恶臭假单胞菌.doc

1、微 生 物 学 通 报 JAN 20，2008，35(1)：4549 Microbiology 2008 by Institute of Microbiology, CAS 基 金 项 目 ： 国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 (No. 30470053); 天 津 市 重 点 基 金 资 助 项 目 (No. 05YFJZJC00900) * 通 讯 作 者 ： Tel: 022-23508371; : 收 稿 日 期 ： 2007-05-09; 接 受 日 期 : 2007-06-29研 究 报 告恶臭假单胞菌 TS1138 转化生产 L-胱氨酸的工艺研究刘春琴 1 余养盛

2、1 白 钢 1* 杨 文博 1 陈 宁 2 怀 立 华 2(1. 南 开 大 学 生 命 科 学 学 院 天 津 300071)(2. 天 津 科 技 大 学 生 物 工 程 学 院 天 津 300222)摘 要 : 对 以 DL-2-氨 基 -2-噻 唑 啉 -4-羧 酸 (DL-2-amino-2-thiazoline-4-carboxylic acid, DL-ATC)为 底 物 原 料 , 经 微 生 物 酶 法 催 化 合 成 L-半 胱 氨 酸 , 并 进 一 步 氧 化 和 分 离 纯 化 产 物 L-胱 氨 酸 的 生 产工 艺 和 条 件 进 行 了 研 究 。建 立 了 以

3、 恶 臭 假 单 胞 菌 TS1138 (Pseudomonas putida TS1138)全 细 胞 为 酶源 , 反 复 多 次 催 化 底 物 合 成 L-半 胱 氨 酸 , 并 以 2.0%二 甲 基 亚 砜 (DMSO)为 氧 化 剂 氧 化 生 成 L-胱 氨酸 , 进 而 通 过 0017 型 阳 离 子 交 换 树 脂 纯 化 胱 氨 酸 的 新 工 艺 。采 用 高 效 液 相 色 谱 法 考 察 该 方 法 L-胱 氨 酸 的 总 收 率 可 以 达 到 78.55%, 纯 度 为 99.12%。该 方 法 简 单 高 效 , 解 决 了 酶 稳 定 性 差 不 能 重

4、复使 用 , 而 固 定 化 酶 方 法 繁 琐 成 本 高 的 问 题 , 为 我 国 L-半 胱 氨 酸 和 L-胱 氨 酸 的 生 产 开 辟 一 条 新 途 径 。关 键 词 : 恶 臭 假 单 胞 菌 , DL-ATC, L-半 胱 氨 酸 , L-胱 氨 酸 , 生 产 工 艺Study on L-cystine Conversion Technology by Pseudomonasputida TS1138LIU Chun-Qin1 YU Yang-Sheng1 BAI Gang1* YANG Wen-Bo1CHEN Ning2 HUAI Li-Hua2(1. College

5、of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071)(2. Bioengineering College, TianJin University of Science and Technology, Tianjin 300222)Abstract: A technology of L-cystine production was studied in this paper, which included microbial enzymatic conversion of DL-2-amino-2-thiazoline-4-carboxylic

6、 acid (DL-ATC) to L-cysteine, subsequent oxidization of L-cysteine to L-cystine and its purification. The cells of Pseudomonas putida TS1138 could be repetitively used as the enzyme sources to convert the substrate DL-ATC to L-cysteine. After being oxidated by 2% dimethy-sulforide (DMSO), L-cystine

7、could be harvested and further purified by the positive ion-exchange resin 0017. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) identified the purified L-cystine as having a total recovery of 78.55% and purity of 99.12%. This study demonstrated an efficient and convenient method for L-cystine product

8、ion, which overcame the instability of enzymes, 46 微 生 物 学 通 报 2008, Vol.35, No.1http:/ procedures and high cost of enzyme immobilization as contrasted to the traditional method. All in all, it provides a new approach for industrial production of L-cystine as well as L-cysteine.Keywords: Pseudomonas

9、 putida, DL-ATC, L-cysteine, L-cystine, Production processL-半 胱 氨 酸 是 一 种 重 要 的 含 硫 氨 基 酸 , 广 泛 应用 于 医 药 、食 品 、化 妆 品 以 及 饲 料 工 业 1。目 前 , 工业 上 主 要 通 过 毛 发 酸 水 解 生 产 L-半 胱 氨 酸 。该 工 艺生 产 率 低 , 且 产 生 大 量 刺 激 性 气 体 和 废 酸 造 成 环 境污 染 2。另 外 , 由 毛 发 水 解 法 或 其 它 方 法 获 得 的 含半 胱 氨 酸 反 应 液 , 由 于 其 组 成 复 杂 3, 并 且

