1、实习指导生物药剂学与药物动力学实验实验一 药物在体小肠吸收实验一、实验目的 1以磺胺嘧啶为模型药物，掌握大鼠在体肠道灌流法的基本操作和实验方法。2掌握药物肠道吸收的机理及吸收速度常数（k a）与吸收半衰期t 1/2(a)的计算方法。 二、实验原理 药物消化道吸收实验方法可分为体外法（in vitro）、在体法（in situ）和体内法（in vivo）。在体法由于不切断血管和神经，药物透过上皮细胞后即被血液运走，能避免胃内容物排出及消化道固有运动等生理影响，是一种较好的研究吸收的方法。但本法一般只限于溶解状态药物，并有可能将其他因素引起药物浓度的变化误认为吸收。消化道药物吸收的主要方式为被动扩
2、散。药物服用后，胃肠液中高浓度的药物向细胞内透过，又以相似的方式扩散转运到血液中。这种形式的吸收不消耗能量，扩散的动力来源于膜两侧的浓度差。药物转运的速度可用 Ficks（注：最后一稿校，全书一致）扩散定律描述：式中， 为扩散速度； D 为扩散系数；A 为扩散表面积；k 为分配系数；h 为膜厚度，C GI 为胃肠道中药物浓度； C 为血药浓度。在某一药物给予某一个体的吸收过程中，其D、A 、 h、k 均为定值，可用透过系数 P 来表示，即 。当药物口服后，吸收进入血液循环中的药物，随血液迅速地分布于全身。故胃肠道中的药物浓度（C GI）远大于血中药物浓度（C ），则上式可简化为：上式表明药物被
3、动转运（简单扩散）透过细胞膜的速度与吸收部位药物浓度的一次方成正比，表明被动转运速度符合表观一级速度过程。若以消化液中药量（X a）的变化速度（ ）表示透过速度，则：式中，k a 为药物的表观一级吸收速度常数。对上式积分后两边取对数：式中，X a 为 t 时间消化液中药量；X 0 为零时间消化液中药量。以 lgXa 对 t 作图可得一直线，由此直线斜率即可求出药物的吸收速度常数，并可计算吸收半衰期： 本实验以磺胺嘧啶为模型药物，进行大鼠在体小肠吸收试验。三、仪器与材料仪器：蠕动泵、紫外-可见分光光度计、恒温水浴、离心机、注射器、眼科剪刀、眼科镊子、手术刀片等。材料：0.1%亚硝酸钠、0.5 %
4、氨基磺酸铵、0.1%二盐酸萘乙二胺溶液、1 mol/L 盐酸溶液、0.2 mol/L 氢氧化钠溶液、10 mg/ml 戊巴比妥钠溶液、生理盐水等。四、实验内容（一）试剂的配制1Krebs-Ringer 试剂（pH 7.4） 称取氯化钠 7.8 g，氯化钾 0.35 g，氯化钙 0.37 g，碳酸氢钠 1.37 g，磷酸二氢钠 0.32 g，氯化镁 0.02 g，葡萄糖 1.4 g，加蒸馏水定容至 1000 ml。2供试液 精密称取磺胺嘧啶（SD）20 mg，酚红 20 mg，加少量蒸馏水混悬，加入1%碳酸钠溶液使溶解，再用 Krebs-Ringer 试剂定容至 1000 ml，摇匀。3酚红液
5、精密称取酚红 20 mg，加少量蒸馏水混悬，加入 1%碳酸钠溶液使溶解，再用 Krebs-Ringer 试剂定容至 1000 ml，摇匀。（二）实验步骤1蠕动泵流速的调节 打开蠕动泵电源，选择所需工作的方向，按动快、慢档开关，调节流速为 5 ml/min 和 2.5 ml/min。2恒温水浴调节 将水浴温度调节为 370.5。3供试液的准备 取 80 ml 供试液加入循环装置的烧瓶中，见图 19-1，将烧瓶置恒温水浴中预热至 370.5。4生理盐水的准备 取生理盐水适量，预热至 37备用。5大鼠麻醉 取实验前禁食一夜、体重约 200 g 的雄性大鼠一只，称重；腹腔注射戊巴比妥钠（剂量为 40
6、mg/kg），麻醉后背位固定于固定台上。6小肠插管 沿腹中线打开腹腔（约 3 cm）。自十二指肠上部及回肠下部各剪开一个小口，插入直径约 0.3 cm 的玻璃管，用线扎紧。7洗涤肠管 用注射器将 37的生理盐水缓缓注入肠管，洗净肠管内容物。8做成回路 将肠管两端的玻璃管按图 19-1 所示与胶管连接，作成回路，开动蠕动泵，流速为 5 ml/min。9取样 以 5 ml/min 的流速循环 10 min 后，将流速调至 2.5 ml/min，立即自供试液烧瓶中取样两份（1 ml 和 0.5 ml 各一份），分别作为 SD 和酚红零时间样品，另向烧瓶中补加 2 ml 酚红溶液；其后每隔 15 mi
