1、1.生物素标记和化学发光检测技术在核酸杂交和EMSA中的应用 2.Western Blotting的问题与对策,Steven Product manager Apr 24 ,2007,Part of ThermoFisher Scientific,Hyclone: Cell culture Technology Pierce: Protein Chemistry Dharmacon: RNAi Technology ABgene: PCR Technology,Technical Focus:有机合成，化学耦联，表面化学和分析化学 Product Focus： 分子生物学：各种化学发光Blot
2、ting, EMSA,RPA 蛋白质组学：蛋白抽提, 蛋白定量,纯化,样品制备，功能研究以及各种染色 试剂和预染Markers 免疫学 ：抗体制备, 纯化，片断化, 分型和修饰 交联化学：交联剂，修饰试剂，生物素化试剂,PIERCE:,1. 生物素标记和化学发光检测技术在核酸杂交和EMSA中的应用,关于生物素,别名： Vitamin B 分子量： 244.31 水溶性好结合对象： 亲和素Avidin 链亲和素Streptavidin 中性亲和素NeutrAvidin 单体亲和素Mono Avidin,关于生物素/亲和素复合物,亲和素 亲和素Avidin 链亲和素Streptavidin 中性亲
3、和素NeutrAvidin 单体亲和素Mono Avidin生物素/亲和素复合物 其中与前三者的结合解离系数为 Ka = 1015 M-1.具有极高的结合能力，只有8M的盐酸胍在PH1.5的极端条件下或在SDS煮沸才可以将其破坏解离， 而2mM生物素即可将单体亲和素与生物素标记的生物大分子置换解离。,Biotin: Avidin 体系的优点： 稳定 信号放大 用途广泛,生物素/亲和素应用,Biotin Avidin Technology,Affinity Chromatography,Diagnostics,Isolation/Purification,Immobilizing Agents,
4、Flow cytometry,Affinity cytochemistry,Localization studies,Histochemistry,Signal Amplification,Cross-linking Agents,Affinity targeting,Blotting,Bioaffinity sensors,Epitope Mapping,Cytological probes,Protein Interaction,1.1生物素标记和化学发光检测技术在核酸杂交中的应用,“Everything is possible - with the right tools”,标记：采用随
5、机引物标记法，利用DNA聚合酶，以目标DNA为模板，在随机七核苷酸为起始引物的作用下，将生物素标记的dUTP掺入到合成的DNA探针中，产生可用于Southern或Northern杂交实验的高活性生物素标记的DNA探针 检测：杂交形成双链，洗膜后，探针DNA上的生物素与HRP上的链亲和素结合，HRP与Pierce 的Dura化学发光底物孵育曝光或冷光CCD检测,原理,North2South 杂交原理和操作流程,4、HRP标记的链亲和素与 探针上的生物素结合,Kit组成,该试剂盒由探针标记，杂交洗膜和化学发光检测三部分组成 North2South生物素随机引物Kit(该试剂盒含有足以完成10次标记
6、反应的试剂，每次可合成至少1ug的生物素标记的探针) 化学发光检测Kit 89880可检测1080cm2的杂交膜.,探针得率高,高产率 ：模板DNA可以少至100ng，Klenow聚合酶无核酸外切酶活，产率提高，每次标记至少产生1-2 ug的生物素标记的探针。 使用方便：标记好的探针可以在冰箱里保存一年。,检测安全,采用非同位素的化学发光系统，免除放射性的危险与处理同位素废物的麻烦，减少环境污染；无须专门的同位素操作室，易于使用推广 anyone,anywhere and anytime,高灵敏度与高信噪比,生物素标记的dUTP保证了与HRP标记的链亲和素（Kd=10-15M； 抗体10-58