10、 半 胱 氨酸 在 水 中 的 溶 解 度 较 高 4, 所 以 要 从 复 杂 的 反 应 液中 分 离 出 高 纯 度 的 半 胱 氨 酸 是 困 难 的 。但 半 胱 氨 酸易 被 氧 化 成 胱 氨 酸 , 而 胱 氨 酸 在 水 中 的 溶 解 度 极 低4, 通 常 利 用 这 一 特 性 可 将 反 应 液 中 的 半 胱 氨 酸 首先 转 化 成 胱 氨 酸 , 沉 淀 析 出 , 然 后 再 将 分 离 出 的 胱氨 酸 电 解 还 原 成 半 胱 氨 酸 5, 从 而 可 获 得 半 胱 氨 酸纯 品 。自 Sano1,6等 发 现 嗜 硫 氮 杂 环 戊 烯 假 单 胞

11、菌(Pseudomonas thiozolinophilum)能 够 把 DL-2-氨 基 - 2-噻 唑 啉 -4-羧 酸 (DL-2-Amino-2-thiazoline-4-carboxylic Acid, DL-ATC)转 化 为 L-半 胱 氨 酸 , 利 用 微 生 物 酶法 生 产 半 胱 氨 酸 已 成 为 人 们 研 究 和 关 注 的 方 向 7。本 实 验 室 自 行 分 离 获 得 一 株 恶 臭 假 单 胞 菌(Pseudomonas putida)TS1138, 并 发 现 其 具 有 转 化DL-ATC 合 成 L-半 胱 氨 酸 的 能 力 8。本 研 究 对T

12、S1138 菌 株 转 化 生 成 的 半 胱 氨 酸 后 的 氧 化 条 件 、分离 纯 化 、产 物 鉴 定 以 及 酶 源 细 胞 的 重 复 利 用 等 方 面进 行 了 初 步 研 究 , 为 微 生 物 酶 法 制 取 L-胱 氨 酸 和 L-半 胱 氨 酸 的 生 产 工 艺 奠 定 了 基 础 。1 材 料 与 方 法1.1 材 料1.1.1 菌 种 : 恶 臭 假 单 胞 菌 (Pseudomonas putida) TS1138, 本 实 验 室 筛 选 获 得 8。1.1.2 培养基 9: 种子培养基 : 葡萄糖 20 g, ATC 3 g, 玉 米 浆 5 g, 尿 素

13、 3 g, NaCl 1.5 g, MnSO4H2O 0.1 g, K2HPO4 3 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, FeSO47H2O 0.01 g, 定容至 1 L, pH 7.5; 产酶培养基: 葡萄糖 30 g, ATC 4 g, 玉 米 浆 1 g, 尿 素 3 g, NaCl 1.5 g, MnSO4H2O 0.1 g, K2HPO4 3 g, MgSO47H2O 0.5 g, FeSO47H2O 0.01 g, 定 容 至 1 L, pH 7.5。1.1.3 主 要 试 剂 和 仪 器 : L-半 胱 氨 酸 和 L-胱 氨 酸 标准 品 为 美 国 Amresco 公

14、 司 产 品 ; DL-ATC 购 自 天 津试 剂 二 厂 ; 高 效 液 相 所 用 试 剂 为 色 谱 纯 , 其 他 试 剂为 国 产 分 析 纯 。发 酵 使 用 上 海 保 兴 的 BIOTECH- 10BGZ 型 发 酵 罐 ; DL-ATC 和 L-胱 氨 酸 的 含 量 检 测采 用 岛 津 LC-10AT 高 效 液 相 色 谱 仪 和 Model 200S ELSD 蒸 发 激 光 散 射 检 测 器 ; 旋 光 度 检 测 使 用 上 海物 理 光 学 仪 器 厂 WZZ-2A 型 自 动 旋 光 仪 。1.2 实 验 方 法1.2.1 酶 源 细 胞 的 获 得 :