7、n 按同法取样并补加酚红液，取样至 120 min（共 9次），停止循环。图 19-1 大鼠在体小肠回流实验装置1.蠕动泵；2.温度计；3.水浴；4.循环液；5.大鼠（三）含量测定1标准曲线的制备（1）制备 SD 标准曲线 吸取 SD 供试液（20 g/ml）2、4、6、8、10 ml 分别置 10 ml 量瓶中，用 Krebs-Ringer 试剂定容。再分别吸取上液 1 ml 置 10 ml 具塞试管中，加 1 mol/L 盐酸溶液 5 ml，摇匀；加 0.1%亚硝酸钠溶液 1 ml，摇匀，放置 3 min；加 0.5%氨基磺酸铵 1 ml，摇匀，放置 3 min；再加入 0.1%二盐酸萘乙
8、二胺溶液 2 ml，摇匀，放置20 min。于紫外-可见分光光度计，在波长 550 nm 处测定吸收度。以吸收度对浓度回归，得到 DS 标准曲线方程。（2）制备酚红标准曲线 精密称取酚红 25 mg 置 250 ml 量瓶中，加 Krebs-Ringer 试剂定容；再吸取 1、2、3、4、5、6 ml 置 10 ml 量瓶中，用 Krebs-Ringer 试剂定容。各吸取上液 0.5 ml 置 10 ml 具塞试管中，加入 0.2 mol/L 氢氧化钠溶液 5 ml，摇匀。于紫外-可见分光光度计，在波长 555 nm 处测定吸收度。以吸收度对浓度回归，得到酚红标准曲线方程。2样品测定（1）SD
9、 的测定 取样品 1 ml 置 10 ml 具塞试管中，加入 1 mol/L 盐酸溶液 5 ml，摇匀；以下按“制备 SD 标准曲线”项下的方法，自“加 0.1%亚硝酸钠溶液 1 ml ”起，依法测定吸收度。将吸收度代入标准曲线回归方程，计算出 SD 浓度，并记录于表 19-1。（2）酚红的测定 取样品 0.5 ml 置 10 ml 具塞试管中，加入 0.2 mol/L 氢氧化钠溶液5 ml，摇匀。于紫外-可见分光光度计，在波长 555 nm 处测定吸收度。将吸收度代入标准曲线回归方程，计算出酚红浓度，并记录于表 19-1。（四）注释1小肠吸收过程中，药物被吸收的同时水分也被吸收，导致供试液体
10、积不断减少，所以不能用直接测定药物浓度的方法计算剩余药量。由于酚红不能被小肠吸收，因此可向供试液中加入定量的酚红，在一定间隔时间测定药物浓度的同时，也测定酚红的浓度，由酚红浓度先计算出不同时间供试液的体积，再根据测定药物的浓度，就可以得出不同时间小肠中剩余的药量或被吸收的药量。2插管时应注意方向，在十二指肠端向下插，回肠端向上插，以构成回路。3由于是在体实验，为真实反映体内环境对药物吸收的影响，不需要对肠系膜进行分离，操作时还应注意避免剪破血管。4由于小肠很细，小肠两端插管后再洗涤容易堵塞，加大流速可导致玻璃管滑出消化道而漏液。防止的方法是先将十二指肠端插管，回肠端找好后先用线扎紧（方便以后找
11、切口位置），然后在扎线处切个小口，生理盐水从十二指肠插管处注入，待洗涤干净后，再于回肠端切口处插管。5开始回流后，可用棉花覆盖大鼠腹部保暖，以防实验结束前动物死亡，丢失数据。6SD 的测定中，加入氨基磺酸铵后要充分振摇至无气泡发生。7SD 浓度测定中空白对照液的制法：取酚红液 1 ml 置 10 ml 具塞试管中，加 1 mol/L 盐酸溶液 1 ml，摇匀，以下操作按 “制备 SD 标准曲线”方法。8酚红浓度测定中空白对照液为 0.2 mol/L NaOH。五、实验结果1计算 SD 和酚红的标准曲线回归方程和相关系数。2根据 SD 和酚红的标准曲线，分别计算出规定时间样品的 SD 和酚红浓度
12、，记录于表 19-1 中。并按表中公式计算循环液体积及剩余药量；式中 Cn 表示第 n 次取样时 SD 的浓度， 表示第 n 次取样时酚红的浓度。表 19-1 SD 小肠吸收实验数据处理取样时间(min)SD吸收度SD 浓度(g/ml)酚红吸收度酚红浓度(g/ml)循环液体积(ml)剩余药量(g)循环前 A0 C0 V0 = 80 X0 = V0 C00 A1 C1 X1 = V1 C115 A2 C2 X2 = V2 C2 +1.5C130 A3 C3 X3 = V3 C3 +1.5(C1 + C2) tn An Cn3以剩余药量的对数对相应的时间作图，可得一直线，由直线斜率可求得 ka 与
