1、ICS 13.060Z 16DB 37山 东 省 地 方 标 准DB 37/T XXXXXXXXX渔业用水中多西环素、四环素、土霉素、金霉素残留量的测定 高效液相色谱法Determination of doxycycline, tetracycline, oxytetracycline, chlortetracycline，residues in fishery water by high performance liquid chromatography (HPLC)XXXX - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施山 东 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布DB37/
2、 XXXXXXXXXI目 次前言 II1 范围 .12 规范性引用文件 .13 原理 .14 试剂与配制 .15 仪器和设备 .26 试样的测定 .26.1 样品的制备 .26.2 样品的提取净化 .26.3 标准曲线的制备 .26.4 测定 .27 计算 .38 检测限 .39 回收率 .310 精密度 4附 录 A （资料性附录） 色谱图 5DB37/ XXXXXXXXXII前 言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由山东省海洋与渔业厅提出并监督实施。本标准由山东省渔业标准化技术委员会(鲁TC
3、 03)归口。本标准起草单位：济宁市渔业监测站。本标准主要起草人：史艳伟、孟丽华、时彦民、刘方、吴广州、蒋帮铜、孟娟、邓晨曦、简康、时兵。DB37/ XXXXXXXXX1渔业用水中多西环素、四环素、土霉素、金霉素残留量的测定 高效液相色谱法1 范围本标准规定了渔业用水中土霉素(Oxytetracycline)、四环素（Tetracycline）、金霉素(Chlortetracycline)、多西环素（Doxycycline，Vibramycin又名强力霉素、脱氧土霉素）残留量的测定原理、试剂与配制、仪器和设备、试样的测定、计算、检测限、回收率与精密度等。本标准适用于渔业用水中土霉素、四环素、金
4、霉素、多西环素残留量的测定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 原理水样经HLB固相萃取柱净化，高效液相色谱仪配紫外检测器测定，外标法定量。4 试剂与配制所用试剂除另有规定外，均为分析纯，实验用水应符合GB/T 6682一级水标准。4.1 甲醇：色谱纯。4.2 乙腈：色谱纯。4.3 磷酸：色谱纯。4.4 磷酸二氢钠。4.5 0.01 mol/L 磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠 1.56 g，用 950 m
5、L水溶解，磷酸调 pH至 2.5，用水稀释并定容至 1 000 mL，过 0.45 m 水相滤膜备用。4.6 土霉素标准品：（CAS：2058-46-0）纯度96.0 %。4.7 四环素标准品：（CAS：64-75-5）纯度94.0 %。4.8 金霉素标准品：（CAS：64-72-2）纯度99.0 %。4.9 多西环素标准品：（CAS：24390-14-5）纯度98.0 %。4.10 土霉素、四环素、金霉素、多西环素标准储备液：分别准确称取土霉素标准品 0.010 0 g，四环素标准品 0.010 0 g，多西环素标准品 0.010 0 g，金霉素标准品 0.020 0 g，用甲醇溶解并定容至
6、100 mL，制得土霉素、四环素、多西环素浓度分别为 100 g/mL，金霉素浓度为 200 g/mL 的标准储备液，-18 避光保存，有效期 6个月。DB37/ XXXXXXXXX24.11 土霉素、四环素、金霉素、多西环素混合标准使用液：分别移取 4.10中的标准储备液 10.0 mL，定容至 100 mL，制得土霉素、四环素、多西环素浓度为 10 g/mL，金霉素浓度为 20 g/mL 的混合标准使用液，0 4 避光保存，有效期 2周。5 仪器和设备5.1 液相色谱仪，配紫外检测器。5.2 氮吹仪。5.3 超声波清洗器。5.4 超纯水仪。5.5 涡旋混合器。5.6 分析天平：感量 0.0
