1、1,第二十章高效液相色谱法high performance liquid chromatography;HPLC,分析化学教研室 李发美教授,2,经典液相色谱法为基础, 引入气相色谱法的理论和实验技术, 高压输送流动相, 高效固定相及高灵敏度检测器,现代液相色谱分析方法。,3,与经典液相色谱法相比,颗粒极细(一般为10m以下)、规则均匀的固定相,(键合相)传质阻抗小,柱效高,分离效率高; 高压输液泵输送流动相,流速快,分析速度快; 高灵敏度检测器,灵敏度大大提高。紫外检测器最小检测限可达109g,而荧光检测器最小检测限可达1012g。,4,与气相色谱法相比,不受试样的挥发性和热稳定性的限制,应
2、用范围广; 可选用各种溶剂作为流动相,对分离的选择性有很大作用,选择性高; 一般在室温条件下进行分离,不需要高柱温。,5,第一节 高效液相色谱法的主要类型和原理,一、主要类型四类基本类型色谱法 分配色谱法(partition chromatography) 吸附色谱法(adsorption chromatography) 离子交换色谱法(IEC) 空间排阻色谱法(SEC),6,第一节 高效液相色谱法的主要类型和原理,一、主要类型四类基本类型色谱法 分配色谱法(partition chromatography) 吸附色谱法(adsorption chromatography) 离子交换色谱法(I
3、EC) 空间排阻色谱法(SEC)化学键合相色谱法,7,其他色谱类型 亲合色谱法(affinity chromatography;AC) 手性色谱法(chiral chromatography;CC) 胶束色谱法(micellar chromatography;MC) 电色谱法(electrochromatography;EC),8,二、化学键合相色谱法,以化学键合相为固定相的色谱法,简称键合相色谱法(bonded phase chromatography;BPC) 化学键合相:采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所形成的固定相,9,优点: 固定相的均一性和稳定性好,在使用过程中不易流失,使
4、用周期长; 柱效高;重现性好; 能使用的流动相和键合相的种类多,分离的选择性高正相(normal phase,NP)和反相(reversed phase,RP)键合相色谱法: 根据化学键合相与流动相极性的相对强弱,10,(一)正相键合相色谱法,固定相:极性键合相 如氰基(CN)、氨基(NH2)或二羟基键合硅胶。(经典:水饱和的硅胶) 流动相:非极性或弱极性溶剂加极性调整剂 如烷烃加醇类。(与水不混溶的溶剂) 适用范围:溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物 如一些在硅胶柱上分离的物质,11,正相键合相色谱法,分离机制? 分配:把有机键合层作为一个液膜看待,溶质在两相的溶解 吸附:溶质与键合
5、极性基团间的诱导、氢键和定向作用 分离选择性: 极性强的组分k大,后洗脱出柱。 流动相的极性增强,洗脱能力增加,使组分k减小,tR 减小。,12,(二)反相键合相色谱法,固定相:非极性键合相 如十八烷基硅烷(C18,ODS)、辛烷基(C8)键合硅胶 流动相:水为基础溶剂,加入一定量与水混溶的极性调整剂 常用甲醇水、乙腈水等 应用:最广。非极性至中等极性的组分,(还有有机酸、碱及盐等),13,保留机制 疏溶剂理论(solvophobic theory),溶质的保留主要是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力,促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合。 不是溶质分子与键合相间的色散力,,14,反相键合相色
6、谱法,保留行为的主要影响因素 1、溶质的分子结构(极性) 极性越弱,疏水性越强,k越大,tR也越大。同系物碳数越多,极性越弱,k越大;引入极性取代基,降低疏水性,k值变小。 2、固定相 键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加,溶质的k也增大。 硅胶表面键合烷基的浓度越大,则溶质的k越大。,15,反相键合相色谱法,保留行为的主要影响因素 3、流动相 极性越强,洗脱能力越弱,使溶质的k越大 溶剂种类:水为弱溶剂,醇为强溶剂 溶剂比例:水的比例增加,使k增大 中性盐的加入:使中性溶质的k增大 pH:影响弱酸、弱减的离解流动相的pH降低,弱酸k增大,tR增大;弱碱k变小。,16,离子抑制色谱法(ion s
