1、第六章,酶化学,本章内容：,酶的概述酶的作用机制酶促动力学酶的应用及发展,酶的概述,一、酶催化作用的特点 二、酶的化学本质及组成 三、酶的命名与分类 四、酶的结构与功能的关系,酶(Enzyme)的概念:,酶是活细胞产生的，具有催化生物反应功能的蛋白质大分子及核酸。,酶的概念,一、酶催化作用特点：,与一般化学催化剂相比，其共性有： 1、用量少而催化效率高； 2、不改变化学反应的平衡点； 3、可降低反应的活化能：,（一）催化效率高：,通常要高出非生物催化剂催化活性的106-1013倍。,1mol过氧化氢酶 5106molH2O2 1molFe+2 610-4molH2O2,（二）、具高度专一性,一
2、种酶只能催化一种或一类十分相似的反应。 底物（substrate ，S)：酶作用的物质。 绝对专一性：只作用一种底物。 相对专一性：作用于一类底物。,酶作用的专一性,酶的专一性：一种酶仅能作用于一种底物，或一类分子结构相似的物质，并催化某种类型的反应。这种特性称为酶的专一性，又叫做酶的特异性或选择性。,酶作用的专一性,结构专一性,立体异构专一性,族（基团）专一性,绝对专一性,族（基团）专一性：可作用于一类或一些结构很相似的底物。,绝对专一性：只能作用于某一底物。,2NH3 + CO2,胰蛋白酶的基团专一性,消化道几种蛋白酶的专一性,立体异构专一性,酶只能催化一种立体异构体发生某种化学反应，而对
3、另一种立体异构体则无作用。,L-乳酸脱氢酶(L-lacticacid dehydrogenase)的底物只能是L型乳酸，而不能是D型乳酸。,（三）、酶易失活：,凡使pr变性的因素都可使酶破坏, 酶在温和条件下作用。（四）、酶活性受多种方式调控： 如：抑制剂、反馈抑制、酶原激活、激素等。,（五）、有些酶的活性与辅酶、辅基 及金属离子有关。除去，酶失活。,酶的概念,二、酶的化学本质,1、大多数酶是蛋白质： 元素组成与分子量 化学结构与空间结构； 理化性质:两性性质；胶体性质； 变性失活；可被蛋白酶分解；结晶；测序。 2、某些RNA具有催化活性,将本质为RNA 的酶称核酶（ribozymes)。,酶
4、的概念,三、酶的命名与分类,（一）酶的命名 酶的命名有两种方法：系统名、惯用名 惯用名：命名原则 根据酶催化反应的性质来命名。 如催化水解反应的酶-水解酶催化氧化反应的酶-氧化酶或脱氢酶 催化转移氨基的酶-转氨酶 根据被作用的底物兼顾反应的性质来命名。 根据酶的来源命名。如细菌淀粉酶、胃蛋白酶。,酶的命名与分类,系统名: 根据酶催化反应的类型分为六大类：分别用1，2，3，4，5，6编号 1、氧化还原酶类 2、转移酶类 3、水解酶类 4、裂分酶类 5、异构酶类 6、合成酶类 根据底物的性质和反应键的性质，每一类又可分为若干亚类及次亚类。仍然用1，2，3，编号。 在次亚类中编号。,：,系统名:,每
5、个酶有两个名称：系统名、惯用名 惯用名：简单、便于使用； 系统名：明确标明酶的底物及催化 反应的性质。,酶的命名与分类,（二）酶的分类 1、根据酶的组成分类：,（1）、单纯酶（简单蛋白质）：其活性仅取决于其蛋白质结构。如：蛋白酶、淀粉酶等。,酶的命名与分类,（2）结合酶：酶蛋白+辅因子=全酶,辅因子(cofacter)：热稳定的非蛋白小分子。,按分子组成：金属离子：Mg2+、Mn2+小分子有机物：NAD + 、NADP +烟酰胺腺嘌呤二核苷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,按与酶的结合程度:,辅酶(coenzyme):结合较松，可透析去除； 辅基(prosthetic grup)：结合较紧，透析不易