13、 t1/2(a)值。实验二 药物的组织分布实验一、实验目的1以磺胺噻唑钠为模型药物，掌握药物组织分布实验的基本方法。2掌握生物样品的收集及前处理方法。二、实验原理药物在体内的分布是指药物经吸收进入体循环后，通过血液和各组织的膜屏障转运至各组织的动态过程。药物分布取决于组织的血流量、药物对脂膜的扩散速度及药物与蛋白质的结合程度。药物要分布到药理作用靶部位才能发挥药效。但如果药物在某组织出现蓄积则可能产生毒性作用，所以药物的分布可为药效学和安全性评价提供重要信息。通过组织分布研究，可以了解试验药物在实验动物体内的分布规律、主要蓄积组织或器官、蓄积程度等。组织分布实验通常通过给药后，于一定时间取出各
14、组织或器官，经前处理后，用适宜的方法测定其中药物的含量。磺胺噻唑钠为对氨基苯类化合物，在酸性溶液中可使苯环上的氨基（-NH 2）离子化生成铵类化合物（-NH 3+），进而与亚硝酸钠起重氮反应，产生重氮盐。此重氮盐可在酸性溶液中与显色剂胺类化合物（N-1-萘乙二胺）起偶联反应，形成紫红色的偶氮化合物。利用该呈色反应，采用分光光度法可测定出给药后不同时间不同组织中磺胺类药物的浓度。三、仪器与材料仪器：紫外-可见分光光度计，组织匀浆器，离心机，离心管等。材料：10%磺胺噻唑钠（ST）注射液，20%三氯醋酸溶液，0.5% 亚硝酸钠溶液，0.05%二盐酸萘乙二胺等。 四、实验内容（一）标准曲线的制备取大
15、鼠 3 只，断颈处死，收集血液至肝素化离心管中，并立即取出肝脏、肾脏及脑组织，用生理盐水冲洗干净后立即用滤纸吸干，精确称量组织重量，按 1:6 加生理盐水（脑组织按 1:3）置玻璃匀浆器中进行研磨，研磨后将匀浆液倒入离心管中，以 3000 r/min 离心 10 min，取上清液 1 ml 按 1:1 加 20%三氯醋酸沉淀蛋白， 3000 r/min 离心 10 min，取上清液待用，血液经 3000 r/min 离心 10 min 后取上层血浆待测。精密吸取沉淀蛋白后不同组织的上清液 2 ml 各 6 份于干净试管中，加入磺胺噻唑钠标准溶液使肝脏、肾脏组织液中药物浓度为 0.1、0.25、
16、0.5、1、5、10 g/ml，脑组织液中药物浓度为 0.05、0.1、0.25、0.5、1.5 g/ml，再各加入 0.5%亚硝酸钠溶液 0.05 ml，混合，静置 3min 后，各加入 0.5%氨基磺酸铵溶液 1 ml，摇匀 2 min 后加显色剂（0.05% 二盐酸萘乙二胺）2 ml，摇匀，5 min 后于紫外-可见分光光度计，在 540 nm 处测定吸收度；空白对照以 2 ml 蒸馏水替代组织上清液，其他操作同样品处理。（二）组织分布实验取大鼠 4 只称重，按 100 mg/kg 的剂量尾静脉注射 10%磺胺噻唑钠注射液，于给药后5、20、60、120 min 时，处死大鼠，收集血液至
17、肝素化离心管中，并立即取出肝脏、肾脏及脑组织，用生理盐水冲洗干净后立即用滤纸吸干，精确称量组织重量，余下操作除不加标准液外，其他同标准曲线制备项下处理后，测定不同时间、不同组织中的药物吸收度，代入相应标准曲线，计算不同时间内各组织中 ST 的浓度。（三）注释1生物样品中含有大量的蛋白质，它们能与药物结合，影响药物的含量测定。特别是使用 HPLC 法时易损伤色谱柱，因此测定前必须先沉淀蛋白使药物游离后再作进一步处理。可通过加入与水混溶的有机溶剂、中性盐或强酸等方法沉淀蛋白。2本试验也可用家兔为实验动物，但标准曲线的浓度范围须由预试验确定。本实验主要给出肝脏、肾脏及脑组织中 ST 浓度的标准曲线浓
