻片边缘处（边缘长度应比膜条宽度窄），将此边缘按压在直线上。注意：样品应点在薄膜的粗糙面一侧。待血清完全渗入薄膜后，将膜面翻转，点样面（粗糙面）朝下，置电泳槽中，薄膜点样端放于负极一侧。3电泳：打开电源，调节电压 110130V ，电流 0.40.6m A/
32、cm 宽，电泳时间 4560 分钟，电泳完毕后，关闭电源。4染色漂洗：将薄膜从电泳槽中取出，直接浸入染色液中约 5 分钟，再转入漂洗液中反复浸洗 34 次，直至背景颜色脱净为止。此时，正常血清蛋白在薄膜上显示出五条区带。从前端至点样处的方向分别为清蛋白、 1-球蛋白、 2-球蛋白、-球蛋白及 -球蛋白。5定量测定：将膜条用滤纸压平吸干，按区带分段剪开，分别浸在体积 0.4mol/L 氢氧化钠溶液中，并剪取相同大小的无色带膜条作空白对照，进行比色。或者将干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡 23 分钟后，取出贴于洁净玻璃板上，干燥后，即为透明薄膜图谱，可用光密度计直接测定。注意事项1点样好坏是电泳
33、图谱是否清晰的关键，点样量要适当。2漂洗时应多漂洗几次，直至无蛋白区底色脱净为止。18实验十二 蛋白质的颜色反应实验目的及要求 掌握鉴定蛋白质的原理和方法。实验原理蛋白质分子中的某种或某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不同蛋白质所含氨基酸不完全相同，颜色反应亦不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白质物质亦可产生相同颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果来决定被测物是否是蛋白质。颜色反应是一些常用蛋白质定量测定的依据。双缩脲反应：将尿素加热，两分子尿素放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成红紫色的络合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键与缩脲结
34、构相似，故能呈此反应。黄色反应：蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等）。遇硝酸可硝化成黄色物质，此物质在碱性环境中变为黄色的硝苯衍生物。茚三酮反应：蛋白质与茚三酮共热，则产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及 -氨基酸所共有。含氨基酸的其他物质亦呈此反应。实验仪器及用品实验器材：鸡蛋白、吸管、滴管、试管、水浴锅、电炉。实验试剂：卵清蛋白、0.1%茚三酮、尿素、 10%NaOH、浓硝酸、 1%硫酸铜溶液。实验内容及步骤1. 双缩脲反应（1）取少许结晶尿素放在干燥试管中，微火加热，尿素熔化并形成双缩脲，释出的氨可用红色石蕊试纸试之。至试管内有白色固体出现，
35、停止加热，冷却。然后加 10%NaOH 溶液 1ml 摇匀，再加 2 滴 1%CuSO4 溶液，混匀，观察有无紫色出现。（2）另取一支试管，加蛋白质溶液 10 滴，再加 10%NaOH 溶液 10 滴及 1% CuSO4 溶液 2 滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。2. 黄色反应19于一试管内，加入蛋白质溶液 10 滴及浓硝酸 3-4 滴，加热，冷却后再加 10%NaOH 溶液 5 滴，观察颜色变化。3. 茚三酮反应取 1ml 蛋白质溶液置于烧杯中，加 2 滴茚三酮试剂，加热至沸，即有蓝紫色出现。实验注意事项1在双缩脲反应中，硫酸铜不能多加。2茚三酮反应需在 pH5-7 下进行。20实验十三 蛋
36、白质的沉淀反应实验目的及要求1. 熟悉蛋白质的沉淀反应。2. 进一步掌握蛋白质的相关性质。实验原理多数蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶解的盐后，即产生沉淀。蛋白质盐析作用：向蛋白质溶液中加入中性盐至一定浓度，蛋白质即沉淀析出，这种作用称为盐析。乙醇沉淀蛋白质：乙醇为脱水剂，能破坏蛋白质质点的水化层使其沉淀出来。重金属盐沉淀蛋白质：蛋白质与重金属离子结合成不溶性盐类而沉淀。实验仪器及用品实验器材：试管、吸管、吸滤瓶、布式漏斗。实验试剂：蛋白质试液、硫酸铵结晶体、饱和硫酸铵溶液、95%乙醇、结晶氯化钠、1% 醋酸铅、5% 鞣酸溶液、1%硫酸铜溶液、饱和苦味酸溶液、 1%醋
37、酸溶液。实验内容及步骤一、蛋白质盐析作用1. 取蛋白质溶液 5ml，加入等量饱和硫酸铵溶液，微微摇动试管，使溶液混合静置几分钟，球蛋白即析出。2. 将上述混合液过滤，滤液中加硫酸铵粉末，至不再溶解，析出的即为清蛋白。再加水稀释，观察是否溶解。二、乙醇沉淀蛋白质取蛋白质溶液 1ml，加晶体 NaCl 少许，待溶解后再加入 95%乙醇 2ml 混匀。观察有无沉淀析出。三、重金属盐沉淀蛋白质取试管 2 支，各加蛋白质 2ml，一管内滴加 1%醋酸铅溶液，另一管内滴加 1%CuSO4 溶液，至有沉淀生成。21四、生物碱试剂沉淀蛋白质取 2 支试管各加 2ml 蛋白质溶液及 1%醋酸溶液 4-5 滴，向