6、除去。 酶蛋白负责专一性； 辅因子负责电子、原子或基团转移。同一辅因子可与多种不同酶蛋白结合，显示不同催化活性。,2.按酶的分子特点分：,（1）、单体酶：一条肽链构成。 （2）、寡聚酶：几条到多条肽链（相同或不同）组成。 （3）、多酶体系：几种酶彼此嵌合的复合体， 有利于一系列反应连续进行。 （4）、多功能酶（串联酶）：一些多酶体系在进化过程中由于基因的融合，形成由一条多肽链组成却具有不同催化功能的酶。,3.国际酶学委员会(Enzyme Commision) 根据酶催化反应的类型分类,（1） 氧化还原酶类（2） 转移酶类（3） 水解酶类（4） 裂解酶类（5） 异构酶类（6） 合成酶类,酶的命名
7、与分类,酶的编号,EC 为 Enzyme Commision 酶学委员会缩写,酶的命名与分类,（一）酶的分类 1. 氧化还原酶类：主要是催化氢的转移或电子传递或加氧的氧化还原反应。,AH2 + B（O2） 供氢体 受氢体,A + BH2（H2O2，H2O）,根据受氢体的性质，氧化还原酶类可分为： （1）脱氢酶类：催化直接从底物上脱氢的反应。,AH2 +B,A +BH2（需辅酶或辅酶）,（2）氧化酶类,催化底物脱氢，氧化生成H2O2：,AH2 + O2,A + H2O2,催化底物脱氢，氧化生成H2O：,2AH2 + O2,2A + 2H2O,（3）过氧化物酶,ROO + H2O2,RO + H2
8、O + O2,（其它） （4）加氧酶（双加氧酶和单加氧酶）,（顺，顺-已二烯二酸）,2. 转移酶类：催化化合物中某些基团的转移。,AX + B,A +BX,根据X分成8个亚类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷基（激酶）和含硫基的酶。已糖激酶 葡萄糖 + ATP - 6磷酸葡萄糖 + ADPMg+,水解酶类：催化加水分解作用。AB + H2O AOH + BH4. 裂解酶类：催化非水解性地除去基团而形成双键的反应或逆反应。,CC键,+ CO2 （脱羧酶、醛缩酶）,CO键,+ H2O（脱水酶）,CN键,+ NH3（脱氨酶）,5. 异构酶：催化各种异构体之间的互变。,常见的有消旋
9、和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位酶类。,6. 合成酶类：催化有ATP参加的合成反应。,四、酶的结构与功能的关系 一、酶的活性中心,（一）酶的活性中心概念： 活性中心：酶分子中能同底物结合并起催化作用的空间部位。,羧肽酶的活性中心,实验：酶蛋白经水解切去部分肽链后，残留部分仍有活性。 说明：参与催化反应的只是其中一小部分，即活性中心。,活性中心的实质,活性中心即酶分子中在三维结构上相互靠近的几个aa残基或其上的某些基团。活性中心以外的部分对酶催化次要但对活性中心形成提供结构基础。,胰凝乳蛋白酶的活性中心,活性中心的功能部位：,结合部位：酶分子上与底物结合的部位。 催化部位：底物在此发生一定的化学
10、变化。,（三）活性中心的特点：,1、仅为酶体积的很小部分； 2、具有一定的空间构象； 3、S与E靠次级键结合； 4、是由特定空间构象维持的一个裂隙。,酶促反应机理,溶菌酶活性中心,（四）研究酶活性中心的方法：,1、通过研究专一性底物判断确定E活性中心的结构； 2、用化学修饰法共价修饰E分子的一些功能基团，以查出哪些基团是活性必需的； 3、X-衍射直接探明活性中心。,酶促反应机理,二、酶原的激活,没有活性的酶的前体称为酶原。酶原转变成有活性的酶的过程称为酶原的激活。这个过程实质上是酶活性部位形成和暴露的过程。,在组织细胞中，某些酶以酶原的形式存在，可保护分泌这种酶的组织细胞不被水解破坏。,胰蛋白