18、度范围，仅供参考；心脏及血液的浓度范围可根据预试验确定。五、实验结果（一）实验记录与数据处理1分别计算各组织中 ST 的标准曲线回归方程和相关系数。2根据标准曲线方程，分别计算出各组织中样品的浓度及药量，并记录于表 19-2。表 19-2 各组织中药量组织 时间（min） A 浓度 C（g/ml） 组织中药物量（g/g）5 20 60 肝120 5 20 60 肾120 5 20 60 脑120 5 20 60 心脏120 5 20 60 血液120 实验三 血药浓度法测定静注给药的药动学参数一、实验目的1掌握用血药浓度法测定药物动力学参数的基本方法。2掌握两室模型药物静注给药的药动学参数测定
19、方法，求算氨茶碱药动学参数。二、实验原理氨茶碱静脉注射后，其体内血药浓度-时间曲线呈两室模型曲线特征。若药物在体内呈两室模型分布，药物消除仅发生在中室，并符合表观一级动力学过程，则静脉注射给药后血药浓度经时变化公式为：氨茶碱静注后，定时测定血药浓度。并由血药浓度-时间数据按两室模型拟合出 、 、 A 与 B 值，然后再进一步求算药动学隔室模型参数。三、仪器与材料仪器：紫外分光光度计，旋涡混合器，离心机，具塞试管，注射器，刀片等。材料：氨茶碱注射液，5%葡萄糖注射液， 0.1 mol/L 盐酸溶液，0.1 mol/L 氢氧化钠溶液，氯仿-异丙醇（95:5）溶液，75%乙醇等。 四、实验内容（一）
20、标准曲线的制备以 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液配制 10 g/ml 的氨茶碱标准储备液。精密吸取标准储备液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml 置具塞试管中，并加蒸馏水至 1 ml，各加入空白兔血清 0.5ml，配成相当于血清药物浓度 2、4、8、12、16、20 g/ml 的标准样液。在试管中加入 0.1 mol/L 盐酸溶液 0.2 mL，于旋涡混合器上混匀后，再加入氯仿-异丙醇（95:5）溶液 5.0 ml，密塞，振摇混合，以 2500 r/min 离心 20 min。精密吸取下层液 4.0 ml 置另一具塞试管中，加入 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液 4.0 ml
21、，振摇混合，以 2500 r/min 离心 10 min。取上清液 33.5 ml，于紫外分光光度计上，以 2 ml 蒸馏水加 4 ml 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液作参比，在 274 nm 和 298 nm 波长处分别测定吸收度（A 274 和 A298），计算出 A（A 274 - A298）。以 A 为纵坐标，C（血药浓度，g/ml）为横坐标绘制标准曲线并求出标准曲线回归方程，备用。（二）给药与取样选取体重 2.53 kg 的健康家兔，实验前禁食一夜。将氨茶碱注射液先用 5%葡萄糖注射液稀释 510 倍，按 15 mg/kg 的剂量，由兔耳静脉快速推注（要求在 2 min 内注射完毕
22、）。 给药后于 0.25、0.5、1、2、3、4、6、8 h 取兔耳静脉血约 2 ml，置试管中。（三）血清中氨茶碱浓度的测定将血样以 2500 r/min 离心 20 min 后，使血清分离，吸取 0.5 ml 血清样品，置具塞试管中，加蒸馏水 1.0 ml，混匀。以下按“标准曲线的制备” 项下的方法，自“在试管中加入 0.1 mol/L 盐酸溶液 0.2 ml”起，依法测定吸收度。将 值代入标准曲线回归方程，求出血清中氨茶碱浓度，并记录于表 19-3。（四）注释1氨茶碱为茶碱与乙二胺的复盐，易溶于水，几乎不溶于乙醇与乙醚。氨茶碱在体液中分离出茶碱，在酸性条件下，可用有机溶剂从血清中提取茶碱
23、，并同时沉淀血清蛋白；再用碱液把茶碱从有机溶剂中提出进行浓度测定。2氨茶碱血药浓度测定方法采用紫外双波长法，即分别于 274 和 298 处测定碱性提取液的吸收度（A），其中 A274 为茶碱和本底（包括代谢产物、溶剂及血清中有关成分）的吸收度，而 A298 仅为本底的吸收度，故茶碱的吸收度 A = A274 - A298。该法省去了以空白血清作对照品，尤其对于临床血药浓度监测不易采取病人空白血样时，具有实用价值。3用氯仿-异丙醇溶液提取血清中茶碱时，在旋涡混合器上混合的时间不宜过长，否则样品与有机溶剂会发生乳化现象，将影响分离提取效果以及测定结果。4兔耳取血法 用固定架固定家兔，将兔耳静脉处