7、M ）最大结合，经受最严谨的洗膜条件 优化杂交液和封闭液保证了探针与靶DNA的完美结合 Dura （10-14克）底物保证了保证了高于地高辛（DIG）-AP标记系统，等同于或者超过同位素的检测灵敏度,方便快速,0.510分钟即可检测到特异性信号 6小时的超长发光时间允许多次曝光 可以使用冷光CCD成像仪扫描成像,操作流程与时间,探针标记与纯化（1小时） 预杂交（0.1mL/cm2 ,55或者65, 0.5小时） 杂交（812小时） 严谨洗膜（3X15分钟,提高温度,降低离子强度） 封闭（ 0.25mL/cm2 , 轻柔振荡15分钟） SA-HRP孵育（,1:300稀释度,轻柔振荡15分钟） 洗
8、膜（ 4X5分钟） 平衡（5分钟） 底物孵育(0.125mL/cm2 , 5分钟) 曝光检测（0.5 10分钟）,1. 探针制备一之探针标记,将20ul生物素标记的N4-dCTP与80ul的5XdNTP混合物充分混合备用（总量100ul） 稀释约100ng线性探针模板至24ul于离心管中(模板DNA要定量和纯化) 加入10ul随机引物（Heptanucleotide mix）于上述离心管中，煮沸变性5分钟，迅速在冰水混合物退火5分钟 加入10ul N4-dCTP与5XdNTP的混合物，5ul 反应缓冲液，1ul Klenow酶片断，混匀 37孵育60分钟 加入2ul EDTA以灭活Klenow
9、酶活性,2. 探针制备二之探针纯化,加入5ul醋酸铵于上述50ul反应离心管，吹打混匀 加入110 ul 冰预冷的无水乙醇，充分混匀，冰或70放置15分钟 12000rpm 4离心15分钟 观察沉淀情况，小心吸取出上清，风干沉淀 用冰预冷的70乙醇洗涤一次，12000rpm 4离心15分钟，观察沉淀情况，小心吸取出上清，风干沉淀 50ulTE或RNA酶free 的水溶解沉淀（20或70长期保存）,探针制备三之探针定量,500ul去离子水，260nm调零 充分混匀2.5ul 探针和47.5ul 去离子水（即稀释20倍）分光光度计测定OD260值 定量计算公式：1 OD260 dsDNA = 50
10、 g/ml； 样品浓度（g/ml）=OD值X50X稀释倍数; 样品浓度g/ul= OD260值X50X20/1000 样品浓度ng/ul= OD260值X50X20（注：如果稀释20倍，实际测定的OD260值应该在0.020.05之间） Note:大多数情况下，由于各实验室用来测定核酸的仪器不同，检测灵敏度不同以及样品中的一些干扰物质，测出的OD值往往是0甚至是负值，如果出现这种情况，再进行核酸定量没有实际价值，因此，根据经验，保守估计，在每次至少合成1ug探针的前提下，在杂交时，探针的用量按照每ul含有20ng探针来使用，即每毫升杂交液加入变性的纯化过的探针1.5-2ul.,2. 杂交和洗膜
11、之杂交,平衡杂交液到室温 预杂交:将转好的膜置于杂交管，点样面朝上，确保膜被杂交缓冲液均匀覆盖，杂交炉要缓慢转动以保证杂交液与膜能充分接触，（每平方厘米膜至少0.1ml杂交液。除了RNA:RNA杂交用65外，其他的都用55）,50-100rpm旋转，至少30分钟。 热变性探针：煮沸变性10分钟，迅速在冰/盐水混合物退火5-10分钟 杂交：加入已经变性的DNA探针于杂交液，充分混匀（探针加入到杂交液，不要加到膜上，要轻轻晃动，使探针均匀分散在杂交液中），探针浓度约30ng/ml杂交液, 50-100rpm旋转，孵育过夜。,2. 杂交和洗膜之严谨洗膜,配制1X严谨洗膜缓冲液，平衡严谨洗膜缓冲液到室