11、酶的激活,肠激酶（激活作用）,活性中心,胰蛋白酶原,胰蛋白酶,提问：为什么不直接以酶形式存在呢？,答案：保护正常组织不受伤害。,三、同工酶(isoenzyme),能催化相同的化学反应，但在蛋白质分子的结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶。,乳酸脱氢酶（LDH）,它们存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织、甚至同一组织、同一细胞中；多为寡聚体。,乳酸脱氢酶（LDH）,它由四个亚基组成，其中有两种亚基：H（心肌型）和M（骨骼肌型）； 这两种亚基以不同的比例组合，形成五种同工酶：H4、H3M、H2M2、HM3、M4 它们分布于不同器官中，催化乳酸和丙酮酸之间的互变反应，但与乳酸和丙
12、酮酸的亲和力不同。,乳酸脱氢酶,每种组织LDH同工酶谱具有特定的相对百分率，若某一组织发生病变，必将释放其中LDH同工酶到血液中，导致血清酶谱的变化，这些变化常常是一特定疾病或该疾病特定阶段的特征。,血清LDH同工酶酶谱的变化规律,心脏疾病 LDH1及LDH2上升，LDH3及 LDH4下降。 急性肝炎 LDH5明显升高，随病情好转 而逐渐恢复正常。 慢性肝炎 一般处于正常范围，部分病例可见LDH5有所升高。 肝硬变 LDH5,LDH1和LDH3均升高。,同工酶的性质,由于同工酶一级结构的不同，因此分子量、pI、Km、物理化学性质、免疫性质、电泳行为等方面都表现出差异。 可以用电泳的方法对它们进
13、行分离。,四、 抗体酶,既是抗体又具有催化功能的蛋白质.,本质是免疫球蛋白(immunologlobulins) 人工的方法使其获得了酶的属性，所以又称为催化性抗体(catalytic antibody)。,抗体蛋白的特性,酶与抗体这两种蛋白质之间尽管功能不同，但它们与各自的配基(酶-底物、抗体-抗原)的结合特性，如结合方式、动力学过程等都非常相似。 从20世纪60年代起，有人开始了对抗体进行修饰，并使其获得酶的属性的研究。,核酶（Ribozyme) :具催化活性的RNA。核酶的发现:1982年Cech等发现四膜虫26S rRNA前体具有自我剪接(self-splicing)功能，并于1986
14、年证明其内含子L-19 RNA具有多种催化功能。此后陆续发现多种具有催化功能的RNA，底物也扩大到DNA、糖类、氨基酸酯。,五、核酶,Altman发现RNase-P的蛋白部分不具催化功能，而RNA部分在有足够浓度Mg2+存在下，能起核酸水解酶的作用。 证明了核酸既是信息分子，又是功能分子.,核酶的催化性质,RNA作用于RNA； 核酸酶催化的反应主要包括:水解反应(RNA限制性内切酶活性)，连接反应(聚合酶活性)和转核苷酰反应等； 最近核酸酶的其他作用底物也已被发现，如多糖、DNA以及氨基酸酯等。,核酶的研究中的两个问题,核酶催化效率太低 由于核酶本身是RNA，很容易被核酸水解酶(RNase)所
15、破坏,因此，要将核酶应用于体内阻断基因表达或作为抗病毒的临床药物，还要做大量的研究工作。,酶的作用机制,酶的催化作用，过渡态，活化能 中间产物学说 决定酶作用专一性的机制 使酶具有高催化效率的因素,一 酶的催化作用与分子活化能,化学反应自由能方程式G =H -TS,（ G是总自由能的变化， H 是总热能的变化，S是熵的变化）,当G0，反应不能自发进行。 当G0，反应能自发进行。,活化能：分子由常态转变为活化状态所需的能量。是指在一定温度下，1mol 反应物全部进入活化状态所需的自由能。,促使化学反应进行的途径： 用加热或光照给反应体系提供能量。 使用催化剂降低反应活化能。,酶和一般催化剂的作用