7、uppression chromatography;ISC )用少量弱酸、弱碱或缓冲溶液,调节流动相的pH,抑制有机弱酸、弱碱的离解,增加疏水缔合作用,使k变大。适用于3pKa7的弱酸、7pKa8的弱碱,反相键合相色谱法,17,把离子对试剂加入到含水流动相中,组分离子在流动相中与离子对试剂的反离子(counter ion)生成中性离子对,增加溶质与非极性固定相的作用,使k增加,改善分离效果。,(三)反相离子对色谱法 paired ion chromatography;PIC ion pair chromatography;IPC,18,反相离子对色谱法,离子对模型,3,3,+,+,(,),+,
8、3,s,3,(,+,固定相,+,(,),+,B,),+,流动相,通式,19,影响容量因子的因素,离子对试剂的种类和浓度:碳链长度增加,溶质的k增大;在一定范围内试剂的浓度升高,溶质的k增大 流动相的pH:有利于组分和离子对试剂离子化时(离子对的形成),组分的k值最大 固定相 、流动相性质(同一般RP-HPLC)。,20,适用范围:有机酸、碱、盐,离子型和非离子型化合物的混合物。 分析酸类或带负电荷物质:用季铵盐,如四丁基铵磷酸盐(TBA)和溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)等 分析碱类或带正电荷的物质:用烷基磺酸盐或硫酸盐,如正戊烷基磺酸钠(PICB5)、正己烷基磺酸钠(PICB6)、,适用范围
9、和离子对试剂的选择,21,第二节 高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择,固定相应符合下列要求: 颗粒细且均匀; 传质快; 机械强度高,能耐高压; 化学稳定性好,不与流动相发生化学反应。,22,一、化学键合相色谱法的固定相,(一)键合相的种类 非极性键合相 : 非极性烃基,如C18C8C1与苯基等键合在硅胶表面; 用于反相色谱; 长链烷基可使溶质的k增大,选择性改善,载样量提高,稳定性更好。,23,键合相的种类,弱极性键合相:醚基和二羟基等键合相 用于反相或正相色谱极性键合相: 常用氨基氰基键合相(氰乙硅烷基Si(CH2)2CN)键合硅胶 一般用于正相色谱 特殊用途的键合相,24,(二)键合相
10、的性质和特点,键合反应 硅氧烷(SiOSiC)型:氯硅烷与硅胶进行硅烷化反应,如:YWGC18H37,无定形硅胶YWG上键合了 十八硅烷基;Spherisorb ODS,球形硅胶 Spherisorb 上键合了ODS。,25,键合相的性质和特点,键合相的性质 含碳量:含碳的百分数 覆盖度 :已反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例 封尾(end-capping):在键合反应后,用三甲基氯硅烷等进行钝化处理,减少残余硅醇基。,26,键合相的特点 使用过程中不流失; 化学稳定性好; 适于梯度洗脱; 载样量大 注意: 流动相的pH一般应在3-8,否则会引起硅胶溶解;(也有适用宽pH范围的键合相)
11、。,键合相的性质和特点,27,二、化学键合相色谱法的流动相,对流动相的要求: 与固定相不发生化学反应。 对试样有适宜的溶解度。使k在110范围内, 与检测器相适应。例如用紫外检测器时,选用截止波长小于检测波长的溶剂。 纯度高,粘度小。低粘度流动相如甲醇乙腈等可以降低柱压,提高柱效。,28,(一)流动相对分离的影响n由色谱柱(固定相)性能决定, 主要受溶剂种类的影响, k受溶剂配比的影响。,29,(二)流动相的强度和选择性溶剂的极性(强度) 正相色谱:溶剂极性越强,洗脱能力越强 反相色谱:极性弱的溶剂洗脱能力强 溶剂的选择性 不同种类的溶剂,分子间的作用力不同,故选择性不同 混合溶剂(二元或多元
12、流动相),30,三、分离条件的选择,(一)HPLC中的速率理论涡流扩散 A=2dp 球形、小粒度、均匀(RSD5%)固定相,匀浆高压填充,以降低A。 纵向扩散 =2Dm 可以忽略。 因为Dl很小,室温操作,且U大于U最佳,,31,HPLC中的速率理论,传质阻抗 固定相传质阻抗CS可以忽略 ,因df极小 流动相传质阻抗Cm 要求: dp小,Dm大,32,静态流动相传质阻抗 : 由于部分流动相在固定相微孔内的滞留 静态流动相传质阻抗系数Csm Csm dp2, Csm 1/Dm,而DmT/ 要求: 固定相dp2、 流动相都小,HPLC中的速率理论,33,H=A+Cmu+Csmu 原因:化学键合相,
