1、ABI 3500xL 基因分析仪操作流程一、 标准测序反应（一） 质粒测序标准实验流程1对质粒 DNA 的质量和浓度要求 纯度：OD 260/OD 280= 1.62.0，用量：每反应 150300 ng。2测序 PCR 反应 标准反应体系：3测序产物纯化：使用 Edge Bio 收集柱进行纯化。（1 ）离心 850g，3min 柱子，弃掉收集管，换新的 EP 管。（2 ）将待纯化样品加到柱子中间，注意不要加到离心柱侧壁上。（3 ）离心 850g，3min ，弃掉柱子，即得纯化产物。（4 ）取 10 L Hi-Di Formamide 加入 96 孔板中，再加入 10 L 待测样品，振荡混匀离
2、心。（二） PCR 产物测序标准实验流程1 对 PCR 产物的要求纯度：OD 260/ OD280=1.62.0，用量：每反应 10100 ng。强烈建议在测序前，先纯化 PCR 产物。2 PCR 产物的测序 PCR 反应标准反应体系：3 测序产物纯化：方法同上。二、 上机测序（一）启动系统1. 打开电脑，检查电脑右下角处 3500 监控状态是否正常启动。2. 打开 3500 xL 仪器电源，等待仪器自检，指示灯由黄色变为绿色即为自检完成。3. 启动电脑桌面 Data collection software。4. 检查维护提醒：浏览维护提醒，若已完成点击 。5. 检查耗材状态：点击“Refre
3、sh” ，更新后检查仪表盘上各种耗材的状态（POP7、ABC 、 CBC 和毛细管） ，若指示针在可用范围内则可继续，若在指示针在红色区域中，则需更换耗材后再继续。6. 仪器预热：点击仪表盘上的“Start Pre-heat”按钮预热炉子和泳道。（二）放置待测样品1. 检查确保橡胶隔板均通透后，将其小心盖在加有待测样品的 96 孔板上，注意孔对孔盖好。2. 将板子放入板架中，盖好固定盖，确保所有孔都一一对齐，即组装好测序板子。3. 按仪器的 TRAY 按钮，使托盘出仓，之后将组装好的板子放入自动采样器中，注意有标记的一侧面对操作者。（三）创建平板1. 点击 Create Plate From
4、Template，在弹出对话框中选择模板 Std_Seq_Array_xL_POP7，点击 Open，输入详细的平板信息，包括 Name, Number of Wells, Plate Type, Capillary Length, Polymer。一般详细如下。1. 点击屏幕下方的 Assign Plate Contents。（1 ） 输入各个孔的样品名称等信息，Results group：输入结果的保存路径。（2 ） 选中下面控制面板上 Assay，Filename convention，Results group 三个项目。（3 ） 点击 Link Plate for RunOK。2.
5、检查屏幕上显示的各种信息，确定正确无误后点击 Start Run，即启动运行。（四）监控运行仪器正在运行时，可在软件中监控运行情况。1. 可查看选中的单孔或某一排的运行情况，查看 Instrument Run Views and Flags 中各项：EPT（电流、电压、温度） ，Array 中可查看峰图。2. 可编辑进样列表：重复进行，改变次序，删除进样，终止进样等操作。3. 启动、暂停或继续运行。（五）查看结果点击 Review Results 即可查看原始的测序结果，分析结果方法见下。三、 分析测序结果1. 打开软件：双击电脑桌面 Sequencing Analysis v5.4 图标。2
6、. 导入结果：点击工具栏中 Add samples 按钮，选择路径，导入待分析的测序结果。3. 分析：Sample manager 中选择分析方法对测序结果进行分析。一般用 BC (baseclling, 将原始结果翻译为对应的碱基序列) 。（1 ） 选中 BC 复选框，点击工具栏中 Start analysis 按钮，即开始分析。（2 ） 分析结束后，结果将自动保存为 ab1 格式文件。（3 ） 点击工具栏中 Analysis report 按钮，可查看结果状态(BC status)，不同颜色代表不同测序结果，可判定本次测序成功与否。（4 ） 选中某样品前 show 复选框，即可查看各样品的
7、详细结果。A sequence 显示碱基序列及其 QV 评分结果。注意：a. 蓝色：High QV = 20+，结果可信；黄色 Medium QV = 15 to 19，需查看峰图，判定结果是否可信；红色 Low QV15，结果不可信。b.此处可选中序列，右键复制即可将结果粘贴保存到 txt 文档中。B Electropherogram 显示电泳峰图及序列。C Raw 显示看到原始电泳图。4. 打印：Sample manager 中选中 P (print)复选框，点击 Start analysis 绿色按钮，即可将测序结果输出为 pdf 格式文档。操作注意事项1. 测序反应：（1 ）模板：测序
8、反应对模板质量要求很高，一般需经纯化才可使用；模板用量也有规定。（2 ）反应体系：一般用标准的反应体系，也可用稀释反应体系（比如序列比较简单时） ，一般 8 倍以内稀释比较可靠。（3 ）反应条件：退火 50和延伸 60时，升降温速度需降低至 1/s，使测序反应充分进行。（4 ）体系配制：反应体系的制备不能在样品制备区和 PCR 区进行，移液器不能混用，否则会造成实验室污染。ABI 3500xl 日常维护1. 毛细管维护：（1 ）每周查看阴极缓冲液的液面，避免毛细管露出液面干燥而失效。若液面下降，可在阴极缓冲液中加入双蒸水，保证毛细管插入液面下。下次电泳前换新的缓冲液。（2 ）防止碰触毛细管针尖
9、，只有在更换新的毛细管时才需打开检测窗口门，之后需在软件中重新校正。包括：A 空间校正，maintainance calibratespeitial，选择 fill 灌胶后开始，选择 no fill 不灌胶直接开始start calibrate。结果判定，所有峰只有一个尖且间距在 15，16 间，峰高比较均一，相差不超过 60%，可接受，完成后要点 Accept 或者reject。B 光谱校正，换新毛细管、不同类型试剂盒、不同类型胶时需做maintainancecalibratespectial ，G5 为片段分析用， Z 为测序用calibrate run，chemistry standar
10、d：G5。完成后需点 Accept。（3 ）若长期不用仪器时，仍需每周给毛细管灌胶一次。 （ fill array with polymer）2. 仪器日常维护：（1 ）可用无尘纸巾、棉签和蒸馏水擦拭仪器表面，勿使用有机溶剂，不能随意搬动仪器。 （2 ）严禁在电脑上安装其他无关软件，不准用 U 盘拷贝数据，只能刻盘。（3 ）长期不用应将 POP7 胶取下加塑料塞放入 4冰箱，用漂洗袋代替。并每周进行一次replenish polymer。 （换新胶袋后和每周一次） 。（4 ）若机器使用频繁应每周用 contridationing regents 清洗灌胶泵(wash pump and chan
11、nels)一次。（5 ） fill array with polymer，换毛细管后或认为灌胶有问题时重新灌。（6 ） shut down ，长期不用时关闭仪器，慎用。（7 ） remove bubbles，排气泡。（8 ）灌胶泵维护每月一次：A，水峰，松开泵上方进口旋钮，用注射器注射纯水 5-10ml，要缓慢注射，洗去水峰中的杂质，结晶。B，拆掉 buffer，胶时可手动洗泵，从泵下方进胶处注射入纯水，也可 contridationing regents 洗泵。4. 操作注意：（1 ）操作时必须戴手套。（2 ） Hi-Di Formamide 为变性剂，操作时需注意安全。（3 ）仪器运行时不能打开仓门，软件运行时勿进行其他软件的操作。