16、就是降低化学反应所需的活化能，从而使活化分子数增多，反应速度加快。,酶与底物间的作用,酶的作用机制,二. 中间产物学说：,1、学说认为：当酶催化一化学反应时，首先 E和 S结合形成中间产物 ES，然后它再分解成产物P并释放酶E。,S + E ES E + P,酶的作用机制,2、中间产物,1）中间产物比底物需较少的活化能就可分解成产物并放出酶。 2）ES 决定酶促反应速度。 3）中间产物形成的实验依据： 1.同位素32P标记底物法（磷酸化酶与葡萄糖结合）； 2.吸收光谱法（过氧化物酶与过氧化氢结合）。,酶的作用机制,三、决定酶作用专一性的机制,（一）锁钥学说：1894年E.Fischer 提出：
17、S分子或其一部分像钥匙一样楔入E活性中心部位。此学说强调E与S结构互相吻合(刚性模板)。,酶的作用机制,（二）诱导契合学说,1958年Koshland 提 出：当E与S接近时， E蛋白受S分子的诱 导，其构象发生有 利于S结合的变化， E与S在此基础上互 补契合、进行反应。,酶的作用机制,四. 使酶具高催化效率的因素：,1. 邻近定向效应：S分子向E活性中心靠近，且趋向E催化部位，使活性中心这一局部区域S增加，并使S分子发生扭曲，易于断裂，降低反应所需活化能。从而加快反应速度。,2.“张力”和“形变”：,X衍射证实：E使S分子中敏感键中某些基团的电子密度变化，产生电子张力，使其发生变形，更易于
18、断裂。,酶高效的因素,A：S变形 B：S和E都变形,3. 酸碱催化：,指E分子上某 些基团作为质 子供体和质子 受体对S进行 （广义的）酸 碱催化。,1、醛的水合作用 2、肽的水解作用,酶高效的因素,4. 共价催化：,E分子中的亲核基团提供电子，对S中亲电子的碳原子进行攻击，生成ES使反应活化能降低，S可越过较低的能垒而形成产物。,酶高效的因素,酶促反应动力学,一、酶活力的测定：1. 酶活力（酶活性enzyme activity): ：指酶催化一定化学反应的能力。用酶所催化的某一化学反应速度的快慢来表示酶的含量和存在。 酶促反应速度的测定： （1）测定单位时间底物的消耗量 （2）测定单位时间产
19、物的生成量,2.表示方法：,（1）、酶活力单位（active unit, U, I.U ）：特定条件下（25 ），在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量。 （2）、酶的转换数（katal，kat）：在最适条件下（30 ）,每秒钟可使1mol底物转化的酶量。1 kat = 6107 I.U,酶促反应动力学,（3）、酶的比活力：,指每mg酶蛋白所具有的酶活力，一般用U/ mg蛋白表示。 （4）、用反应初速度（ v ）来表示：测单位时间内、单位体积中底物减少或产物增加量来表示浓度/单位时间.,酶促反应动力学,二、影响酶促反应速度的因素,酶促反应动力学是研究酶促反应的速度及影响此速度的各种因素的科学。 1
20、.酶浓度对酶作用的影响在底物足够过量，不含抑制酶活性的物质及其他不利于酶发挥作用的因素时V=k E,酶促反应动力学,（二）酶浓度对酶作用的影响,在有足够底物和其他条件不变的情况下：v = k E 本人认为不完善v0 = k E 原因： 1.逆反应速度增加 2.酶会因环境因素的影响而失活 3.产物成为酶的抑制剂,2 底物浓度对酶作用的影响,一级反应v = k S,零级反应v = k E,米氏方程,Michaelis & Menten根据中间产物学说推导出表示酶促反应中底物浓度与反应速度关系的公式称米氏方程。 米氏方程：,酶促反应动力学,v=酶反应速度 Vmax=最大反应速度 S=底物浓度 Km=