24、脱毛，用酒精棉球擦洗，并用手弹打耳根部，使局部充血。用 58 号针头，在离耳根约 1 cm 处，向耳尖方向刺入静脉约 1 cm 左右，拔出后滴血收集；也可用手术刀片尖端在静脉血管处轻划一小口，让其自然滴血。取血毕，用干棉球压住出血口数分钟即可止血。下一次取血时，可用针尖或刀片尖端轻轻挑开伤口，让其自然滴血。在天气较冷时，家兔耳缘取血有困难，可用红外灯照射兔耳部帮助其升温充血。5本实验也适用于测定氨茶碱片剂口服给药的药动学参数。但利用家兔测定两室模型药物口服给药的药动学参数时，在取样点及时间间隔的安排上较难把握，故氨茶碱口服给药常按单室模型拟合药动学参数，往往可得到较满意的效果。五、实验结果（一
25、）实验记录与数据处理1计算标准曲线回归方程及相关系数。2氨茶碱血药浓度数据及其计算，记录于表 19-3。表 19-3 血药浓度测定数据t（h） 0.25 0.5 1 2 3 4 6 8A274 A298 A C（g/ml） lgC （二）氨茶碱药物动力学参数的求算1作 C t 图与 lgC t 图。2应用“残数法”求算混杂参数 、A 与 B 值（具体方法详见第九章）。（1）根据 lgC t 曲线，划分“分布相”与“消除相”；（2）由“消除相”血药浓度数据，求回归直线方程，并求出 与 B 值；（3）由上述消除直线方程求出外推线浓度并计算残数浓度（C r），记录于表 19-4；（4）由“分布相”残
26、数浓度数据，求回归直线方程，并求出 与 A 值。表 19-4 血药浓度与残数浓度数据表t（h） C（g/ml） lgC 外推线浓度（g/ml） Cr（g/ml） lgCr0.25 0.5 1 2 3 4 6 8 3求算药动学隔室模型参数（具体方法详见第九章）。（1）计算药动学隔室模型参数 k21、k 10 与 k12；（2）计算中室与总体表观分布容积（V C 与 V）；（3）计算生物半衰期 t1/2()；（4）分别按公式法和梯形面积法计算血药浓度-时间曲线下面积（AUC）；（5）将药物动力学参数记录于表 19-5。表 19-5 氨茶碱静注后的药物动力学参数A（g/ml） VC（L ） B（g/
27、ml） k12（ h-1） （h -1） k21（ h-1） （h -1） k10（ h-1） t1/2()（h） AUC（gh/ml ） 积分法 V（L） AUC（gh/ml ） 梯形面积法 实验四 血药浓度法测定口服给药的药动学参数与生物利用度一、实验目的1掌握用血药浓度法测定制剂生物利用度的方法。2掌握单室模型药物血管外给药的药物动力学参数测定方法。二、实验原理生物利用度是指药物吸收进入体循环的程度与速度。生物利用度是评价药物制剂体内质量的重要指标。在制剂的研制以及临床用药时经常测定制剂的绝对或相对生物利用度。绝对生物利用度的测定是以静脉注射剂作为标准参比制剂；而相对生物利用度常采用采用
28、市场认可、吸收较好且临床有效的制剂作为标准参比制剂。在评价生物利用度的参数中，绝对生物利用度常用血药浓度-时间曲线下面积（AUC）或尿药排泄总量（ ）的相对比值（ F）来反映吸收程度；相对生物利用度则常用 AUC 或 的相对比值（ Fr）来反映吸收程度，用血药浓度达峰时间 tmax、峰浓度 Cmax 或 ka值来反映吸收的相对速度。测定药物制剂的生物利用度目前多采用血药浓度法与尿药浓度法。由于测定血药浓度可获得瞬时数据，故采用血药浓度法测定生物利用度较为理想。本实验以对乙酰氨基酚为模型药物，测定其在家兔体内的药物动力学参数与相对生物利用度。三、仪器与材料仪器：紫外分光光度计，离心机，具塞刻度试
