1、第四讲 PCR技术简介,PCR技术简介-定义,PCR: polymerase chain reaction聚合酶链式反应简单的讲， PCR技术即通过引物延伸核酸的某个区域而进行的重复双向DNA合成。,PCR技术是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，亦称为无细胞分子克隆技术。它是以待扩增的两条DNA链为模板，在一对人工合成的寡核苷酸引物的介导下，通过耐高温DNA聚合酶的酶促作用，快速特异地扩增出特定的DNA片断。,PCR技术简介-目的,用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片断。由于PCR技术具有简单、快速、特异和灵敏的特点，所以自1985年Mullis发明PCR技术和1988年Erli
2、ch发现耐高温的DNA聚合酶以来，该技术以惊人的速度广泛应用于生命科学的各个领域，特别是在细胞学、病毒学、肿瘤学、遗传病学、法医学、动植物免疫学等方面取得了巨大的成绩，成为当代分子生物学发展史上的一个里程碑。,PCR技术简介-原理,设计两段寡核苷酸引物，这两段寡核苷酸引物序列互不相同，并分别与模板DNA两条链上的各一段序列互补，而这两段模板序列由分别位于待扩增DNA区段的两侧。,反应时，首先在摩尔数大大过量的两段引物及四种dNTP参与下对模板DNA进行加热变性；随之，将反应混合液冷却到某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列退火；此后退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。如此反复进行变性、退火和
3、DNA合成这一循环。,PCR技术简介-原理,由于一轮扩增的产物又充当下一轮扩增的模板，所以在这一周而复始的过程中每完成一个循环，就基本上使目的DNA产物增加一倍。这一指数反应的主产物是一段双链DNA，它的两个末端由寡核苷酸引物的5端来决定，而长度则取决于两引物间的距离。,PCR技术简介-原理,PCR反应所用酶：,早期的PCR方法采用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片断催化退火的寡核苷酸引物进行延伸反应。由于该酶会在进行DNA变性的温度下失活，所以在每一轮合成反应中都须重新加1份酶。并且在扩增较长模板是效果不够理想，产率较低，有一些错配，导致产物大小不均一。,PCR反应所用酶：,耐热DNA聚
4、合酶是从一种嗜热细菌嗜热水生菌种提纯出来的，经95持续温育仍有活性，不会在加热变性中失活，故无需每轮反应都重新加酶，又由于寡核苷酸引物的退火和变性可以在更高温度下进行，使引物和模板间的误配大大减少，提高了扩增反应的特异性和产率，并且可以扩增更长的产物。,现用的TaKaRa Taq,TaKaRa Taq是一种94 kDa的高纯度耐热性DNA聚合酶，是把Thermus aquaticus YT-1株的DNA polymerase基因在大肠杆菌中表达后，分离提取得到的，与野生型DNA polymerase具有相同的功能。,Taq DNA聚合酶的局限性：,1. 可信度 (Fidelity) 通常Taq
5、 DNA Polymerase的Fidelity并不高, PCR反应有时会出现错配 (Misincorpora-tion) 现象，因而PCR克隆、变异导入等实验中，需加以注意。,2. 扩增的DNA长度 使用Taq DNA Polymerase进行PCR扩增时，通常可扩增几kbp的DNA，超过10kbp则比较困难。,3. 扩增量 使用Taq DNA Polymerase进行PCR产物克隆及食品、环境卫生检验等时，扩增量常常达不到要求。,反应体系:,按照以下次序，将各充分在灭菌离心管中混合， 灭菌水 ? l MgCl2溶液 (25mmol/L) 1.5-2-2.5l (1.5-2.0-2.5mmo
6、l/L) 10扩增缓冲液 2.5l 4种dNTP混合物（2.5mmol/L） 2.0l 20mmol 正向引物（25 pmol/ul，超纯水配制） 1.0l 100pmol 反向引物（25pmol/ul，超纯水配制） 1.0l 100pmol DNA Taq聚合酶 0.2l 2.5U 模板DNA 1.0l 1g 总体积 25 l,PCR典型的反应条件,循环 变性 退火 聚合 首轮循环 94 955分钟 502分钟 722分钟后续循环 94951分钟 502分钟 722分钟末轮循环 94951分钟 502分钟 7210分钟,引物设计原则：,1.长度以1530个碱基为宜。2.正向反向两条引物链之间
