1、1、空气中微生物的检测方法-细菌总数（营养琼脂，121高压灭菌 20min，培养时间 37,48h）1.两种方法（1）撞击法(二级或者六级微生物采样器)（2）自然沉降法（暴露 5min）采样：梅花布点，高度：1.21.5m；离墙：1m。2、茶具微生物检验方法（一）细菌总数1、生理盐水的制法：将氯化钠（8.5g）溶解于蒸馏水（1000mL）中，分装到试管内，每管 10mL，121高压灭菌 20min。2、采样：棉拭子湿润生理盐水，在茶具内、外缘涂抹 50cm2，即口唇接触处一圈（11.5cm） ，用灭菌剪刀剪去棉签手接触处，将棉拭子放入 10mL 生理盐水中，4h 内送检。3、检验程序：检样各
2、1mL 加入两块灭菌平皿（若污染严重，可十倍递增稀释）37 ，48h 培养菌落计数 报告4、单位：cfu/cm 2。（2）大肠菌群1、培养基：乳糖胆盐发酵培养液（双料的，每管 10mL，115 高压灭菌15min）2、检测方法：发酵法（具体内容课本 11 页）3、检样（测定细菌总数余下的样品）4、革兰氏染色过程：（阳性菌显紫色，阴性菌显红色）（1）初染： 1min，水洗；（2）碘染： 1min，水洗；（3）脱色： 30s，水洗；（4）复染： 1min，水洗，待干，镜检。5、结果报告：凡乳糖发酵管最终产酸产气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告检出大肠菌群。三、毛巾、床上卧具微生物检测方法（
3、一）细菌总数1.采样（1）毛巾、枕巾： 对折后两面的中央各 25cm2；（2）床单、被单： 在上下两部中央 25cm2 来回涂抹 ；2、检测程序同茶具细菌总数检测3.计算单位：cfu/25cm 2。(二)大肠菌群（检测程序同茶具大肠菌群检测）1.涂抹法：（用测定细菌总数时采集的样品）四、理发用具微生物检验方法（一）大肠菌群1、采样推子：在推子前部上下部分均匀各涂抹三次；理发刀、剪和修脚工具：在使用的刀、剪面的两侧各涂抹一次采样；两个刀或者两个剪为一份样品。2、检样 5mL 倒入双料乳糖胆盐发酵管，37，24h 培养；3、分离培养：接种伊红美蓝平板，做革兰氏染色镜检；4、证实试验：接种乳糖发酵管
4、 37，24h 培养，观察产气情况。5、结果报告：乳糖管最终产酸产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，可报告为大肠菌群阳性。（2）金黄色葡萄球菌1、培养基： 7.5%的氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤培养基2、步骤：（1）做大肠菌群剩余的 5mL 倒入培养基中，37，24h 培养；（2）接种血平板， 37，24h 培养；观察形状： 圆形、金黄色、凸起、表面光滑、周围有溶血圈；（3）挑菌落做镜检： 革兰氏阳性（红色） ，葡萄状排列；（4）甘露醇发酵试验：接种到甘露醇发酵培养基中，37，24h 培养，观察是否产酸；（5）血浆凝固酶试验玻片法：在干净的玻片两边，一端滴一滴生理盐水，一端滴一滴血浆，接种环挑菌
5、落分别与它们混合。5min 后均无凝固现象的为阴性；若血浆中出现颗粒状凝块而生理盐水中没有，则为阳性。5、拖鞋微生物检验方法霉菌与酵母菌（生理盐水中要加入玻璃珠）1.培养基：霉菌培养基、 （虎红）孟加拉红培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）2.取样：有棉拭子在每只拖鞋鞋面与脚趾接触处的 5cm5cm 面积上均匀涂抹3 次，一双拖鞋为一份样品；3.将盛有棉拭子的试管在手心用力振荡 100 次，使霉菌孢子分开；4.培养：在霉菌培养箱中 2528，培养观察一周。5.单位是 cfu/50cm2。6、浴盆、脸（脚）盆微生物检测（1）细菌总数无菌生理盐水：分装 125mL/瓶供浴盆采样；50mL 供脸
6、（脚）盆采样。采样部位：在盆内侧二分之一到三分之一高度；布点：浴盆梅花布点；脸（脚）盆相对两侧壁布点；方法：涂抹法（与茶具方法一致）单位：cfu/25cm 2。（2）大肠菌群 (同茶具)七、游泳池水微生物检测（1） 、细菌总数1.采样瓶：无酸、无碱、无毒的玻璃容器。2.灭菌前要加入足量的 10%的硫代硫酸钠溶液，一般 125mL 水样加 0.1mL。3.采样游泳池 面积， 儿童 成人池 天然游泳池池 1000 1000 2500 2500采样点数 12 2 3 5 5水注：在水面下30cm 处取水样450mL4.操作步骤（与茶具细菌总数一样）（2）大肠菌群1.培养基：三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液（
