1、总 RNA提取的原理、步骤1.原理及方法（异硫氰酸胍-酚-氯仿 一步法）TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使 RNA与蛋白质分离，并将 RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使 RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样 RNA与仍留在有机相中的蛋白质和 DNA分离开。水相层（无色）主要为 RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。2.简易步骤细胞或组织，加入 0.4ml TRIZOL试剂后匀浆室温静置 5分钟加入 1/5 TRIZOL试剂体积量的氯仿，剧烈震荡混匀室温静置 5分钟，12000g
2、4离心 l5分钟将上清液转移至新的离心管中，加入与上清液等体积的异丙醇，颠倒混匀室温静置 10分钟，12000g 4离心 l0分钟，弃上清向沉淀中加入 1ml的 75%乙醇清洗沉淀，12000g 4离心 5分钟弃上清保留沉淀，干燥沉淀物溶解于 11l 的 DEPC处理水中注意：以上操作应在生物安全柜内完成，以防止污染。注意事项 全程配戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染 RNA的抽提并成为 RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提 RNA，避免使用公共仪器所导致的 RNA酶交叉污染。在 TRIZOL中，RNA 是隔离在 R
3、NA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无 RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在 150C的烘箱中烘烤 4小时。塑料器皿可以在 0.5 M NaOH中浸泡 10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。用 TRIZOL抽提 RNA时要戴手套和护眼罩。避免接触皮肤和衣服。在化学通风橱完成操作。避免呼吸道吸入。如无例外，所有的操作应该在 15 -30C的条件下完成，试剂亦在 15 -30C的条件下。75%乙醇(用 DEPC处理过的水配制：将水加入无 RNA酶的玻璃瓶中，加入 DEPC至0.01% (v/v)。放置过夜并高压灭菌。)每 50100 mg组织加 1ml的 TRIZOL
4、。匀浆化时组织样品容积不能超过 TRIZOL容积的10%。单层生长的细胞 直接往直径 3.5 cm的培养板中加入 1ml的 TRIZOL溶解细胞，通过移液管分次移出细胞裂解物。依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定所需的 TRIZOL量（每 10 cm2加 1 ml）。当 TRIZOL量不足时可导致抽提的 RNA中污染有 DNA。在匀化后和加入氯仿之前，样品可以在6070C 保存至少一个月。RNA 沉淀（RNA洗脱）溶于 75%的乙醇在 28C至少可以保存一周，在520C 下至少可保存一年。逆转录 cDNA及注意事项如果 cDNA当天不使用，则要保存在-20或-70。RNA逆转录成 cDN
5、A操作流程简图如下：（在冰盒上操作）1.将提取的 RNA溶解于 11 l DEPC-t 净化水中， 加入 1ul引物，1ul 模板 RNA，1uldNTP轻微震荡后离心 3-5秒。2.在 PCR扩增仪上 70 5 分钟。3.冰上冷却 1分钟，并短暂离心，向反应体系中加入 5reaction buffer 4l，RibolockTM Ribonuclease inhibitor (20 u/l) 1l，10 mM dNTP mix 2l。4.轻微震荡后离心 3-5秒，在 PCR扩增仪上 37 5 分钟。5.向反应体系中加入 RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcriptase (200u/ul) 1l，在PCR扩增仪上 42 60 分钟进行逆转录，70 10 分钟灭活逆转录酶。6.收集反应产物，冰上冷却