15、从 平 板 上 挑 取 一 环 恶 臭 假单 胞 菌 TS1138 接 入 种 子 培 养 基 中 , 28 200 r/min培 养 16 h 后 , 以 1%接 种 量 转 接 到 7 L 产 酶 培 养 基中 , 在 10 L 发酵罐中进行发酵培养, 发酵条件如下: 温度: 29; pH: 6.46.7; 转速: 400 r/min; 通气量: 200 L/h。发酵 16 h, 发 酵 液 于 4 下 6 000 g 离 心 10 min, 弃 去 上 清 液 , 菌 体 用 PBS 缓 冲 液 (0.02 mol/L磷 酸 缓 冲 液, 0.15 mol/L NaCl, pH 7.4)

16、悬浮洗涤, 4, 8000 g 离心 10 min, 重复洗 涤 2 次, 收集菌体称取湿重, 并加入 PBS 制得终浓度为 25%(W/V)的酶源细胞菌悬液。1.2.2 DL-ATC 转 化 反 应 : 150 mL 酶 源 细 胞 悬 液 中加入 300 mL 底物溶液(0.6% DL-ATC, 0.6% K2HPO4, 0.01%羟 胺 , pH 7.58.0), 混 匀 后 置 于 42 恒 温 水 浴中 反 应 2.5 h。转 化 后 离 心 分 离 酶 源 细 胞 及 反 应 液 , 酶 源 细 胞 经 PBS 重 悬 后 用 于 下 一 次 转 化 反 应 , L-半胱 氨 酸

17、的 转 化 液 可 用 于 进 一 步 的 氧 化 实 验 。1.2.3 L-半 胱 氨 酸 和 L-胱 氨 酸 的 含 量 测 定 : 采 用Gaitonde 法 直 接 测 定 溶 液 中 L-半 胱 氨 酸 的 含 量 10。再 将 溶 液 适 当 稀 释 后 与 等 体 积 的 2 mmol/L 1,4-二 硫苏 糖 醇 (DTT)溶 液 混 合 , 经 NaOH 调 节 pH 值 8.0至 8.5, 室 温 下 静 置 1h, 使 溶 液 中 的 L-胱 氨 酸 完 全还 原 成 L-半 胱 氨 酸 后 再 采 用 Gaitonde 法 测 定 其 中L-半 胱 氨 酸 的 含 量

18、, 两 者 之 差 即 为 L-胱 氨 酸 的 含 量 。1.2.4 DL-ATC 和 L-胱 氨 酸 的 高 效 液 相 色 谱 法 检测 : 色谱柱: Nucleosil SA(2504.6 mm), 进样体积: 20 L。流 动 相 : 冰 乙 酸 -三 乙 胺 -水 (0.1: 0.1: 99.8); 流 速 : 0.6 mL/min; 柱 温 : 25 。ELSD 检 测 器 参 数 : 漂 移管 温 度 40; 氮 气 压 力 : 2.8 Bar。1.2.5 L-胱 氨 酸 的 分 离 纯 化 : 取 经 DMSO 氧 化 后的 L-胱 氨 酸 反 应 液 , 上 样 于 0017

19、 型 阳 离 子 树 脂 柱(40 cm 2.6 cm), 流 速 1.5 mL/min。充 分 洗 涤 后 以 1.0 mol/L 氨 水 洗 脱 , 洗 脱 速 度 0.7 mL/min。收 集 洗脱 液 , 并 以 上 述 1.2.3 方 法 检 测 洗 脱 液 中 L-胱 氨 酸的 含 量 。合 并 活 性 洗 脱 峰 , 以 HCl 调 pH 值 至 5.0, 析 出 胱 氨 酸 白 色 粉 末 。过 滤 收 集 上 述 粉 末 , 经 少 量无 水 乙 醇 洗 涤 , 烘 干 后 进 行 纯 度 鉴 定 。1.2.6 胱 氨 酸 的 旋 光 性 鉴 定 : 分 别 称 取 分 离

20、纯 化 后的粉末和标准品各 0.121 g, 溶解于 5 mol/L、12 mL 的盐 酸 中 , 将 溶 液 装 入 旋 光 仪 的 盛 液 管 中 , 进 行 旋 光刘 春 琴 等 : 恶 臭 假 单 胞 菌 TS1138 转 化 生 产 L-胱 氨 酸 的 工 艺 研 究 47http:/ 测 定 , 计 算 其 比 旋 光 度 。 2 结 果 与 分 析2.1 微 生 物 酶 法 转 化 DL-ATC 生 成 L-半 胱 氨 酸的 转 化 效 率采 用 微 生 物 酶 法 单 次 转 化 DL-ATC 后 , 离 心 取 上清 液 , 以 Gaitonde 法 测 得 溶 液 中 L-