12、温（溶解充分），加等体积去离子水配制所需洗膜液（0.2ml/cm2膜） 将膜转移到一个新的容器中（杂交管）。加入1X严谨洗膜液1020ml，旋转洗膜3次（DNA杂交55，RNA:RNA杂交65），每次1520分钟。,3. 化学发光检测,Note1:要保证所有缓冲液充分溶解，没有颗粒 封闭：封闭液20ml（0.25ml/cm2膜）于3750振荡洗膜封闭15分钟 抗体孵育：20ml抗体稀释液（ 66.7ulSA-HRP20ml封闭液），室温孵育15分钟 洗膜：20ml的1X漂洗缓冲液分别室温轻柔振荡漂洗4次，每次5分钟 平衡：杂交膜与30ml的底物平衡液室温轻柔振荡孵育5分钟 底物孵育：把湿润的膜
13、放在一个干净的塑料盘（平皿）里，与底物工作液在室温下孵育5分钟（推荐在暗室中）。确保膜被底物溶液完全淹没或覆盖底物工作溶液需足够以完全覆盖杂交膜（约0.1ml/cm2）。 曝光：滤纸吸附多余底物，作好标记，保鲜膜包裹，确保保鲜膜和杂交膜间无气泡和皱褶。把包好的杂交膜放在暗夹里，放上X光片，曝光15分钟。曝光时间长短可以稍有变化以获得理想的信号。 从暗夹里取出X光片，按厂家的使用说明书显影和定影。Note2:可与底片背景去除试剂配合使用，以获得更理想的实验结果,对照DNA点杂交,备用试剂：0.1N NaOH 煮沸变性DNA变性成单链（ 对照DNA，5l，250ng/l） 准备生物素标记的对照探针
14、或阳性样品探针（见探针标记，纯化和定量） 准备目标膜（注意：推荐使用带正电尼龙膜，需带无粉手套并用乙醇净化的镊子拿膜。） 0.1N NaOH稀释变性DNA得到1，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.0312，和0.015ng/l稀释梯度。 在膜上平行点两点。点前最好把膜预洗一下，半干的时候点，但干点同样有用。 用1X TE轻轻漂洗膜（10秒），微波炉高火加热2分钟，紫外交联（自动交联）或烘干固定。注：如果没有紫外交联仪，则可以将膜置于80度温箱烘烤23小时，可达到固定目的 交联固定完，用0.1SDS预湿润膜，进入下面预杂交，杂交以及底物孵育和曝光 杂交，严谨洗膜和封闭，抗体孵育，洗
15、膜，平衡，底物孵育以及曝光见前所述,Note 1:使用带正电的尼龙膜,片段化以确保转膜（去嘌呤）：. DNA 10kb ， 0.2-0.25 N HCl孵育20分钟. RNA 5kb 0.05 N NaOH 30分钟 变性：0.4 N NaOH漂洗30分钟 中和： 1 M Tris, pH 8, 0.6 M NaCl EB去除：0.1SDS清洗 转膜： 防止核酸扩散 固定：微波炉固定（TE湿润，700900W 2分钟）紫外交联（120mJ/cm2,254nm1分钟； 302nm 2分钟（如果没有紫外交联仪，则可以将膜置于80度温箱烘烤23小时，可达到固定目的）,Note 2:电泳，转膜，固定,
16、Note 3:模板与探针,使用干净容器，以避免污染. 模板DNA要纯化定量 定量时不要稀释过度，造成读数误差 纯度：A(260)/A(280) 应该在 1.8-2.0 (DNA 1.8, RNA 2.0) 扩增出的探针要苯酚/氯仿抽提纯化，去掉dNTP,并且准确定量 杂交前的探针要变性 探针浓度:RNA:35ng/mL;DNA:-30ng/mL,Note 4:探针剥离,问题与对策一,问题与对策二,问题与对策三,问题与对策四,Note 5:中文说明书,完整的中文说明书提供了需要的一切,2.2 LightshiftTM化学发光 EMSA,PIERCE卓越的HRP/SuperSignal化学发光检测
17、系统与传统凝胶阻滞实验的完美结合 0.5个工作日完成整个实验,用 途,检测蛋白质-核酸相互作用相互作用部位相互作用强弱 鉴定调控序列,将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。,Traditional EMSA,LightshiftTM化学发光EMSA原理,靶DNA探针上末端标记生物素 探针末端的生物素与HRP上标记的亲和素结合 化学发光底物与HRP反应 DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针