21、米氏常数,Michaelis 与 Menten 发展出酶动力学,米氏方程的推导,根据中间产物学说：式中K1,K2,K3分别为各反应常数，可知： ES形成速度= K1 ESES分解速度=(K2, + K3 )ES 当反应达恒稳态时,二速度相等,即:K1 E S =(K2, + K3 ) ES,酶促反应动力学,整理并令：由于E 与ES之和为总的酶浓度Et ,即:Et= E + ESE = EtES 将代入:,(EtES),S,Km,酶促反应动力学,整理得:酶促反应速度由ES决定,而= K3 ES ES= 将代入整理得:,此时达到最大反应速度Vmax:Vmax= K3 Et 将代入,得米氏方程:,当
22、S 升高,所有E为S所饱和时,即: Et =ES,Vmax,酶促反应动力学,米氏方程的变化：,a、 Km S 时： =VS/ Km 初速度与S成正比的一级反应。 b、若SKm 时： =V 零级反应 c、若S = Km 时：=1/2V,酶反应速度与S的关系,米氏常数Km的意义,a、概念：反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。 b、单位：mol/L 或 mmol/L c、意义： Km是酶的特征性物理常数。只与E性质有关，与E无关；测Km可鉴别酶。 在一定条件下某酶对某一底物有一定的Km值。因此，测某酶的Km数值，可鉴别酶。,酶促反应动力学,同一E有几个S就有几个Km，Km最小的为最适S或天然S。
23、 Km大，E与S亲和力弱； Km小， E与S亲和力强。 d、实际用途：1）可由所要求的V求S； 例：求反应速度达最大反应速度99%时的底物浓度2）根据已知S求该反应V。,99%V=,VS,Km +S,=,S,99Km,酶促反应动力学,Vmax是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。Vmax=K3 E，如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算酶的转换数，即动力学常数K3。,Vmax的意义,测米氏常数Km和Vmax的方法：,将米氏方程两侧取倒数，以1/对1/S作图得直线。 得Lineweaver-Burk方程：,Lineweaver-Burk作图法 （双倒数作图法）,Km求法:1、量截距；2、
24、量一个截距求斜率,酶促反应动力学, Hanes作图法,在林-贝方程的基础上，两边同乘S,S/ V =Km/ Vmax + S/Vmax,Eadie-Hofstee作图法,在林-贝方程的基础上，两边同乘V .Vmax,3.温度对酶作用的影响,在一定范围内（0-40）E活性随温度上升而加快； 温度达到一定高度（60以上）E活性不再增高，反而下降。,酶的影响因素,(1)、酶促反应最适温度 酶促反应速度达到最大时的温度。,因E种、E源不同而异。 (2)、温度影响酶促反应的机理： 1）低于最适温度：反应速度随温度上升而加快； 2）高于最适温度：E蛋白随温度上升而变性失活。,酶的影响因素,例1、 蔬菜干制
25、 (霸王花、黄花菜) 酶促褐变条件：酚酶、酚类底物、O2 例2、 加工豆奶 豆腥味产生条件：脂氧化酶、油脂、O2 例3、 加工绿茶 工艺：鲜叶 杀青 揉捻 干燥 红茶加工工艺：鲜叶 萎雕 揉捻 发酵 干燥,豆浆与牛奶相比，有5大优势,1 含植物性保健成分，包括大豆异黄酮、大豆皂甙、大豆多糖、大豆低聚糖、其他多酚类物质等。这些对于预防多种慢性疾病均有帮助。 2 含维生素E和不饱和脂肪酸，饱和脂肪酸含量低，不含有胆固醇。 3 含有膳食纤维。豆浆中以可溶性纤维为主，豆渣中有大量不可溶纤维。牛奶中是没有膳食纤维的。 4 热量偏低，蛋白质和脂肪比例是2：1，而牛奶是1：1。 5 作为植物性食品，大豆的污
