1、原位PCR技术,原位PCR技术是一项极为敏感的原位显示、检测生命话性物质DNA或mRNA的示踪染色方法，它是核酸扩增与原位核酸杂交相结合的产物。特点是特异、灵敏、原位，检测阈值低，能达pg和fg水平，甚至可检出单拷贝的核酸序列。,此项技术的基础是原位杂交技术（第八章）和液相PCR技术，前者是指应用标记的探针检测细胞内RNA、DNA的原位示踪染色技术，它比PCR技术更早应用于石蜡切片、冰冻切片、细胞等内源性或外源性DNA、RNA的检测。,原位杂交技术的优点是组织形态保存好，特异性较高，成本低，不需特殊仪器。缺点是敏感性较低，但可通过改变检测手段的敏感性，或经原位核酸扩增后再行标记探针检测（间接原
2、位PCR法）来提高检测效率。,近年来，随着现代工业和分子生物学技术的飞速进步，核酸水平的原位检测方法也同样得到了长足发展，新技术、新方法层出不穷，除原位杂交和原位PCR外，又出现诸如：荧光原位杂交（FISH）；寡核苷酸引物原位DNA合成技术（PRIN）和比较基因组杂交技术（CGH）第九章；,组织和细胞芯片技术（又叫微阵列技术（microarray technology）第十一章；等等。限于时间，本次课只讨论第十章“ 原位PCR”技术，因为它多用，又与其它新方法有关联。其它章节内容，仅供同学们选用时参考。,根据实验设计，原位PCR可分为直接法、间接法、原位反转录、原位再生或序列复制反应等类型。,
3、第一节 原位PCR技术操作,载盖玻片的清洁和组织切片的预处理，包括防脱片、蛋白酶消化等，基本上与原位杂交法类同。,一、待测切片的准备和预处理,配制0.05%/0.01 mol/L Tris-Hcl，pH8.0多聚赖氨酸，每10ml 0.05%多聚赖氨酸中加入1l TritonX-100,可保存于4，出现浑浊则不能使用。,（一）清洁玻片并进行防脱片处理,清洁的玻片置上述液体中20min，室温，然后60 1h，玻片于室温中可保存1个月备用。,处理的玻片上加12滴aqueous胶，组织敷贴其上，45加热，再将切片烤干60 90min，冷却20，24h，室温保存。,（二）组织切片410m,最后以0.1
4、mol/L Tris-Hcl,pH7.4洗5min。,（三）石蜡切片脱蜡至水,溶解蛋白酶K于0.1mol/L Tris-Hcl, pH8.0/10mmol/L EDTA（蛋白酶K浓度：组织片为10g/ml，细胞片为20g/ml），消化时间依蛋白酶浓度，不同组织而异，一般为20min。消化结束后95，2min灭活蛋白酶，0.1mol/L Tris-Hcl, pH7.4洗。,（四）蛋白酶消化,二、原位PCR技术类型及其操作原理 （一）直接原位PCR 图10-1 （二）间接原位PCR 和 （三）原位RT-PCR 图示,图10-1 直接法原位PCR示意图,原位RT-PCR为结合反转录反应和PCR扩增检
5、测细胞内低拷贝mRNA的方法，首先以RNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA，再以合成的cDNA为模板进行PCR扩增。,原位RT-PCR反应过程在固定的组织细胞标本上进行，进行原位RT-PCR的标本先要用DNA酶处理，以破坏组织细胞中的DNA，保证PCR扩增的模板是从mRNA反转录合成的cDNA而不是细胞中原有的DNA。如果PCR扩增的引物与细胞本身的基因DNA相距甚远，可不必用DNA酶处理。,1991年Cetus公司推出了一种新酶，rTth逆转录酶，其特点是具有很强的分别依赖RNA和DNA的耐热DNA聚合酶活性，利用rTth酶，可使原位RT-PCR上述的两个步骤，用一种酶，一个条件下完成
6、，简化了步骤，缩短了时间。,（四）原位再生或序列复制反应（3SR） 用于检测组织细胞原位扩增RNA的一项新技术，其不同于原位RT-PCR的重要特点是：扩增反应液成分有差异。内含有,3SR酶液，即AMV逆转录酶、大肠杆菌RNA酶H和T7RNA聚合酶，加入的引物5端带有T7RNA聚合酶启动子序列；扩增反应在低温（42c）下进行，不需热循环；一步到位，扩增反应后，杂交显示观察。,上述各种方法类型的检测显示系统，可以是同位素（32P、35S等）通过放射自显影加以显示；也可以是非同位素（如生物素、地高辛等）通过免疫组化染色加以显示。 图10-3，图10-4,图10-3 卵白素-生物素检测系统,图10-4