18、移动得慢，在X光片呈现位置滞后，检测出DNA或RNA蛋白质是否有相互作用,LightshiftTM化学发光EMSA 特点,安全：化学发光检测 灵敏：亚飞克级，等同于同位素灵敏度 稳定：生物素标记的探针可保存一年 生物素末端标记，不影响相互作用 快速： 从标记探针到EMSA结果分析只需一天的时间,操作流程,操作时间,Lightshift EMSA Kit与传统的地高辛，P32标记在灵敏性，曝光时间和信噪比的结果比较,等同于同位素的灵敏度, 同样曝光时间,是地高辛灵敏度的8倍,极高的信噪比和极短的曝光时间,完整Kit: 100个反应800cm2的膜,抽提液的制备（核酸酶和磷酸酶污染会使探针降解）
19、结合蛋白的浓度 探针的浓度 非特异性探针的浓度 缓冲液的配方和pH 聚丙烯凝胶电泳条件 保温时间和温度 是否有辅助因子（比如锌，或镉等金属离子，或激素） 反应总体积应最小（20ul）,成功进行凝胶迁移实验，需要优化哪些因素？,待检测蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核蛋白抽提液。 纯化蛋白的量在20-2000ng间，可将蛋白：DNA的等摩尔比调整为蛋白的摩尔数是DNA的5倍。 用粗制核抽提液，需要1-20ug蛋白以形成特异的复合物。用pierce78833，需要23ul。 加入反应的探针的量是50fmole 竞争实验中所用竞争DNA用量为4Pmole（200倍） 反应体积为20ul。 探针应
20、保存在-20oC以防止降解，可长期保存,蛋白质或抽提物以及标记DNA探针用量,由肌苷和胞嘧啶组成。由于其特定的结构，可抑制蛋白对标记探针的非特异结合，避免假复合物。 在凝胶迁移反应中加入poly(dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中其它DNA结合蛋白结合，比如转录调节因子的非特异结合。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入poly(dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液，每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)。,非特异性探针poly(dI:dC),非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离。浓度一般为6%，在特定条件下可调整聚丙烯酰胺的浓度。 还
21、可用高强度琼脂糖凝胶分离蛋白/探针复合物 大多数蛋白用100-150伏左右的电压，解离快的蛋白用短时间和高的电压。 电泳时所用的TBE和TAE必需是新配制的，无沉淀。也可将TGE缓冲液（12.5mMTris,pH8.3, 95mM甘氨酸，0.5mMEDTA）用于不稳定的蛋白/DNA复合物。 可在4oC进行结合和电泳实验以阻止不稳定复合物和探针的解离。 加样样品液中的色素会导致不稳定复合物的解离，应用不含考马斯兰和二甲苯蓝的加样样品液。,电泳条件,多个Shift：部分纯化的蛋白或粗制核抽提液和一个特定的探针可形成一个或几个特异的蛋白复合物。多个复合物的存在表明蛋白降解，应在制备抽提液的溶液中和结
22、合反应中加入蛋白酶抑制剂。Supershift：使用目的蛋白抗体，进行超迁移实验。抗体可加入到蛋白和探针反应后，也可将抽提物与抗体结合后，再加入探针。取决于抗体的特定的抗原决定簇，前者有利于超迁移复合物地形成，后者阻止复合物的形成导致原复合物的强度减少。,如何确定Shift,其它注意事项,凝胶必需完全聚合，当带型不紧密出现拖尾时，表明复合物存在解离。以避免带型拖尾。 上样：如复合物不进入凝胶则表明所用的蛋白或探针过量，或盐的浓度过量不适用于这一反应。 探针降解：抽提物有核酸或磷酸酶污染，应在抽提液中和结合反应中加入相应的抑制剂。 设对照 紫外交联: 254 或312nm,Troubleshoo