13、液体流动相 结果:HPLC的实验条件应该是:小粒度、均匀的球形化学键合相;低粘度流动相,流速不宜过快;柱温适当。,HPLC中的速率理论,34,(二)正相键合相色谱法的分离条件,固定相 极性键合相 如氰基、氨基键合相等流动相 烷烃加适量极性调节剂,35,(三)反相键合相色谱法的分离条件,固定相 非极性键合相如ODS 流动相 以水为基础溶剂,加入甲醇、乙腈等极性调节剂 弱酸、弱碱或缓冲盐作为离子抑制剂 加入0.1%1%的醋酸盐、磷酸盐可减少残余硅醇基的作用,36,(四)反相离子对色谱法的分离条件,固定相 尽可能选择表面覆盖度高且疏水性强的非极性键合相, 离子对试剂 离子对试剂所带的电荷应与试样离子
14、的电荷相反 流动相pH 使试样组分与离子对试剂全部离子化 有机溶剂及其浓度 同一般HPLC,37,第三节 高效液相色谱仪,组成 输液系统 进样系统 色谱柱系统 检测系统 数据记录处理系统,38,一、输液系统,高压输液泵 恒流泵:在输送流动相过程中流量恒定。常用柱塞往复泵 双泵:为了克服流量的脉动。 有串联式和并联式,39,40,输液系统,输液泵应具备的性能: 流量精度高且稳定 流量范围宽 能在高压下连续工作 液缸容积小 密封性能好,耐腐蚀,41,输液系统,输液泵操作注意事项: 防止固体微粒进入泵体 流动相不应含有腐蚀性物质 防止溶剂瓶内的流动相被用完 不超过规定的最高压力 流动相一般应该先脱气
15、,42,二、分离和进样系统,进样器 进样阀(六通阀)、自动进样装置 色谱柱(column) 由柱管和固定相组成 分析柱、制备柱 性能评价 H、n、fs、k和的重复性,或R。,43,44,三、检测系统,(一)检测器(detector)的主要性能 要求: 灵敏度(sensitivity)高(检测限低) 噪音(noise)低 线性范围(linear range)宽 重复性(repeatability)好 适用范围广(通用型、专属型),45,(二)紫外检测器(ultraviolet detector),检测原理: 朗伯比尔 (Lambert-Beer) 定律,响应信号(吸光度)与浓度成正比A=Cl 特
16、点: 灵敏度较高(10-610-9 g/ml),噪音低,线性范围宽,稳定性好,适于梯度,不破坏样品,应用广(分析、制备)。 局限: 只能检测有紫外吸收的物质,流动相的截止波长应小于检测波长。 专属型、浓度型检测器,46,紫外检测器,固定波长检测器 :254nm 可变波长检测器: 光源:氘灯(和钨灯), 200400(800)nm,单色器,流通池(试样),光电管 光路系统和紫外分光光度计相似 光电二极管阵列检测器 (photodiode array detector; PDAD): 一系列光电二极管,一个二极管对应接受光谱上约1nm谱带宽的单色光,47,48,紫外检测器,光电二极管阵列检测器 工
17、作原理:复光通过流通池,再进入单色器,分光后照射在二极管阵列装置上,同时获得各波长的信号强度,即获得组分的吸收光谱。获得三维光谱色谱图。 用途:吸收光谱用于组分的定性,色谱峰面积用于定量,判断峰纯度。,49,50,紫外检测器,51,(三)荧光检测器 (fluorescence detector;FD),检测原理: 化合物受紫外光激发后,发射出比激发光波长更长的光,称为荧光; 荧光强度 (F) 与激发光强度 (I0) 及荧光物质浓度 (C) 之间的关系为:F=2.3QKI0Cl Q为量子产率,K为荧光效率,为摩尔吸光系数,l为光径长度。F=KC,52,荧光检测器(fluorescence detector;FD),特点: 选择性好,专属型检测器 灵敏度比紫外检测器高(检测限10-10 g/ml)激发波长(ex)和发射波长(em)的选择,53,第四节 高效液相色谱分析方法,定性分析方法 定量分析方法: 外标法、内标法同GC(自己看),54,主要内容,化学键合相色谱法的原理: 反相键合相色谱法 反相离子对色谱法 正相键合相色谱法 化学键合相色谱法的固定相、流动相 化学键合相色谱法的分离条件 高效液相色谱中的速率理论 定量分析方法 紫外、荧光检测器,