21、半 胱 氨 酸 浓 度 为 3.21 g/L (摩 尔 浓 度 0.027 mol/L), 经 计 算 从 底 物 DL-ATC 到产物 L-半胱氨酸的摩尔转 化率达到了96.83%。2.2 L-半 胱 氨 酸 氧 化 条 件 的 考 察2.2.1 氧 化 剂 的 考 察 : 取 一 定 量 的 上 述 转 化 液 , 分别 加 入 不 同 剂 量 的 DMSO 或 H2O2, 用 HCl 调 节 pH为 1.0, 室 温 氧 化 8 h 后 , 再 分 别 测 定 L-半 胱 氨 酸 氧化 率 及 L-胱 氨 酸 生 成 率 。如 图 1 所 示 , 当 DMSO 的浓 度 在 2%, L-

22、半 胱 氨 酸 的 氧 化 率 均 可 以 达 到 97.4%, 而 L-胱氨酸的生成率可以达到 91.6%。而 H2O2 为强氧化剂, 当浓度在 1%以上时 L-半胱氨酸的氧化率均可以接近 99%, 但所得到的胱氨酸会被进一步氧化为磺基丙氨酸 11, 从而导致胱氨酸生成率几乎 为零。图 1 L-半 胱 氨 酸 氧 化 剂 的 考 察Fig. 1 Test of oxidizing agents for L-cysteine以 DMSO 为 氧 化 剂 时 L-半 胱 氨 酸 的 氧 化 率 ()和 L-胱 氨 酸 的 生成 率 (); 以 H2O2为 氧 化 剂 时 L-半 胱 氨 酸 的

23、氧 化 率 ()和 L-胱氨 酸 的 生 成 率 ()Oxidization rate of L-cysteine () and generation rate of L-cystine () using DMSO as the oxidizing agent; Oxidization rate of L-cysteine () and generation rate of L-cystine () using H2O2 as the oxidizing agent.2.2.2 DMSO 氧 化 时 间 及 氧 化 剂 量 的 考 察 : 取 一 定量 转 化 反 应 上 清 液 , 分 别

24、加 入 终 浓 度 为 1%、2%和 3%的DMSO, 调 节 pH 为 1.0, 室 温 氧 化 212 h 后 , 分 别测 定 L-半 胱 氨 酸 氧 化 率 及 L-胱 氨 酸 得 率 。结 果 如表 1 所 示 , 氧 化 时 间 超 过 8 h 以 后 , L-半 胱 氨 酸 的 氧化 率 及 L-胱 氨 酸 生 成 率 均 没 有 明 显 提 高 。而 在 26 h 内 , 3.0%DMSO 的 氧 化 率 明 显 高 于 2.0% DMSO, 但 随 着 时 间 延 长 , 高 浓 度 的 氧 化 优 势 逐 渐 失 去 , 原因 可 能 与 过 量 的 DMSO 也 可 将

25、L-胱 氨 酸 进 一 步 氧化 有 关 11。表 1 DMSO 氧 化 时 间 及 氧 化 剂 量 的 考 察Table 1 Test of oxidizing time and concentration of DMSOTimeCD(V/V)OR/GR( ) 2h 4h 6h 8h 10h 12hOR 64.7 72.1 78.3 81.2 82.4 83.51.0%GR 58.6 69.3 74.5 76.7 77.6 78.2OR 69.4 79.7 87.1 96.7 97.8 97.52.0%GR 64.5 74.3 80.6 90.9 91.4 90.2OR 76.5 87.2

26、94.2 96.8 97.7 96.43.0%GR 73.2 78.9 83.4 85.9 87.1 86.3CD: Concentration of DMSO; OR: Oxidization rate of L-cysteine; GR:Generation rate of L-cystine2.3 酶 源 细 胞 的 重 复 利 用 次 数 的 考 察由 于 假 单 胞 菌 TS1138 中 存 在 L-半 胱 氨 酸 脱 巯基 酶 可 分 解 L-半 胱 氨 酸 为 丙 酮 酸 12, 直 接 影 响 其 产率 , 所 以 在 转 化 反 应 结 束 后 需 要 尽 快 分 离 酶 源