23、ting,3.Western Blotting的问题与对策,Western Blotting方法选择 检测系统比较 检测方法 影响Western blotting成功的要素 常见问题分析与对策,Western Blotting方法一: 直接法,优点：1.快速（一种抗体） 2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带缺点：1.免疫反应性降低2.无信号二级放大3.抗体标记费时昂贵,使用不方便,Western Blotting方法二: 间接法,优点：1.免疫特异性不受标记影响2.信号放大,灵敏度高（多个二抗结合位点）3.多种标记的二抗可供选择 4.可选择不同的Marker 缺点：1. 交叉反应引起的非特异
24、性条带2.额外的二抗孵育以及条件优化,两种常用检测酶系统的比较,检测方法,化学显色法: 方便、便宜、有毒、灵敏度较低、费抗体、反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测 化学发光法: 灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、无害、特异性高、可重新剥离检测 同位素法 : 灵敏度高、不安全、 环境污染、不方便和半衰期短 荧光底物法： Krypton 荧光底物,HRP,AP标记二抗与一抗蛋白复合物结合,漂洗和封闭,一抗与蛋白结合 (小鼠单抗 或兔多抗),间接Western Blotting操作流程:,影响Western blotting成功的要素,电泳分离蛋白质：蛋白抽提，样品制备，电泳 转膜：膜的选
25、择，转膜确认，特殊处理 封闭：封闭液选择，封闭条件优化 漂洗：漂洗液的配制与选择 抗体孵育：抗体选择，抗体稀释倍数优化 ，点杂交 底物孵育：恰当的发光或显色底物 曝光：曝光时间掌控，X- 光片,信号增强剂 后Western Blotting选择： Striping 抗体剥离buffer Eraser it底片背景去除剂 Qentix信号增强剂,第一步：电泳分离蛋白质,蛋白抽提：材料，组分，量，降解 样品制备：盐，不相容物质 电泳：预制胶，上样缓冲液，转膜 养成使用内参的实验习惯,建议一：蛋白抽提,传统细胞裂解方法 机械法 匀浆破碎法 研磨法 超声破碎法 反复冻融法 问题 容易引起蛋白质变性和聚
26、集 需要低温进行 蛋白回收率低 需要额外设备,M-PER培养细胞总蛋白提取试剂 T-PER动物组织总蛋白提取试剂 B-PER细菌总蛋白提取试剂 Y-PER酵母总蛋白提取试剂 I-PER昆虫细胞总蛋白提取试剂 P-PER植物细胞总蛋白提取试剂 Mem-PER真核膜蛋白提取Kit NE-PER胞质 & 核蛋白抽提试剂 线粒体抽提Kit还有防止蛋白质降解的蛋白酶抑制剂,建议二：蛋白质定量：估计蛋白质丰度,BCA 准确灵敏：202000g/ml； Micro BCA 0.5-20g/ml（Pro#：23235） 变异系数远小于考玛斯亮蓝法 快速：45分钟,比经典的Lowry法快4倍 经济实用：试管或微
27、孔板测定 与离子型和非离子型去污剂相容 与还原剂和金属离子等不相容：,Commassie改良增强Kit 优点 12000ug灵敏度,125-1500ug/mL线性反应最好 一种试剂，简单，快速 相容性好：还原剂，盐和金属离子以及螯合剂 变异性小于普通考染法 Micro法(1-25ug/mL） 试剂冷冻保存2年 缺点 非线性颜色反应 去污剂干扰 变异系数大于BCA,建议三：样品制备:去除小分子，确保电泳成功,传统透析的瓶颈 特殊预处理，让你饱受煎熬 低回收率，让你暴跳如雷 难于操作，特别是处理小量样品难上加难 由于泄漏导致珍贵样品的丢失比比皆是 长时间透析让你欲罢不能,SnakeSkin透析袋（