7、的距离适中，一般使扩增出的片断在300-1100bp之间。如果使用RT-PCR检测RNA病毒，引物间距离以500bp最佳。片断过短影响结果判定，过长则不易扩增。3.引物碱基组成应随机分布，G+C含量在45-55为宜。,引物设计原则：,4.引物自身不形成二级结构，引物间没有互补序列（4个碱基以上）。 5.引物序列必须是被检病原微生物特异的。 6.引物3端碱基与模板DNA一定要配对，并且3末端碱基最好选T、 C或者G，不选A。,引物含量计算：,1OD260 单位DNA：是指在1ml体积1cm光程标准比色皿中，260nm波长下吸光度为1A260DNA溶液，据此计算，1OD260单位相当于33ug的D
8、NA。,DNA分子量计算： MW=(A碱基数312)+(C碱基数288)+(G碱基数328)+(T碱基数303) DNA近似分子量计算：MW=总碱基数324.5(DNA中每个脱氧核苷酸碱基的平均分子量近似为324.5).,举例：,若你得到1管5 OD260的引物DNA,引物长度为20个碱基，则MW=20324.5=6490质量数=533=165ug摩尔=165/6490=0.025umol=25nmol若要稀释到25pmol/ul,即25nmol/ml,则需要加1ml的双蒸灭菌水稀释。,设计程序中用到的温度,变性温度: 94C or 95C ,不变； 延伸温度: 72C，不变； 退火温度: 5
9、0C左右，可变，且可能变动很大。,退火温度（Tm）计算,Tm4(G+C)+2(A+T)G,C,A,T均为单一引物与模板对之间的个数。,PCR常见问题：,一.出现假阴性； 二.出现假阳性； 三.出现非特异性扩增带； 四.出现片状拖带或涂抹带。,一.PCR出现假阴性原因：,1模板因素：2酶失活：3引物：4Mg2+浓度：5反应体积的改变：6物理原因：7靶序列变异：,PCR出现假阴性原因分析及解决方案,模板因素： （1）模板中含有杂蛋白； （2）模板中含有Taq酶抑制剂； （3）模板中蛋白质残留，特别是染色体中的组蛋 白残留； （4）提取制备模板时丢失过多； （5）模板核酸变性不彻底。,PCR出现假阴
10、性原因分析及解决方案,模板因素引起假阴性解决方案： 1.配制有效而稳定的消化处理液； 2.提取程序固定,不宜随意改动； 3.模板DNA的溶解液应固定不变。,PCR出现假阴性原因分析及解决方案,酶失活： 1.酶本身的质量问题(供应商的问题）； 2.酶存放时间太长； 3.酶存放方式不当，或其他意外原因； 4.忘记添加Taq酶。,PCR出现假阴性原因分析及解决方案,酶失活引起假阴性解决方案： 1.检查加样程序及过程，看是否忘记加Taq酶； 2.更换新的Taq酶; 3.新旧两种Taq酶同时使用。,PCR出现假阴性原因分析及解决方案,引物： 1.引物质量； 2.引物浓度； 3.两条引物的浓度是否对称等。
11、,PCR出现假阴性原因分析及解决方案,引物引起假阴性解决方案: 1.选定一个好的引物合成单位; 2.引物浓度不仅要看OD值，稀释时更要平衡其摩尔浓度； 3.引物应高浓度小量分装保存，防止反复冻融或长期冷冻保存，导致引物的变质降解失效，也可要求合成单位将固体分装； 4.引物设计不合理，如长度不够，引物本身或两条引物之间形成二聚体等。,PCR出现假阴性原因分析及解决方案,Mg2+浓度：Mg2+浓度对PCR扩增效率影响极大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性；浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败，出现假阴性。,PCR出现假阴性原因分析及解决方案,Mg2+浓度引起假阴性解决方案：设置一组反应
12、，其中每一反应中的其他离子浓度相同（如Tris.Cl,KCl等），而MgCl2浓度不同（由0.56mmol/L,每次增加0.5mmol/L)，由此来摸索最佳Mg2+浓度。,PCR出现假阴性原因分析及解决方案,反应体积的改变：做小体积PCR后，再做大体积时，一定要重新摸索条件，而非简单地将反应体系中的各个成分加大几倍，否则易失败。,PCR出现假阴性原因分析及解决方案,物理原因： 1.变性温度低，变性时间短； 2.退火温度过高，影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率； 3.延伸时间过短等。,PCR出现假阴性原因分析及解决方案,物理原因引起假阴性解决方案：1.提高变性温度，延长变性时间，特别是首次