27、 细 胞和 产 物 的 L-半 胱 氨 酸 , 所 回 收 的 酶 源 细 胞 又 可 以 重复 用 于 下 一 次 的 转 化 和 氧 化 实 验 。酶 源 细 胞 的 重 复实 验 结 果 如 图 2 所 示 , 前 6 次 L-半 胱 氨 酸 的 转 化 率与 L-胱 氨 酸 的 生 成 率 均 可 以 在 95 和 80 以 上 , 第 7 次 后 则 迅 速 下 降 , 证 明 同 一 批 酶 源 细 胞 至 少 可以 重 复 利 用 5 次 。图 2 酶 源 细 胞 重 复 利 用 次 数 的 考 察Fig. 2 Test of the repetitive use times o

28、f enzyme source cellsL-半 胱 氨 酸 的 生 成 率 (); L-胱 氨 酸 的 生 成 率 ()Generation rate of L-cysteine(); generation rate of L-cystine().2.4 氧 化 产 物 的 分 离 纯 化收 集 上 述 含 有 L-胱 氨 酸 的 转 化 液 (约 2.7L), 经0017 型阳离子树脂柱吸附, 氨水洗脱, 收集 No. 6-10 洗脱 峰 , 经 HCl 沉 淀 、洗 涤 、烘 干 后 最 终 得 到7.031g L-胱 氨 酸 白 色 粉 末 , 收 率 为 DL-ATC 转 化 为L-

29、胱 氨 酸 最 大 理 论 收 率 的 78.55% (图 3)。48 微 生 物 学 通 报 2008, Vol.35, No.1http:/ 3 0017 型 阳 离 子 树 脂 分 离 L-胱 氨 酸 的 洗 脱 曲 线Fig. 3 Elution curve of L-cystine isolated by 0017 ion exchange resin取 一 定 量 上 述 条 件 所 制 备 的 L-胱 氨 酸 粉 末 溶于 HCl 后 , 采 用 高 效 液 相 色 谱 进 行 检 测 , 与 标 准 品比 对 其 纯 度 达 到 99.12%(图 4)。图 4 HPLC 法 检

30、 测 转 化 液 及 纯 化 后 的 L-胱 氨 酸 含 量Fig. 4 Concentration of L-cystine by HPLC test in the conversion solution and after purificationA: DL-ATC 和 L-胱 氨 酸 标 准 ; B: TS1138 转 化 液 ; C: 纯 化 后 L-胱 氨 酸 。色 谱 峰 分 别 为 , 1: L-胱 氨 酸 (保 留 时 间 5.371 min), 2: DL-ATC(保 留 时 间 6.285 min)A: DL-ATC and L-cystine standards; B:

31、conversion solution of TS1138; C: purified L-cystine. chromatographic peaks: 1: L-cysine (retention time: 5.371 min); 2: DL-ATC (retention time: 6.285 min)2.5 胱 氨 酸 的 旋 光 性 鉴 定纯化后的产物与标准的 L-胱氨酸的比旋光度 D 分别为-226.4 、-229.7, 且与文献报道基本一致 13, 因 此 可 以 确 证 得 到 的 为 L 型 胱 氨 酸 。3 讨 论2002 年 Shiba 等 报 道 了 假 单 胞 菌 B

32、S 菌 株 由DL-ATC 经 酶 法 转 化 生 成 L-半 胱 氨 酸 是 通 过 L-ATC 水 解 酶 水 解 ATC 噻 唑 环 中 C2-S 单 键 , 以 N-氨 甲 酰 -L-半 胱 氨 酸 (L-NCC)为 转 化 的 中 间 产 物 , 再经 N-氨 甲 酰 -L-半 胱 氨 酸 氨 甲 酰 水 解 酶 催 化 生 成 L-半 胱 氨 酸 的 N-代 途 径 (L-NCC 途 径 )14。利 用 自 行 分离 的 恶 臭 假 单 胞 菌 TS1138, 我 们 已 经 进 行 了 较 为系 统 的 酶 学 性 质 和 功 能 基 因 研 究 9, 并 证 明 其 能 通过