29、管等。材料：对乙酰氨基酚片剂（0.5 g），对乙酰氨基酚注射液（ 1 ml：0.075 g 或 2 ml：0.25 g），0.12 mol/L 氢氧化钡溶液，2%硫酸锌溶液等。四、实验内容（一）标准曲线的制备1配制标准储备液 精密称取对乙酰氨基酚标准品 250 mg，置 500 ml 量瓶中，以蒸馏水溶解后，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀；再精密吸取上述溶液 10 ml，置 50 ml 量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，即得 100 g/ml 的对乙酰氨基酚标准储备液。2制备标准曲线 精密吸取上述标准储备液 1、2、4、6、8、10 ml 分别置 10 ml 量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，再各取 1
30、 ml 置 10 ml 具塞刻度试管中，各加入空白兔血清 0.5ml，配成相当于对乙酰氨基酚血清药物浓度 20、40、80 、120、160、200 g/ml 的标准样液；在试管中加入 0.12 mol/L 氢氧化钡溶液 3.5 ml，摇匀，放置 2 min，再加入 2%硫酸锌溶液 3.5 ml，即出现明显乳状浑浊，加蒸馏水至 10 ml，摇匀，以 2500 r/min 离心 10 min；取上清液 3.54 ml（如有些样品仍浑浊可过滤），以蒸馏水 1 ml 加 0.5 ml 空白兔血清按同法操作所得样品为参比，于紫外分光光度计，在 245 nm 波长处测定标准样液吸收度（A）。以 A 为纵
31、坐标，C （血药浓度，g/ml ）为横坐标绘制标准曲线并求出标准曲线回归方程，备用。（二）给药与取样选取体重 2.53.0 kg 的健康家兔，实验前禁食一夜；给药前，先由兔耳静脉取空白血约 2ml，置试管中；然后给家兔口服对乙酰氨基酚（0.5 g）一片，用 20 ml 水送服，或口服相同剂量的对乙酰氨基酚溶液。给药后于 0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、7.0 h 取兔耳静脉血约 2 ml，置试管中。（三）血清中对乙酰氨基酚的测定将所取血样置 37水浴中保温 1 h，取出，以 3000 r/min 离心 10 min，取血清 0.5 ml，置 10 ml 具塞刻
32、度试管中，以下按“制备标准曲线”项下的方法，自“在试管中加入 0.12 mol/L 氢氧化钡溶液 3.5 ml ”起操作，并以空白血清按同样操作所得样品为参比，于紫外分光光度计，在 245 nm 波长处测定吸收度（A），代入标准曲线回归方程，计算出血清中对乙酰氨基酚浓度，并记录于表 19-6。（四）注释1家兔口服给药方法（1）口服片剂 可由二人协作完成。一人坐好，将兔躯干夹于两腿之间，左手握住双耳，固定头部，右手抓住前肢。另一人将开口器横放于兔口中，将舌头压在开口器下面，固定开口器。用摄子夹住药片，从开口器洞孔送入咽部，用 20 ml 水冲服下。 （2）口服溶液 可采用灌胃法。一人将兔身固定于
33、腋下，一手固定兔头，另一手将开口器放入兔口；另外一人将一根细胶管从开口器孔插入口内，再慢慢插入食道和胃。为慎重起见，可将细胶管外端放入水中，如无气泡，则证实细胶管在胃内；即可用注射器将药物溶液注入细胶管，灌入胃内。2对乙酰氨基酚溶液的配制 可用其注射液（1 ml：0.075 g 或 2 ml：0.25 g）配制。可将注射液稀释成 1 ml：0.025 g 的浓度，给家兔口服 20 ml（0.5 g）。30.12 mol/L 氢氧化钡溶液的配制 取分析纯或化学纯氢氧化钡 19 g，加新鲜煮沸放冷的蒸馏水溶解成 1000 ml，静置过夜，过滤即得。五、实验结果（一）实验记录与数据处理1计算标准曲线
34、回归方程。2对乙酰氨基酚口服给药后血药浓度数据记录于表 19-6。表 19-6 对乙酰氨基酚口服给药的血药浓度数据片剂 溶液t（h）A C（g/ml） A C（g/ml）0.25 0.5 1.0 1.5 2.0 3.0 4.0 5.0 7.0 （二）药动学参数与相对生物利用度的求算对乙酰氨基酚口服给药后，其体内血药浓度-时间曲线呈单室模型曲线特征。本实验以对乙酰氨基酚溶液作为标准参比制剂，测定其片剂（试验制剂）的相对生物利用度。将片剂、溶液口服后测得的血药浓度数据分别按下列过程拟合药动学参数，并求出相对生物利用度。1作 Ct 图与 lgCt 图。2应用“残数法”求算药物动力学参数 k、k a、