13、循环，必要时可设为95 ，10min，或PCR反应以前在开水中煮沸几分钟。,PCR出现假阴性原因分析及解决方案,物理原因引起假阴性解决方案： 2.退火温度应根据Tm值来设定，也可首先将退火温度设为45 ，然后再逐次提高（以2 /次为宜）。 3.延伸温度以1000bp/min足够，必要时也可适当延长，特别是末次循环，一定要延伸10min。,PCR出现假阴性原因分析及解决方案,靶序列变异：靶序列变异导致假阴性的情况常常发生在靶序列变异正好发生于特异性引物与之结合部的中间，使引物失效。 解决方案：根据已知序列重新选择区段设计引物。,二.PCR出现假阳性原因：,1.引物设计不合适；2.靶序列或扩增产物
14、的交叉污染。（1）整个基因组或大片段的污染；（2）空气中的小片断核酸污染。,PCR出现假阳性原因分析及解决方案,引物设计不合适： 1.选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，从而扩增出非目的性序列的PCR产物。 2.靶序列太短或引物太短导致特异性不强。 解决方案：选择特异性强的区段设计引物。,PCR出现假阳性原因分析及解决方案,整个基因组或大片段的污染的解决方案： 1.操作时小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管污染环境。 2.除酶及不耐热物品外，所有试剂及耗材均应高温高压消毒，所用离心管及枪头均应一次性使用。 3.必要时，加样本前，反应管及试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。,PCR
15、出现假阳性原因分析及解决方案,空气中的小片断核酸污染：这些小片断比靶序列短，但有一定同源性，可互相拼接，与引物互补后，扩增出PCR产物，导致假阳性出现。 解决方案：运用巢式PCR（Nest PCR）来减轻或消除。,三.出现非特异扩增带原因：,1.引物与靶序列不完全互补，或引物聚合形成二聚体； 2.Mg2+浓度过高，退火温度过低，PCR循环次数过多； 3.酶的质量不过关，或加Taq酶的量过多。,PCR出现非特异扩增带解决方案,1.必要时重新设计合成引物； 2.减低酶量或调换另一来源的酶； 3.降低引物量，适当增加模板量，减小循环次数； 4.适当提高退火温度或采用二温度点法（94 变性，65 左右
16、退火与延伸）。,1.酶量过多或酶的质量差；2.dNTP浓度过高；3. Mg2+浓度过高，退火温度过低；4.循环次数过多。,PCR出现片状拖带或涂抹带原因：,PCR出现片状拖带或涂抹带解决方案,1.减少酶量或调换另一来源的酶；2.减少dNTP浓度；3.适当降低Mg2+浓度；4.增加模板量，减少循环次数。,LA PCR技术,LA PCR (Long and Accurate PCR) 技术，运用此技术可大量正确地扩增长达40 kbp 的DNA片段。LA PCR技术扩展了PCR的应用范围, 可在Genome解析、基因诊断、长片段DNA的克隆及变异导入等方面发挥优势。,LA PCR技术原理,LA PC
17、R的关键是具有35 Exonuclease活性 (Proof reading活性) 的耐热性DNA聚合酶。在PCR过程中当有错误的碱基摄入时，反应性能将大幅度下降，TaKaRa Ex Taq 和TaKaRa LA Taq 依靠35 Exonuclease活性可将错配的碱基除去，从而延伸反应能顺利地进行下去,使长链DNA的扩增成为可能。,Hot Start PCR法,Hot Start PCR法是提高PCR特异性的最重要方法之一。这种方法可以防止在PCR反应第一步骤因引物的错配或引物二聚体的形成而导致的非特异性扩增，从而可以提高目的DNA片段的扩增效率。,TaKaRa Taq Hot Start
18、 Version，TaKaRa Ex Taq Hot Start Version是抗Taq抗体和DNA聚合酶的混合制品。抗Taq抗体在高温加热前与聚合酶相结合，抑制聚合酶的活性。在PCR反应最初的DNA变性步骤，抗Taq抗体变性，聚合酶活性恢复。,PCR技术的应用,研究领域： 基因克隆；DNA测序；分析突变； 基因重组与融合；检测基因的修饰； 鉴定与调控蛋白质结构的DNA序列； 转座子插入位点的绘图；合成基因的构建；构建克隆或表达载体； 检测某基因的内切酶多态性等。,PCR技术的应用,临床诊断： 细菌；病毒；螺旋体；支原体；衣原体；立克次氏体；分枝杆菌等病原体的鉴定； 人类遗传病的鉴定；,PCR技术的应用,一. 诊断遗传疾患。 二. 监测临床标本中病原体的核酸序列。 三. 对法医学标本做遗传学鉴定。 四. 分析激活癌基因中的突变情况。 五. 生成克隆化双链DNA中的特异序列作为探针。,PCR技术的应用,六. 通过选择性扩增特定DNA区段，生成某 些未克隆化基因的特异性探针。 七. 由小量mRNA构建cDNA文库。 八. 生成大量DNA以进行序列测定。 九. 基因突变分析。 十. 染色体缓移。,