33、L-ATC 水 解 酶 水 解 ATC 噻 唑 环 中 的 C=N 双 键 , 生 成 S-氨 甲酰-L-半胱氨酸(L-SCC)中间产物, 再经 S-氨甲酰- L-半 胱 氨 酸 酰 胺 水 解 酶 (L-SCC 酰 胺 水 解 酶 )催 化 生 成 终 产 物 L-半 胱 氨 酸 , 为 不 同 于 N-代 途 径的 S-代 途 径 , 在 转 化 机 理 的 研 究 上 取 得 了 一 定 的 进展 15。在 此 基 础 上 , 本 研 究 对 以 DL-ATC 为 出 发 原料 最 终 制 备 L-胱 氨 酸 的 工 艺 条 件 进 行 了 研 究 , 建 立了 以 假 单 胞 菌 TS

34、1138 全 细 胞 为 酶 源 , 微 生 物 酶 法多 次 催 化 DL-ATC 合 成 L-半 胱 氨 酸 , 并 采 用DMSO 氧 化 水 溶 液 中 的 半 胱 氨 酸 成 胱 氨 酸 , 进 一 步通 过 阳 离 子 交 换 树 脂 分 离 纯 化 L-胱 氨 酸 的 生 产 工艺 , 其 收 率 达 到 78.55%, 纯 度 达 到 99.12%。通 常 在由 酶 催 化 法 进 行 的 反 应 中 , 酶 稳 定 性 差 、易 失 活 , 一 般 不 能 重 复 使 用 , 而 固 定 化 的 方 法 又 或 多 或 少 对酶 活 力 有 一 定 影 响 。本 方 法 简

35、单 高 效 , 有 望 为 我 国L-半 胱 氨 酸 和 L-胱 氨 酸 的 生 产 开 辟 一 条 新 途 径 。参 考 文 献1 Sano K, Yokozeki K, Tamura F, et al. Microbial conversion of DL-ATC to L-cysteine and L-cystine: screening of microorganisms and identification of products. App1 En- vir Microbiol, 1977, 34 (6): 806810.2 杨 金 奎 , 何 璧 梅 . 微 生 物 方 法 生 产

36、 L-半 胱 氨 酸 的 研 究进 展 . 国 外 医 药 抗 生 素 分 册 , 2001, 22 (4): 179183.3 刘 勋 , 陈 时 洪 . 用 氧 化 亚 铜 从 人 发 水 解 液 中 沉 淀 胱 氨酸 的 研 究 . 氨 基 酸 和 生 物 资 源 , 2003, 25(1): 5557.4 沈 同 , 王 镜 岩 . 生 物 化 学 . 北 京 : 高 等 教 育 出 版 社 , 1990, p. 79.5 杨 林 . -半 胱 氨 酸 生 产 存 在 的 问 题 及 解 决 办 法 . 化 工矿 山 技 术 , 1998, 27(1): 3739.6 Sano K,

37、Eguchi C,Yasuda N, et al. Metabolic pathway of L-cysteine formation from DL-2-Amino-2-thiazoline-4-Carboxylic Acid by Pseudomonas. Agric Biol Chem, 1979, 43(11): 23732377.7 Ryu OH, Ju JY, Shin CS. Continuous L-cysteine production using immobilized cell reactors and product extractors. Process Bioche

38、mistry, 1997, 32 (3): 201209.8 刘 忠 , 杨 文 博 , 白 钢 , 等 . 微 生 物 酶 法 合 成 L-半 胱氨 酸 和 L-胱 氨 酸 .微 生 物 学 通 报 , 2003, 30 (6): 1621.9 金 永 杰 , 杨 文 博 , 刘 忠 , 等 . 假 单 胞 菌 L-半 胱 氨 酸 合成 酶 的 纯 化 和 性 质 研 究 . 微 生 物 学 通 报 , 2004, 31(6): 6872.10 Gaitonde MK. A spectrophotometric method for the direct determination of c

39、ysteine in the presence of other naturally occurring amino acids. Biochem, 1967, 104: 627633.11 Marcella C, Claudia E, Pier GR, et al. Oxidation of cystine to cysteic acid in proteins by peroyacids as monitored by immobilized pH gradients. Electrophoresis, 1991, 12 (5): 376377.12 白 钢 , 李 洋 , 余 养 盛 ,

40、 等 . 假 单 胞 菌 TS1138 L-半刘 春 琴 等 : 恶 臭 假 单 胞 菌 TS1138 转 化 生 产 L-胱 氨 酸 的 工 艺 研 究 49http:/ 氨 酸 脱 巯 基 酶 基 因 的 克 隆 与 表 达 . 南 开 大 学 学 报 , 2006, 39 (3): 1215.13 沈 同 , 王 镜 岩 . 生 物 化 学 . 北 京 : 高 等 教 育 出 版 社 , 1990, p. 87.14 Shiba T, Takeda K, Yajima M, et al. Genes from Pseudomonas sp. strain BS involved in t