35、t 1/2 及 V 值（具体方法详见第八章）。（1）根据 lgCt 曲线，划分“吸收相”与“消除相”；（2）由“消除相”血药浓度数据，求回归直线方程，并求出 k 值及 t1/2 值；（3）由上述消除直线方程求出外推线浓度并计算残数浓度（C r），记录于表 19-7；（4）由“吸收相”残数浓度数据，求回归直线方程，并求出 ka 值。表 19-7 对乙酰氨基酚血药浓度与残数浓度数据表片剂 溶液C 外推线浓度 Cr C 外推线浓度 Crt（h）（g/ml） （g/ml） （g/ml） （g/ml） （g/ml） （g/ml）0.25 0.5 1.0 1.5 2.0 3.0 4.0 5.0 7.0 3
36、测定相对生物利用度。（1）计算相对生物利用度的吸收程度 根据梯形法公式，分别计算片剂与溶液的 AUC值；计算片剂（试验制剂）的 Fr 值， ，其中给药剂量应以g/kg 体重计；（2）计算相对生物利用度的吸收速度 分别计算口服片剂与溶液的 tmax 与 Cmax 值，计算 Cmax 时 F 可用 Fr 替代；（3）计算表观分布容积 可由上述计算过程中“消除直线”或“残数直线”回归方程中的截距 计算出 V 值，其中 F 以 Fr 替代；（4）将药物动力学参数及生物利用度数据记录于表 19-8，并分析与评价对乙酰氨基酚片剂的相对生物利用度（吸收程度与吸收速度）。 表 19-8 对乙酰氨基酚口服给药的
37、药动学参数与生物利用度k t1/2 ka V tmax Cmax AUC0 Fr制剂（h -1） （h） （h -1） （ L） （h） （g/ml） （g h/ml） （%）片剂 溶液 实验五 尿药法测定人体口服给药的药动学参数与生物利用度一、实验目的1掌握尿药法测定药物动力学参数及生物利用度的方法。2测定维生素 B2 片剂在人体内的生物半衰期与绝对生物利用度。二、实验原理尿药数据法与血药浓度法一样，也可以通过给药后收集各时间尿样，经测定后拟合出药物动力学参数并估算生物利用度。但其准确性受到许多因素的影响，测定结果也不如血药浓度法令人满意。然而尿药法对人体无损伤，测定人体的药动学参数比较方便
38、，故某些情况下仍然使用。在多数情况下，尿药浓度高于血药浓度，定量分析精密度好，测定方法较易建立，且取样方便，可免除受试者多次抽取血样的痛苦。因此，在体内药物大部分以原型从尿中排出的条件下，通常可用尿药法测定消除速度常数、生物半衰期等药动学参数。尿药法由于不适合测定药物的有关吸收动力学参数（如 ka、t max、C max），故无法评价相对生物利用度的速度。本实验以静脉注射剂为参比，采用尿药数据法测定维生素 B2 片剂的绝对生物利用度。三、仪器与材料仪器：紫外-可见分光光度计，具塞试管，量筒，水浴等。材料：维生素 B2 片剂（5 mg）及原料，0.02 mol/L 醋酸溶液，保险粉（连二亚硫酸钠
39、），冰醋酸等。四、实验内容（一）标准曲线的制备1配制标准储备液 先将维生素 B2 原料（或标准品）在 105干燥 2 h，再精密称取50 mg 于 500 ml 量瓶中，加入 0.02 mol/L 醋酸溶液 300 ml，于水浴上加热溶解，放冷至室温，再以 0.02 mol/L 醋酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得 100 g/ml 的维生素 B2 标准储备液，密闭，置阴暗处保存。2制备标准曲线 精密吸取上述标准储备液 0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 ml 分别置10 ml 量瓶中，用酸化蒸馏水（取冰醋酸 1 ml 加蒸馏水至 100 ml 制得）稀释至刻度，摇匀，分别得到 2、4、
