1、HIV 病毒扩增1目的本作业指导书规定了 HIV-1 复制的实验程序和相应操作。2适用范围适用于 BSL-3 实验室中 HIV-1 的复制。3职责BSL-3 实验室内实验操作人员严格按照要求执行。4作业程序4.1 样本采集、送检和保存抗凝外周血全血，抗凝剂使用 ACD、CPD、肝素或 EDTA。血量要求：成人或儿童至少 1020ml，婴幼儿 12ml。全血样品必须在离体 8h 以内处理，样品处理之前需室温保存。4.2 设备和材料4.2.1 生物安全柜（生物安全二级）4.2.2 37及 56水浴箱4.2.3 离心机（转速可达 1500g；需要有水平转头及 O-环密封罩）4.2.4 普通光学显微镜
2、 4.2.5 CO2 孵箱（37 1，恒湿，5% CO 2）4.2.6 10-100ul 100-1000ul 加样器及配套无菌 Tip 头4.2.7 细胞计数板4.2.8 T-25 细胞培养瓶4.2.9 15 及 50ml 离心管4.2.10 10ml 移液管4.2.11 冻存管4.2.12 细胞冻存盒4.3 试剂4.3.1 磷酸盐缓冲液（PBS ）或 Hanks 平衡液（HBSS）：无钙镁离子；室温保存。注意生产厂商注明的有效期；或者启用 1 周后废弃。4.3.2 淋巴细胞分离液（Ficoll 分离液）4.3.3 青霉素和链霉素4.3.4 胎牛血清（FBS）4.3.5 RPMI 1640
3、培养液4.3.6 人重组白细胞介素 2（rIL-2）4.3.7 台盼兰染液4.3.8 植物血凝素（PHA）4.3.9 聚凝胺（polybrene）4.3.10 二甲基亚砜（DMSO）4.4 实验准备4.4.1 RPMI 1640 完全培养液：含 10%FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml 青霉素和 100ug/ml 链霉素。使用前，须预热至 37 度。4.4.2 聚凝胺（pb）：使用终浓度为 2ug/ml。4.4.3 人重组白细胞介素-2（rIL-2）：使用终浓度为 20U/ml。4.4.4 植物血凝素（PHA）：使用终浓度为 3 ug/ml。4.4.5 准备废物罐，废液缸等物品。4.
4、4.6 登记样品编号。4.5 实验操作4.5.1 HIV 阴性血 PBMC 的准备4.5.1.1 将 HIV 阴性液转移到 50ml 或 15ml 离心管中，400g，24C ，离心 10 min。4.5.1.2 吸取血浆并分装冻存。4.5.1.3 用 PBS 将剩余血液稀释到原体积的 2 倍。4.5.1.4 在一新的 50 或 15ml 离心管中加入 1 倍体积的淋巴细胞分离液，将已混匀的 2 倍体积的稀释血液缓慢地加在淋巴细胞分离液上，400g，24C，离心 30 min。4.5.1.5 吸弃上层的 PBS（保留的部分 PBS 距离 PBMC 层约 0.5 cm）4.5.1.6 用移液管吸
5、取 PBMC 层，转移到 50 或 15ml 离心管。4.5.1.7 加入 3 倍体积的 PBS 混匀，400g，24C，离心 10min。4.5.1.8 吸弃上清，加入 10 ml PBS 混匀细胞团，400g，24C，离心10min。4.5.1.9 吸弃上清，加入 10ml 含 20U/ml rIL-2 的 1640 完全培养液混匀细胞。吸取 20ul 细胞悬液用于细胞计数。4.5.1.10 调整细胞浓度至 3106/ml，加入 PHA 至终浓度 3g/ml。4.5.1.11 放入 37C 细胞培养箱，常规培养 3d。4.5.2 HIV 感染者 PBMC 的准备采集 HIV 感染者血液样本
6、后，按 4.5.1.1 至 4.5.1.12 的操作步骤分离PBMC。4.5.3 病毒复制的实验操作步骤4.5.3.1 取 10106经 PHA 刺激培养 3d 后的健康人 PBMC，用 1640 培养液混匀（终浓度 3106细胞/ml） ，加入 pb（终浓度 2ug/ml ） ，37，5%CO 2放置 30 分钟，每 15 分钟摇匀一次。4.5.3.2 1500rpm 离心 10 分钟，弃上清。4.5.3.3 将 HIV 病毒上清从液氮中取出，37 度水浴中迅速融化。4.5.3.4 用 1ml 病毒上清重悬经 pb 处理后的 PBMC 细胞团。4.5.3.5 37 5%CO 2培养 2h，每
7、 30 分钟轻摇离心管，使细胞重悬。4.5.3.6 2h 后，加入 10ml 1640 完全培养液混匀，1500rpm 离心 10 分钟，弃上清。重复此步骤三次。4.5.3.7 用含 IL-2 的 1640 完全培养液重悬细胞团，使细胞浓度为3106/ml。4.5.3.8 转入 T25 细胞培养瓶内，37 5%CO 2培养至少 14 天。4.5.3.9 第 3 或 4 天，吸取少量上清液用于 p24 抗原检测。若 p24 足够高，一般2ng/ml，可吸取半量上清液，并补充 60106新鲜的正常人PBMC（PHA 刺激 3d） ，维持细胞终浓度为 3106 /ml；否则，可进行半量换液，补充等量
8、新鲜培养液，继续培养。4.5.3.10 第 7 天，吸取少量上清液用于 p24 抗原检测。若 p242ng/ml，可吸取半量上清液，并补充 60106新鲜的正常人 PBMC（PHA 刺激 3d） ，维持细胞终浓度为 3106 /ml；否则，可进行半量换液，并补充 6106新鲜的正常人 PBMC 和新鲜培养液，使细胞终浓度为 3106 /ml，继续培养。4.5.3.11 第 10 天，同第 3 天。4.5.3.12 第 14 天，检测上清 p24 抗原含量，若 p242ng/ml，收集全部培养上清，3000rpm 离心 20 分钟，吸取上清于液氮冻存，完成病毒复制；若p242ng/ml，则弃去培
9、养上清和细胞，并作无害化处理。4.5.4 HIV-1 病毒上清冻存4.5.4.1 将 P24 抗原检测符合标准的 PBMC 共培养上清分装到 1ml 的冻存管内，直接置于-80冰箱，需要长期保存(3 个月以上)须将病毒转入-196液氮保存；4.5.4.2 用 FBS 配制 10%DMSO 冻存液，将共培养 PBMC 以 1*107cell/ml 浓度分装冻存管内，放入专用冻存盒内，-80冰箱过夜保存，12h内转入-196。4.6 说明： 除了 PBMC 共培养外，也可以选用 HIV 感染者的全血、血浆/血清与靶细胞 PBMC 共培养建立感染。（1） 全血共培养：将感染者 5100l 抗凝全血与活化的 HIV 阴性者 PBMC混合培养，总体积 2ml。（2） 血浆/血清共培养：将患者的血浆或血清标本与活化的 HIV 阴性者PBMC 混合培养。其余操作流程与 PBMC 共培养法相同。