41、he conversion of L-2-amino- 2-thiazolin-4-carbonic acid to L-cysteine. Appl Envir Microbiol, 2002, 68: 21792187.15 Yu YS, Liu Z, Liu CQ, et al. Cloning, expression, and identification of genes involved in the conversion of DL-2-amino-2-thiazoline-4-carboxylic acid to L-cysteine via S-carbamyl-L-cyst

42、eine pathway in Pseudomonas sp. TS1138. Biosci Biotechnol Biochem, 2006, 70 (9): 22622267.微生物酶法转化生产 L-半胱氨酸的工艺研究赫荣 乔(微 生 物 学 通 报 编 委 会 北 京 100101)L-半 胱 氨 酸 (Cys)侧 链 巯 基 是 构 成 蛋 白 质 活 性 基 团 的 重 要 氨 基 酸 , 在 生 物 化 学 、医 药 、食 品 、饲 料 、化 妆品 等 行 业 具 有 广 泛 的 用 途 , 国 内 外 的 需 求 量 逐 年 增 长 。然 而 , Cys 难 以 通 过 单 纯

43、的 微 生 物 发 酵 来 进 行 生 产 ; 由 于 化 学 合 成 的 步 骤 繁 多 , 也 很 难 进 行 化 学 合 成 。传 统 生 产 方 法 沿 用 毛 发 酸 解 制 取 L-半 胱 氨 酸 , 收 率 低 , 能耗 高 , 水 解 过 程 产 生 难 闻 气 体 及 大 量 废 酸 , 环 境 污 染 严 重 。目 前 , 微 生 物 酶 法 转 化 合 成 L-半 胱 氨 酸 是 国 际 上相 关 领 域 的 先 进 技 术 , 但 该 项 技 术 被 国 外 公 司 垄 断 , 我 国 一 直 为 其 提 供 转 化 底 物 , 其 生 产 的 L-半 胱 氨 酸 产品

44、 又 返 销 国 内 。本 期 发 表 的 “恶 臭 假 单 胞 菌 TS1138 转 化 生 产 L-胱 氨 酸 的 工 艺 研 究 ”一 文 , 介 绍 了 刘 春 琴 、白 钢 等 人 开 展的 工 作 , 他 们 建 立 了 以 假 单 胞 菌 TS1138 全 细 胞 为 酶 源 , 酶 法 多 次 催 化 DL-ATC 合 成 L-半 胱 氨 酸 以 及 分 离纯 化 L-胱 氨 酸 的 工 艺 。采 用 其 实 验 室 分 离 的 假 单 胞 菌 TS1138 菌 株 , 并 且 合 成 了 ATC 作 为 底 物 原 料 , 经 酶法 催 化 水 解 ATC 生 产 L-半 胱

45、 氨 酸 。他 们 对 L-半 胱 氨 酸 的 代 谢 途 径 中 的 关 键 酶 基 因 (L-ATC 水 解 酶 , L-SCC氨 甲 酰 水 解 酶 以 及 L-半 胱 氨 酸 脱 巯 基 酶 )进 行 了 系 统 研 究 , 证 明 了 L-半 胱 氨 酸 合 成 新 的 S-代 途 径 , 实 现 了酶 源 细 胞 的 连 续 化 生 成 。该 研 究 成 果 对 于 国 内 L-半 胱 氨 酸 和 L-胱 氨 酸 生 产 工 艺 的 自 主 创 新 , 在 理 论 和 应 用方 面 都 具 有 参 考 价 值 。关 键 词 ： 恶 臭 假 单 胞 菌 , DL-ATC, L-半 胱

46、 氨 酸 , L-胱 氨 酸 , 生 产 工 艺参 考 文 献1 刘 春 琴 , 余 养 盛 , 白 钢 , 等 . 恶 臭 假 单 胞 菌 TS1138 转 化 生 产 L-胱 氨 酸 的 工 艺 研 究 . 微 生 物 学 通 报 , 2008, 35(1): 4549On the Technique for L-cystine Conversion by Pseudomonas putida TS1138HE Rong-Qiao(The Editorial Board of Microbiology, Beijing 100101)Keywords: Pseudomonas putida, DL-ATC, L-cysteine, L-cystine, Production process主 编 点 评