26、染危险相对于动物性食品要小得多。毕竟豆子难以作假，自己打豆浆也避免了任何加工中的可能污染和掺假环节。豆浆与牛奶相比，也有不及之处，一则钙含量低，二则不含有维生素AD，三是维生素B2和B6的含量明显低于牛奶。,4.pH对酶作用的影响,(1)、最适pH：超出则酶活下降。 植物、微生物：最适pH： 4-6.5 ； 动物： 最适pH：6.5 -8 为酶特性之一、受各种因素影响。,酶的影响因素,(2)、 pH影响的机理：,1）pH影响E活性中心及附近有关基团的解离，使之易或不易与S 结合； 2）pH影响S的极性基团，从而影响这些基团与E的结合； 3）过酸、过碱可使酶变性失活。,酶的影响因素,5.激活剂对
27、酶作用的影响,(1)、概念：凡能提高酶活力的物质称激活剂。 (2)、种类： 1）无机离子的激活作用：作为活性部位的组分；作为辅助因子的组分； 如：Mg2+、Ca2+、Co2+、Mn2+等。,酶的影响因素,2）中等大小的有机分子：,包括还原剂（使二硫键还原）、EDTA（去除重金属杂质）等。3）蛋白质类大分子物质：激活酶原、解除抑制剂的抑制作用。 如：pr与重金属离子结合，解除抑制剂的抑制。,酶的影响因素,6.抑制剂,(1)、概念： 抑制剂（inhibitor, I ) ：凡与E结合后，使E的活性部位结构和性质改变而引起E活性降低或丧失的物质。 抑制作用(inhibition)：任何使E活性降低或
28、丧失的作用.,酶的影响因素,(2)、抑制作用的类型,1）不可逆抑制：通常 I 以较牢固的共价键与E蛋白中的基团结合，引起E失活。 透析、超滤不能除去 I 。,酶的影响因素,不可逆抑制剂,有机磷、烷化剂：作用于Ser、Thr的-OH；如：有机磷农药、二战毒气等作用于催化乙酰胆碱水解的胆碱酯酶，引起一系列神经中毒症状；临床用羟肟酸缓解症状。 常用农药:有机磷农药、有机氯农药、有机汞农药 抗菌素:,酶的影响因素,青霉素分子,内酰胺环与噻唑啉环融合,N-(2-羟基）苯氧乙酰胺做前体,2）可逆抑制,I与E的结合往往是非共价键结合，是可逆结合，可用透析法除去I。 可逆抑制根据I与S的关系分三类：竞争性抑制
29、：非竞争性抑制：反竞争性抑制：,酶的影响因素,竞争性抑制,I 在分子结构上与S类似， I与S竞争性 与E结合，使酶促反应速度下降。但，若S高，则此效应减小。,酶的影响因素,反应通式：,E + S S E E+P+IEI 特点：I与S结构类似；抑制程度取决于 I和S以及与E的亲和力；可通过增加S来减轻或解除抑制。,竞争性抑制机理：,I占了S的位子；E与I或S结合后构 象发生变化， 产生不利于另一个结合的构象。,应用：,药物设计的依据。 如磺胺、,对氨基苯甲酸(PABA),对氨基苯磺酰胺,磺胺类药物的抑菌机制： 与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶,四氢叶酸（FH4 ） 的结构与合成,蝶呤+对氨基苯甲
30、酸+L-谷氨酸 二氢叶酸,四氢叶酸,二氢叶酸合成酶,二氢叶酸还原酶,非竞争性抑制,S与I可同时结合在酶的不同部位上，形成ESI，因此酶活性降低。 此类 I 与E活性中心以外的基团结合，其结构可能与S无关。,酶的影响因素,特点：通过I与E的结合，,改变酶结构和性质； Vmax减小； 抑制取决于 I。,非竞争抑制的通式,反竞争性抑制作用：抑制剂必须在酶与底物结合后才能进一步形成ESI复合物。,km,km,三者动力学区别,竞争性抑制：Vmax不变；Km增大，增加S可克服。 非竞争性抑制： Km 不变； Vmax减小，增加S不可克服。反竞争性抑制: Vmax减小;Km减小,7.别构效应,(1)、概念：