7、蒸馏水量不变，其他成分三倍）2.步骤（1）推测性试验2 个装有 50mL 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的大试管内（装有小试管）各 加入 100mL 的水样；在 10 支装有 5mL 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管里（装有小试管）加入 10mL 水样。摇匀，培养。（2）平板分离接种伊红美蓝，培养、观察；典型菌落形态：黑紫色或红紫色，具有金属光泽。（3）复发酵试验进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，培养，观察。（4）查表： 1000mL 水样中大肠菌群的 MPN 值。8、生活饮用水微生物检验方法（1）采样1.采样容器应采用洁净、无色、无毒的聚乙烯塑料和硬质玻璃（又称硼硅玻璃） 。样品瓶必须专瓶专用，切
8、不可用实验室盛装过浓溶液的瓶作采样瓶。通常我们使用 500ml 的高压灭菌的细口瓶采样。2.容器及瓶塞、瓶盖应能经受灭菌的温度。3.检验中所用的一切用品必须是完全灭菌的。在灭菌前应彻底洗涤干净，121高压蒸汽灭菌 20min，或 160干烤 2h。4.冷藏，4h 内检测。如有游离余氯应在采样瓶消毒前每 125ml 加 0.1ml 硫代硫酸钠溶液。（2）细菌总数（操作步骤同茶具，记得做空白对照）（3）总大肠菌群1.乳糖发酵试验（1）10mL 水样加入 10mL 双料乳糖发酵管中；1mL 水样加入 10mL 单料乳糖发酵管中； 0.1mL 水样加到 10mL 单料乳糖发酵管中；每一稀释度接种 5
9、管。（2）37培养 24 小时，观察产酸产气现象2.分离培养（接种伊红美蓝，培养）3.证实实验（革兰氏染色，镜检，接种乳糖发酵管）4.结果报考：查表。（4）耐热大肠菌群1.培养基：EC 培养基2.操作步骤：同大肠菌群多管发酵法。3.培养温度：44.5 培养 24h。（5）大肠埃希氏菌1.培养基：EC-MUG 培养基（培养基加热溶解后要先在 366nm 紫光下检查有无荧光）2.培养温度：44.5 培养 24h。3.观察：在暗处用 366nm 的紫外灯照射，是否有蓝色荧光产生；4.计算阳性管数，查表得出最可能数，结果以 MPN/100mL 报告。9、公共场所集中空调系统（1）冷凝水、冷却水中嗜肺军
10、团菌（1）采样1.采样容器：可选择玻璃瓶或聚乙烯瓶，广口瓶，用前灭菌。 2.采样量：每个采样点依无菌操作取水样（或沉积物、软泥等样品）约500ml。3.中和：经氯或臭氧等消毒的样品，采样容器灭菌前加硫代硫酸钠溶液中和。4.样品运输与贮存：样品最好 2 天内送达实验室，不必冷冻，但要避光和防止受热，室温下贮存不得超过 15 天。（2）热处理：取 1ml 洗脱样品置 50水浴加热 30min。酸处理：取 5ml 洗脱样品，调 pH 至 2.2，轻轻摇匀，放置 5min。（3）接种平板静置于浓度为 2.5%的 CO2 培养箱中，3537，观察到有培养物生成时，反转平板，孵育 10d，注意保湿。（4）
11、观察军团菌生长缓慢，易被其它菌掩盖，需每天在体式镜上观察。军团菌的菌落颜色多样，通常呈白色、灰色、蓝色或紫色，也能显深褐色、灰绿色、深红色；菌落整齐，表面光滑，呈典型毛玻璃状，在紫外灯下，部分有荧光。（2）送风中细菌总数以无菌操作，使用六级筛孔空气撞击式采样器，以空气流量为 28.3L/min，在采样点采集 515min。将采集细菌后的营养琼脂平皿置 3537培养 48 h，计数菌落数。（3）送风中真菌总数采样方法同上将采集真菌后的沙氏琼脂培养基平皿置 28培养 57 d，逐日观察并于第 7 d 记录结果。若真菌数量过多可于第 5d 计数结果，并记录培养时间，换算成 cfu/m3。（4）送风中 -溶血性链球菌在血琼脂平板上形成灰白色，表面凸起，直径 0.5mm0.7mm 的细小菌落，菌落透明或半透明，表面光滑有乳光，菌落周边有溶血环；镜检为革兰氏阳性无芽孢杆菌，圆形或卵圆形，呈链状排列。（5）风管内表面微生物检验采样面积：每一点采样面积应为 50cm2。采样方法：刮拭法、擦拭法细菌和真菌培养与计数方法同上