38、一管中加 5%鞣酸溶液数滴，另一管内加饱和苦味酸溶液数滴，观察结果。实验十四 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量实验目的及要求 了解 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法的原理，并学会用这种方法测定蛋白质的相对分子质量。实验原理聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开，是由于这些大分子化合物所带电荷的差异和分子大小不同之故，如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度，这些化合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量。SDS 是一种阴离子去污剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，其负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷，也就消除或降低了不同蛋白质之间原
39、有的电荷差别，这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，就可根据标准蛋白质的相对分子质量的对数对迁移率所作的标准曲线来求得未知蛋白质的相对分子质量。实验仪器及用品实验器材：直流稳压电泳仪、垂直平板电泳槽、移液器、微量注射器、烧杯、试管、滴管、直尺。实验试剂：凝胶贮备液、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、10%SDS、样品缓冲液、电极缓冲液、10%过硫酸铵、 1.5%琼脂、染色液、脱色液、待测分子质量的样品。实验内容及步骤1装配电泳槽。2分离胶的选择和配制。3分离胶的灌制。4浓缩胶的配制和灌注。5样品的制备：（1）标准蛋白质样品的制备。22（2）待测蛋白质样品的制备。6电泳。7染色与脱色。8相对分子
40、质量的计算。9数据记录和处理：以标准蛋白质相对分子量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线。根据待测蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其相对分子质量。实验十五 双缩脲法测定蛋白质浓度实验目的及要求 了解并掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和方法。实验原理具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与铜离子形成紫色配合物，在 540nm 处有最大吸收。在一定浓度的范围内，蛋白质和浓度与双缩脲反应所呈的颜色深浅成正比，可用比色法定量测定。实验仪器及用品实验器材：容量瓶、试管、吸管、722 型（或 7220 型）分光光度计。实验试剂：1、双缩脲试剂：0.175g CuSO 45
41、H2O 溶于约 15 ml 蒸馏水，置于 100 ml 容量瓶中，加入 30 ml浓氨水，30 ml 冰冷的蒸馏水和 20 ml 饱和 NaOH 溶液，摇匀，室温放置 2h，再加蒸馏水至刻度，摇匀备用。2、牛血清白蛋白（2 mg/ml）溶液3、未知浓度蛋白样品实验内容及步骤一、标准曲线的绘制将 6 只 10 ml 容量瓶编号，按下表加入试剂，即得 6 种不同浓度的蛋白质溶液。瓶号 牛血清白蛋白（2mg/ml）溶液/ml蒸馏水 蛋白质浓度/（mg/ml）1 1.0 稀释至刻度 0.22 2.0 稀释至刻度 0.43 3.0 稀释至刻度 0.64 4.0 稀释至刻度 0.85 5.0 稀释至刻度
42、1.06 6.0 稀释至刻度 1.223取干净试管 7 只，按 0、1、2、3、4、5、6 编号，1-6 号管分别加入上述不同浓度的蛋白质液3.0ml。0 号为对照管，加入 3.0ml 蒸馏水。各管加入双缩脲试剂 2.0ml，充分混匀，即有紫色出现，用 540nm 光测定各管吸光度，绘制浓度-吸光度曲线。二、样液的测定取未知浓度的蛋白质溶液 3.0ml 置试管内，加入双缩脲试剂 2.0ml，混匀，测其 540nm 吸光度。三、数据记录和处理根据标准溶液的吸光度，在坐标纸上绘制出浓度-吸光度曲线，测出未知液的吸光度后，在标准曲线上查出未知液的浓度。24实验十六 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度实验目的
43、及要求 学会用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。实验原理考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝 G250 的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在 465nm。当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为 595nm，考马斯亮蓝 G250-蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。在一定范围内，考马斯亮蓝 G250-蛋白质复合物呈色后，在 595nm 下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可用于蛋白质浓度的测定。实验仪器及用品实验器材：旋涡混合器、试管、吸管、722 型分光光度计、容量瓶、量筒、电子分析天平。实验试剂：（1）0.9%NaCl；（2）标准蛋