31、亦称变构酶，是一类重要的调节酶。一般为寡聚酶（两个以上亚基组成），易发生构象改变。其上有二个重要部位：活性部位和别构部位,Asp转氨甲酰酶,(2)别构酶结构的部位,1）活性部位：负责E对S的结合与催化； 2）别构部位：可结合调节物，负责调节酶反应速度 。这两部位可在不同亚基或同一亚基不同部位上。,酶活性的调节,(3)、别构效应：,1）概念：当S或S以外的物质与E的相应部位非共价结合后，通过E分子构象的变化影响E催化 活性的效应。,酶活性的调节,2）别构效应剂,引起别构效应的物质。分两种： 别构激活剂：正协同，加快反应速度的，多为S 。如：ATP对ATCase(天冬氨酸转氨甲酰酶)。P116 别
32、构抑制剂：负协同，减慢反应速度，多为代谢终产物。如：CTP对ATCase。,酶活性的调节,别构酶通常为代谢途径第一个酶或分支点上第一个酶。,3、别构酶动力学曲线：,大多数别构酶不符合米氏方程。,酶的应用与发展,分离纯化 酶的应用,一、酶的分离纯化,（一）目的：1、为了研究酶的理化性质或鉴定酶；2、作为生化试剂或药物。 （二）根据酶在体内作用的部位分：胞外酶、胞内酶； （三）步骤：选材破碎抽提分离纯化保存,酶在细胞中的分布：胞外酶：水解酶类，易收集，不必破碎细胞，缓冲液或水浸泡细胞或发酵液离心得到上清液即为含酶液。胞内酶：除水解酶类外的其它酶类，需破碎细胞，不同的酶分布部位不同，最好先将酶存在的
33、细胞器分离后再破碎该细胞器，然后将酶用适当的缓冲溶液或水抽提。,原则：在增加酶得率和纯度的同时，尽可能避免高温、过酸、过碱、剧烈的震荡及其它可能使酶丧失活力的一切操作过程。尽最大可能保存酶的活力。 分离提纯： 1.酶的抽提：将酶溶解出来就称为抽提。胞外酶：固体培养的菌体加水或适当缓冲溶液浸泡过滤即可。液体培养的菌体将发酵液离心分离除去菌体收集离心液即可。胞内酶：先破碎细胞，再用水或适当的缓冲溶液抽提。,2.酶的纯化：纯化的关键是维持酶的活性，因为随着酶的逐渐提纯，一些天然的可保持酶活力的其它成分逐渐减少，酶的稳定性变差，所以整个纯化过程应维持低温。 （1）酶的沉淀方法：与蛋白质的沉淀方法相同，
34、常用： A盐析法：常用硫酸铵盐析，有分段盐析和一次性盐析两种方法。 B有机溶剂沉淀法：用乙醇、丙酮等。应低温操作，溶剂少量分批加入。 （2）酶的纯化方法： 有吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。 3.酶的结晶： 纯化以后的酶液再次沉淀，仍采用沉淀法。 4.酶的保存：一般在-20以下低温保存。,注意：低温；加EDTA，防止金属离子使酶失活；加巯基乙醇，避免酶蛋白巯基氧化失活；不要过度搅拌。应常测酶活。,酶的分离纯化,酶的应用,工业上酶应用的优点： 专一性高，副反应很少，后处理容易。 催化效率高，酶用量少。 反应条件温和，可以在近中性的水溶液中进行反应。 4.酶的催化活性可以进行人工
35、控制。 缺点： 1.酶易失活，酶反应的温度、 pH 、离子强度等要很好控制。 2.酶不易得到，价格昂贵。 3.酶不易保存。,1、酶在工业中的应用不断扩大。 酶在食品工业的应用： 1)、酿造米酒 浸米蒸饭拌曲装缸糖化发酵压榨成品酒曲 2)、果葡糖浆酶法生产：液化酶 糖化酶 葡萄糖异构酶 淀粉乳-糊精-葡萄糖-果葡糖浆 3)、果汁澄清：果胶酶果汁-澄清果汁 酶在轻工、化工领域的应用： 1)、蛋白酶用于皮革工业的脱毛。 2)、-淀粉酶、纤维素酶用了牛仔服的生产。 3)、碱性蛋白酶、碱性脂肪酶应用于洗涤剂的生产。 2、酶在医学中应用 1)、酶在疾病诊断中的地位越来越重要。 2)、酶作为治疗疾病的药物在