7、 地高辛精系统检测原位杂交示意图, 100l 1Taq缓冲液加入玻片，加盖玻片后，95，5min变性。,四、原位PCR的具体操作流程 （一）直接法原位PCR扩增, 准备扩增混合液（以每片30l量） 1Taq缓冲液 终浓度200mol/L dUTP（含生物素或Dig标记dATP） 100pmol/L引物 5u Taq酶 去离子水至总量30l, 每片30l扩增混合液，加盖玻片，指甲油封边后进入PCR循环，PCR反应参数依引物和扩增片段而设定，一般控制在2025个循环。, PCR产物检测 取盖玻片，0.1mol/L Tris-Hcl pH7.4，洗 5min2； 冰乙醇10min，80乙醇10min
8、，洗 5min2； 100l碱性磷酸酶卵白素或抗Dig-卵白素， 37，30min； 4 淋洗5min2，根据标记物不同而特异性 底物显色； 终止反应，封片观察。, 原位PCR扩增同直接法，但dNTP不需标记； PCR扩增后进行原位杂交,（二）间接法原位PCR扩增,2SSC杂交液配制Dig-标记特异性探针，探针浓度5ng/每片，20l/每片，用前探针95变性10min； 滴加探针，95 5min，42温盒中杂交过夜； 取掉盖玻片，4SSC洗，室温2min；, 2SSC、0.5SSC、0.1SSC，42洗各10min2； 加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体复合物，37，2h； 碱性磷酸酶(NBT/B
9、CIP)暗处显色； 终止反应，封片观察。,（三）原位RT-PCR扩增 样本制备，蛋白酶消化均同直接法； DNA酶处理（780u/ml浓度的不含RNA酶的DNA酶）可过夜。 反转录反应,表10-1 反转录和PCR反应液配方*,*用于约3cm2的组织切片,以RNA为模板，通过反转录合成cDNA。将逆转录反应液20l（含AMV逆转录反应酶和正义上游，反义下游引物）加在组织切片上，覆以新鲜的蜡膜，并用弹力盖片封剂（Ohcor，Gathersburg，MI）将蜡膜封好，42c孵育60min。,孵育过程可在普通的PCR热循环仪上进行。在循环仪的加热台上铺上一层，将玻片置于上，热循环，加一塑料盖，使之密封。
10、反转录结束后，PBS洗60min。, PCR扩增，热启动法进行扩增反应。 原位杂交进行检测。,（四）原位再生或序列复制(RNA)反应 制备待测样本； 合成引物，5端应含T7启动子序列； 原位扩增；,3SR酶液成分和配制:1.4lK/30u AMVRT、5l/100u T7RNA聚合酶、3l/3u RNA酶H;10l 3SR反应液,42c扩增1h。 杂交，显色观察。,第二节 原位PCR实验中应注意的问题 和对照设置,由于原位PCR技术具有高敏感性和高特异性的显著特点，技术操作系统极易受到包括试剂和操作中各种因素的干扰和影响，假阳性和假阴性的机率较高，实验中应予以重视和避免。,对照设置的要求尤需严
11、格和强调，实验中要求除设置不含引物和探针的空白对照，以及用无关探针或抗体取代的阴性试剂对照外，还应加做核酸酶消化与不加Taq酶的阴性对照，以保证结果的可靠性。对阴性扩增，尚应取相应的组织或细胞提取DNA或RNA进行液相PCR对照检查，以排除假阴性。,至于，一些技术操作，例如，防脱片，及时和合理固定，蛋白酶和核酸酶消化的把握，扩增液和杂交液成分和浓度的配制，等等，也均涉及到原位PCR技术操作的成败，需通过预实验探索确定。书本和文献上介绍的具体流程可用来作实验起步参考，但不能依赖，得裉据实验进程和问题适当变动。具体内容可参阅教材162-163页。,第三节 原位PCR的应用,原位PCR的特点是能在组
12、织细胞原位检测低拷贝数的特异性基因序列.根据待检基因的性质,原位PCR的应用可分为外源性基因检测和内源性基因检测两个方面.外源性基因检测主要涉及感染性基因和导入基因二大类:前者以病毒基因检测报道最多 。,例如:HIV-1与AIDS病,HPV与尖锐湿疣,宫颈癌及阴茎癌,EBV与鼻咽癌,HSV与带状庖疹和颅内脑神经感染,HBV和HCV与肝炎及肝细胞癌,等等,通过患者或动物模型组织细胞的相关病毒基因检测,有助于深入研究关联疾病的本质,早期诊断和预后判断,尤其是应用于肿瘤的研究领域 。,导入基因检测则主要涉及转基因动物和基因治疗研究中的外源性基因导入质量的监控.内源性基因检测的靶目标,目前文献报道主要集中在三类基因,即异常或变异基因,固有基因和细胞因子基因,大多与肿瘤研究有关.这方面的具体研究成果,教材中已有详细记载,同学们可以自己阅读。,总之,原位PCR技术作为形态学与分子生物学的前沿交叉产物,自1990年创立以来,由于其敏感性高特异性强,能在组织细胞原位进行低拷贝数基因定位的突出优点,已逐步成为生命科学各个分支进行前沿课题研究的一种强有力原位示踪工具 。,正如Anderson生动地指出的那样:“原位PCR使光学显微镜超过电子显微镜在向生物化学及遗传学领域延伸”.今后,深信随着原位PCR技术的不断改进完善,其应用必将更加广泛。,