44、白液: 牛血清白蛋白（0.1 mg/ml）；（3）染液：考马斯亮蓝 G250（0.01%），称取 0.1g 考马斯亮蓝 G250 溶于 50ml95%乙醇中，再加入 100 ml 浓磷酸，加蒸馏水定容到 1000 ml；（ 4）样品液：取牛血清白蛋白（0.1 mg/ml ）溶液，用 0.9%NaCl 稀释至一定浓度。实验内容及步骤一、标准曲线的绘制 取 7 支干净试管，按下表进行编号并加入试剂。试剂 1 2 3 4 5 6 7标准蛋白液/ml 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.80.9%NaCl/ml 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.4 0.2考马斯亮蓝染液/ml 4
45、.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0蛋白质浓度/（ug/ml） 0 10 20 30 40 60 80A59525混匀，室温静置 3 min，以第一管为空白，于波长 595nm 处比色，读取吸光度。二、样液的测定 另取一干净试管，加入样品 1.0 ml 及考马斯亮蓝染液 4.0 ml，混匀，室温静置 3min，于波长595nm 处比色，读取吸光度。三、数据记录和处理根据标准溶液的吸光度，在坐标纸上绘制出浓度-吸光度曲线，测出未知液的吸光度后，在标准曲线上查出未知液的浓度。实验十七 紫外光吸收法测定蛋白质浓度实验目的及要求 1、了解紫外光吸收法测定蛋白质浓度的原理。2、熟悉紫外分
46、光光度计的使用。实验原理蛋白质组成中含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光 280nm 波长处有最大吸收峰，一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比，故可用紫外分光光度计通过比色来测定蛋白质浓度。 由于核酸在 280nm 波长处也有光吸收，对蛋白质测定有一定的干扰作用，但核酸的最大吸收峰在 260nm 处，如同时测定 260nm 的光吸收，通过计算可以消除其对蛋白质测定的影响。因此如溶液中存在核酸时必须同时测定 280nm 及 260nm 的吸光度，方可计算测得溶液中的蛋白质浓度。实验仪器及用品实验器材：UV-9100 型分光光度计、容量瓶、试管、吸管。实验试剂：卵清蛋白液、未知浓度蛋白质溶液、
47、0.9%氯化钠。实验内容及步骤一、直接测定法在紫外分光光度计上，将未知的蛋白质溶液小心盛于石英比色皿中，以生理盐水做对照，测得280nm 和 260nm 两种波长的吸光度，代入下式计算蛋白质浓度：C=1.45A280nm-0.74A260nm二、标准曲线法1、标准曲线的绘制取 8 支干净试管，编号，按下表加入试剂。0 1 2 3 4 5 6 71mg/ml 卵清蛋白液/mL0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0蒸馏水 4.0 305 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 026蛋白质浓度/（mg/ml）0 0.125 0.25 0.375 0.5 0.625 0.75 1
48、.0A280nm加毕，混匀，用紫外分光光度计测 A280nm，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标作图。2、未知样液的测定取未知浓度的蛋白液 1.0ml，加蒸馏水 3.0mL，测 A280nm，对照标准曲线求得蛋白质浓度。三、数据记录和处理1、直接测定法做三组平行实验，取算术平均值。2、标准曲线法用坐标纸绘制出标准曲线，根据未知液的吸光度从标准曲线中查出蛋白质浓度。27实验十八 血清谷丙转氨酶的测定实验目的及要求学会谷丙转氨酶(ALT)活力测定方法。实验原理丙氨酸+-酮戊二酸丙氨酸氨基转移酶+L-谷氨酸丙酮酸+2,4-二硝基苯胺丙酮酸 2,4-二硝基苯腙丙酮酸 2,4-二硝基苯腙在碱性溶液中呈现棕色，吸收峰为 520nm。实验步骤按下表顺序加入反应物：加入物（ml） 空白管 标准管 测定管样本 0.1丙酮酸钠标准液 0.1 丙酮酸氨基转移酶基质液0.5 0.5 0.537水浴保温 30min2,4-二硝基苯肼溶液 0.5 0.5 0.537水浴保温 20min碱性溶液 5.0 5.0 5.010min 后测 A520计算：ALT（U/L）=A 样 /A 标准 95 （U/L）28实验十九 过氧化物酶的作用实验目的了解过氧化物酶的作用。实验原理过