40、8、12、16、20 g/ml 的维生素 B2 标准样液；以酸化蒸馏水为空白，于紫外-可见分光光度计，在 444 nm 波长处测定标准样液吸收度（A 1），然后在各瓶中加入保险粉（连二亚硫酸钠）约 3 mg 并摇匀，在 1 min 内再次测定吸收度（A 2）；两次测定吸收度之差值（A = A1 - A2），即为维生素 B2 的吸收度；以 A 为纵坐标，C （标准样品浓度，g/ml）为横坐标绘制标准曲线并求出标准曲线回归方程，备用。（二）给药与取样受试者服药前一天收集 24 h 尿液，量取尿液体积并记录于附表 4-9，再将尿液倒入盛有 0.2 ml 冰醋酸的刻度试管内至 20 ml，摇匀，供测定
41、空白尿中维生素 B2 含量用。临服药前排空小便，早餐后立即口服维生素 B2 片剂 3 片（5 mg/片），以温水送服，并记录服药时间。服药后，于 2、4、6、8、10、12、14、16 h 收集尿液，并用量筒量取各时间段尿液体积后记录于表 19-10，再将尿液倒入盛有 0.2 ml 冰醋酸的刻度试管内至 20 ml，摇匀，于阴凉避光处保存，待测。（三）尿药浓度的测定1测定空白尿中维生素 B2 浓度 取酸化空白尿液 10 ml，按“制备标准曲线”项下的方法，自“以酸化蒸馏水作空白 ”起操作，测得吸收度后，以两次测定值之差（ A），代入标准曲线回归方程，求出空白尿中维生素 B2 浓度并记录于表 1
42、9-9。2测定尿样中维生素 B2 浓度 分别取各时间的酸化尿液 10 ml，按“制备标准曲线”项下的方法，自“以酸化蒸馏水作空白 ”起操作，测得吸收度后，以两次测定值之差（ A），代入标准曲线回归方程，求出尿样中维生素 B2 浓度并记录于表 19-10。（四）注释1维生素 B2 的异咯嗪环上具有活泼的双键，能接受和放出氢原子，在保险粉（连二亚硫酸钠）的作用下，能还原为无色的产物，反应式如下：由于维生素 B2 在 444 nm 波长处有吸收，故利用上述特征，以加入保险粉前后两次测得吸收度的差值，测出尿液中维生素 B2 的浓度。2服药前两天及在整个试验期间应控制食谱，不得吃富含维生素 B2 的食物
43、，如蛋类、牛奶、奶糖等，并不得服用含 B 族维生素的药品。3每次收集尿液后，饮 200 ml 左右的水，以维持一定尿量。4在制备标准曲线以及尿药浓度测定过程中均应注意避光。五、实验结果（一）实验记录与数据处理1计算标准曲线回归方程。2将空白尿的测定结果记录于表 19-9。并由此计算出平均每 2 h 空白尿中维生素 B2的排泄量。表 19-9 空白尿中维生素 B2 浓度A1 A2 A 24 h 尿量（ ml） 尿药浓度（g/ml） 24 h 总尿药量（mg）3将服药后尿液中维生素 B2 浓度测定结果记录于表 19-10。并计算出平均尿药排泄速度数据，记录于表 19-11。表 19-10 尿药浓度
44、测定数据集尿时间（h） 尿量（ ml） A1 A2 A尿药浓度（g/ml）维生素 B2 排泄量（mg）02 24 46 68 810 1012 1214 1416 表 19-11 平均尿药排泄速度数据表集尿时间（h） （h） （h） （mg）* （ mg/h）02 24 46 68 810 1012 1214 1416 * Xu = 维生素 B2 排泄量 - 相同时间间隔内空白尿中维生素 B2 排泄量（派头空二格）（二）药物动力学参数与绝对生物利用度的求算1本实验所测尿药数据按“尿药排泄速度法”拟合药动学参数（按单室模型拟合，具体方法详见第八章），首先作 图。2由上述曲线末段直线段尿药数据，求回归直线方程，并由斜率计算出消除速度常数（k）及生物半衰期（t 1/2）。3计算口服给药后尿液中维生素 B2 的总排泄量（ ）； 可近似由 16 h 内总排药量替代。4按文献资料，人体静注维生素 B2 后尿中总排泄量约为给药剂量的 97%，由此估算口服维生素 B2 片剂的绝对生物利用度（ F）， 。5将上述所求参数及绝对生物利用度记录于表 19-12。表 19-12 维生素 B2 的药动学参数与绝对生物利用度k（h -1） t1/2（h） （mg） F（% ）