7、00 1 g。5.7 HLB 固相萃取柱：60 mg，3 mL，或性能相当者。5.8 抽滤装置。6 试样的测定6.1 样品的制备水样经0.45 m滤膜过滤，备用。6.2 样品的提取净化固相萃取小柱预先用3 mL甲醇、3 mL水活化，准确量取60 mL经过滤后的水样（6.1），转移至固相萃取柱中，控制流速不超过2 mL/min，用5 mL水淋洗小柱，抽干，用8 mL甲醇洗脱，收集洗脱液于10 mL具塞玻璃离心管中，于40 下氮气吹干，残留物用1.0 mL流动相溶解定容，涡旋混合1 min，超声2 min，过0.45 m滤膜，供液相色谱测定。6.3 标准曲线的制备分别准确移取0.5 mL、1.0
8、mL、2.0 mL、5.0 mL、10.0 mL混合标准使用液（4.11），用流动相定容至100 mL，制得一系列浓度的混合标准工作液，使其中土霉素、四环素、多西环素浓度系列为0.05、0.10、0.20、0.50、1.0 g/mL；金霉素标准使用浓度系列为0.10、0.20、0.50、1.0、2.0 g/mL。此标准使用液现配现用。以峰面积为纵坐标，对应的浓度为横坐标，绘制标准工作曲线。6.4 测定6.4.1 色谱参考条件6.4.1.1 色谱柱：XDB-C 18柱，250 mm4.6 mm（i.d.），5 m；或者性能相当者。6.4.1.2 流动相：A：乙腈；B：0.01 mol/L 磷酸二
9、氢钠溶液（4.5）。6.4.1.3 流速：1.0 mL/min。6.4.1.4 进样量：50 L。6.4.1.5 波长：350 nm。6.4.1.6 柱温：30 。6.4.1.7 流动相梯度洗脱程序见表 1。DB37/ XXXXXXXXX3表 1 流动相梯度洗脱程序时间（min） A（%） B（%）0 17.0 83.015 32.0 68.016 45.0 55.017 45.0 55.018 17.0 83.025 17.0 83.06.4.2 液相色谱测定在上述色谱条件下对标准工作液和样品溶液分别进行测定，土霉素、四环素、金霉素、多西环素保留时间分别为6.2 min、7.5 min、12
10、.1 min、13.5 min。标准工作液和样品溶液中土霉素、四环素、金霉素、多西环素响应值均应在仪器检测线性范围内。液相色谱图参见附录A（图A.1、图A.2）。6.4.3 空白试验除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行。液相色谱图参见附录A（图A.3）。7 计算试样中土霉素、四环素、金霉素、多西环素残留量按公式计算。计算结果需扣除空白值，结果保留3位有效数字。(1)0VCX式中：X 样品中各抗生素含量，单位为毫克每升（mg/L）；C 样品溶液中各抗生素含量，单位为微克每毫升（g/mL）；V 样品溶液最终定容体积，单位为毫升（mL）；V0 样品溶液量取体积，单位为毫升（mL）。8 检测限本方
11、法土霉素、四环素、多西环素检出限为5 g/L、定量限为10 g/L；金霉素检出限为10 g/L、定量限为20 g/L。9 回收率土霉素、四环素、多西环素在添加浓度10 g/L50 g/L时，回收率均为70 %110 %；金霉素在添加浓度20 g/L100 g/L时，回收率均为70 %110 %。DB37/ XXXXXXXXX410 精密度本方法的批内相对标准偏差小于15 %，批间相对标准偏差小于15 %。DB37/ XXXXXXXXX5A A附 录 A（资料性附录）色谱图标准溶液色谱图见图A.1，水样加标样品色谱图见图A.2，空白水样色谱图见图A.3。说明：土霉素浓度为0.5 g/mL。四环素浓度为0.5 g/mL。多西环素浓度为0.5 g/mL。金霉素浓度为1.0 g/mL。图 A.1 标准溶液色谱图DB37/ XXXXXXXXX6说明：土霉素添加量为0.01 g/mL。四环素添加量为0.01 g/mL。多西环素添加量为0.01 g/mL。金霉素添加量为0.02 g/mL。图 A.2 水样加标样品色谱图图 A.3 空白水样色谱图_
