1、提取细胞 RNA 的步骤：1) 六孔板每孔细胞中加入 1ml Trizol，冰上放置 5min，枪头吹打。2) 将各孔裂解液吸到 1.5 ml EP 管中，加入氯仿 0.2ml/管，用力振摇 15s。1530下孵育2-3min，离心（4，12，000g，15min）。3) 离心后液体分为三层（上层无色水样层为 RNA，中层白色为 DNA 和底层红色为蛋白质），小心吸取上层无色液体移入一新的 EP 管中。4) 加入等体积异丙醇，0.40.5ml，混匀，15-30下孵育 1030min，离心（4，12，000g，10min）。其中如果加入等体积异丙醇后，置于试管架上用 PE 手套密封后，放于4冰箱
2、中，沉淀 30min 效果更好。5) 去上清，沉淀加入 75乙醇 1ml，漩涡振荡 30s，离心（4，7，500g，5min）。6) 小心去上清，管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥 3-5min。最好是用枪头吸取上清，尽量除去。7) 加入 20ul DEPC 水溶解，分装 5ul/管，-70冰箱保存。8) 细胞总 RNA 的鉴定：0.9-1.2琼脂糖电泳鉴定细胞总 RNA，观察出现条带及各条带亮度。紫外分光光度计测定：分别测定细胞总 RNA 在 260nm 和 280nm 处的光密度值(OD),并计算 RNA 的含量和纯度。1、实验目的提取人体细胞的总 RNA 和 mRNA。2、本实验所需试剂1）
3、、CNE-2 细胞及培养细胞的一系列条件，2）、PBS 缓冲液， TRIZOL 试剂，3）、DEPC 处理过的水、大、中、小 Tip 及 1.5 ml EP 管,4）、新的氯仿、异丙醇和乙醇，5）、mRNA 分离试剂盒：Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN。6）、新配的电泳缓冲液，专跑 RNA 的琼脂糖（Agarose）。3、实验流程3.1 细胞总 RNA 的提取1）、6 孔板细胞（CNE-2）汇合度为 90-100%时，取出无菌室，去其上清，用 PBS 洗两次后，每孔加 TRIZOL 试剂（Gibco 公司） 1 ml，摇匀，无菌罩内消化
4、3-5 分钟（观察：液体变粘稠，细胞脱壁）。2）、将各孔内消化好的细胞裂解液吸到一 DEPC 处理过的 1.5 ml EP 管中，加新开的氯仿0.2 ml，轻摇 15 秒。3）、室温静置 2-3 分钟后，12000 rpm，15 min，4，离心。然后取上清无色水相（约0.6 ml）到 EP 管（DEPC 处理过），加 0.5 ml 新开的异丙醇，室温下静置 10 分钟。4）、12000 rpm，10 分钟，4，离心。观察总 RNA 在管底的白色沉淀，弃去上清（小心别丢了沉淀），75%乙醇 1.0 ml 洗涤（用 DEPC 水新配制）后，7500 rpm，5 min，4离心。5）、去上清，点离
5、，用小 Tip 吸干液体。气干沉淀 5-10 分钟， DEPC 处理水 20-30 ul 加入，中枪打匀，55-60水浴 10 分钟溶解总 RNA，测 OD 值。6）、电泳。3.2 从总 RNA 中分离 mRNA（Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN）1）、取上述提取的总 RNA 若干（少于 0.25 mg）到一个新的无 RNase 的 EP 管中，用无RNase 的水定容到 250 ul。2）、加入 Buffer OBB 250 ul, Oligotex Suspension 15 ul。用 Tip 打匀或用手弹匀。3）、70水浴，3 分钟
6、（裂解 RNA 的二级结构）。4）、20-30条件下，静置 10 分钟（让 Oligotex 与 mRNA 结合）。5）、高速离心 2 分钟，小心吸走上清（该上清要保留），留下约 50 ul 的上清在原管里。6）、用 Buffer OW2 400 ul 重悬含 Oligotex/mRNA 复合物的沉淀，然后将这些加到套有1.5 ml EP 管的 SPIN 柱子上，高速离心 1 分钟。7）、将 SPIN 柱子移到一个新的 EP 管上，加 Buffer OW2 400 ul 到柱子，高速离心 1 分钟，丢掉滤过液。8）、将 SPIN 柱子移到一个新的 EP 管上，加 20-100 ul 热的（70
7、）Buffer OEB 到柱子上，用 Tip 来回吸打 3-4 次，高速离心 1 分钟。9）、为保证最大的 mRNA 产量，可再次重复第 8 步。10）、电泳。4、mRNA 的应用：RT-PCR, Northern 杂交，cDNA 文库构建, mRNA 末端快速扩增(RACE)，差异表达(DDRT-PCR)，引物延伸反应(Primer Extension)，体外转录(In Vitro RNA Transcription), RNA 标记(RNA labeling)，RNA 酶保护试验(RNase and S1 Nuclease Protection Assay)，RNA 微注射(RNA Microinjection)