36、临床上的应用不断扩大。,某些作为药物使用的酶酶 临床应用淀粉酶 治疗消化不良菠萝蛋白酶 治疗手术后的浮肿、炎症、伤口化脓、消化不良尿激酶 溶解血栓左旋糖酐酶 预防龋齿天冬酰胺酶 治辽癌症 3. 工具酶在生物学研究中的应用利用酶的专一性催化作用，可以进行生物大分子的分析、改造和 生物物质的处理。用于这样目的酶称为-工具酶。 例如：各种 蛋白酶 已用于蛋白质分子的一级结构分析。DNA聚合酶 已用于DNA一级传结构分析。各种 DNA限制性内切酶 能将地断裂DNA成为片断，这是基因工程能够实现的重要前提之一。在处理细菌细胞时，可以用 溶菌酶、纤维素酶 等破碎细胞。,二、酶工程,酶工程：指酶制剂在工业上
37、的大规模生产和应用。 1、化学酶工程：由酶学与化学工程技术相结合而形成。通过化学修饰、固定化处理、甚至化学 合成法等手段改善酶的性质，以提高催 化效率及降低成本。,酶学发展及动向,固定化酶,概念：将分离纯化得到的水溶性酶用物理或化学的方法处理，使酶与载体（琼脂糖、聚丙烯酰胺等）连接，作成具催化活性的水不溶的酶。 应用：此技术可提高酶的稳定性和使用寿命；使反应过程连续化、自动化，简化工艺；提高产品质量。此技术以广泛用于工农业生产、医药卫生、环境保护、生物化工等方面。,酶学发展及动向,某些作为药物使用的酶 固定化酶的优点： 1)、重复使用 2)、不污染产物 3)、有利于连续化和自动化生产 4) 、
38、节约能源和设备投资 缺点：1)、酶经固定化后活力降低 2)、对大分子底物和气体底物不利. 酶固定化方法： 1)、吸附法 2)、共价偶联法 3)、包埋法 4)、交联法固定化 酶的应用：1)、固定化葡萄糖异构酶将葡萄糖转变为果糖 2)、固定化木瓜蛋白酶澄清啤酒,2、生物酶工程：,是在化学酶工程基础上发展起来的，是以酶学和DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物。包括： 1）用DNA重组技术大量生产酶； 2）对酶基因进行修饰，产生突变酶； 3）设计新的酶基因，合成自然界不曾有过的、性能稳定、催化效率更高的新酶。,酶学发展及动向,1、酶能加速化学反应的进行是由于哪一种效应A、向反应体系提供能
39、量 B、降低反应的自由能变化C、降低反应的活化能 D、降低底物的能量水平E、提高产物的能量水平 2、已知某种酶Km值为0.05mol/L，试问要使此酶所催化的反应速度达最大反应速度的80%时底物浓度应是多少A、0.04mol/L D、0.05 mol/LB、0.8 mol/L E、0.1 mol/LC、0.2 mol/L,习 题,习 题 3、一个酶作用与多种底物时，其天然底物Km值应是A、增大 B、与其他底物相同 C、最小D、居中间 E、与Km相同 4、丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制效应是A、Vmax降低，Km值不变 B、Vmax降低，Km值降低C、Vmax不变，Km值增加 D、Vmax不变，Km值降低E、Vmax降低，Km值增加,习 题,5、反应速度为最大反应速度的80%时，Km等于A、S B、1/2S C、1/4S D、0.4S E、0.8S ,答案,1、C 2、C 3、C 4、C 5、 C,习 题,名词解释 抗体酶 酶的活性中心 固定化酶 同工酶 酶原 米氏常数 简答题： 1、试述使用酶作催化剂的优缺点,