28、15-100ml，无须预处理） Slide-A-Lyzer微量透析管（ 10-100 l ） Slide-A-Lyzer透析卡（0.1 - 0.5ml,0.5 to 3ml,ml to 12ml,12ml to 30ml） Microdialyzer 微量透析系统,建议四：样品制备：去除盐等不相容物质，确保电泳成功,脱盐 用于蛋白质缓冲液置换 去除核酸溶液中的酚 去除未连接成功的交联剂 标记蛋白时未标记的染料分子等 去除探针标记时的同位素 传统脱盐柱的所有瓶颈 烦琐的重力分部收集 受限的上样样品体积 样品回收率低 回收样品稀释 操作费时费力，无法同时多样品并行处理,新改良的脱盐方法： Zeba
29、离心式脱盐柱 截留范围 7000 95%的盐和分子量小于1000的分子储留能力 易于使用，无需平衡和装柱，离心一步收集 无需多步多组分收集，样品几乎没有稀释 快速，少于6分钟 同时多样品并行处理 多种样品体积备选 Zeba微量离心式脱盐柱：2 12 l 样品 Zeba离心式脱盐柱： 30l4mL样品 Zeba96孔离心式脱盐板：5分钟内并行高通量脱盐， 20 100 l 样品,建议五：样品制备:浓缩样品，增加上样量,Slide-A-Lyzer 蛋白质浓缩液 原理：亲水的高分子聚合物，将样品中的水和小分子抽吸出来，达到浓缩目的 特点： 精制的高分子聚合物，去除了小分子物质，避免了污染 80分钟内
30、浓缩510倍 与透析卡配合使用，效果更佳 Pro#:66530; 66528; 66529,传统浓缩的瓶颈 堵塞离心柱 低回收率 浓缩效果差 长时间倒置离心 iCON蛋白质浓缩管 30分钟内取得150-400倍的浓缩效果 样品收集简单，且无需倒置离心 大于90%的样品回收率9K和20K两种截留选择 样品范围从1-7毫升和5-20毫升 适用于平转头和角转头 Pro#:89884-89887,建议六：样品制备：净化与富集同步，确保条带清晰漂亮,PAGEprep蛋白质净化与富集Kit（Pro：89888） 原理 在DMSO存在下，蛋白质与修饰过的硅藻土胶结合，原缓冲液被离心洗去，上样缓冲液离心洗脱蛋
31、白 特点： 无需透析即可高效去除染料、还原剂，去污剂、糖、甘油、尿素、硫酸铵和胍等与PAGE电泳不相容的杂质 处理小至1ul样品 10分钟内完成,可直接上样电泳 样品浓缩10倍， 20l的胶可以与20g以上的蛋白质结合，比常规透析法、超滤法高效，简单、快速,建议七：蛋白质电泳,制胶 Precise 预制胶 18个月的保质期和12个月的最佳使用期 50 - 60 分钟的跑胶时间 (100 110V) 90 分钟转膜时间 (ice, 200mA or 40V) 与大多数电泳槽相容如 上样buffer 电泳条件,染色 Imperial蛋白质超级染色试剂 Highlights: 即开即用，无须配制 快
32、速简单: 1 hr stain, 1 hr wash 无须甲醇/乙酸脱色 低背景 高灵敏度： 3 ng! 与质谱分析或测序相容,第二步：转膜,膜的选择：NC，PVDF，尼龙膜 转膜确认 特殊处理 节省抗体：MiserTM抗体节约缓冲液 增强信号：QentixTM信号增强剂 代替转膜：胶上Western blotting,建议一：转印膜选择,建议二,MemCode 蛋白质可逆染色试剂 25ng检测灵敏度，是丽春红的10倍 染色不褪色，易于拍照成像 与下游WB检测完全相容，无任何干扰 染色30Sec；脱色10minPrestain 蛋白质预染Markers 实时监测 分子量参照,灵敏度比较,干扰性
33、比较,建议三：直接在电泳胶上作WB,可以用于转膜困难或者转膜不完全的蛋白质（蛋白质分子量、 PI、缓冲液PH，甲醇，蛋白质疏水性） 无需转膜或封闭 与重新剥离抗体或重新检测相容性好 1ng的检测灵敏度 能用于其它ECL底物 可用于10块迷你胶的检测 Pro#：33500；33505；33510；33515；33550,建议四：,MiserTM抗体节约缓冲液 节约抗体可达1/3-1/100 操作简单，仅需10分钟 适用于发光、显色/HRP和AP检测 适用于NC膜 Pro#32110,32105使用更灵敏的底物,建议五： Qentix信号增强剂,15分钟内使信号强度增强3-10倍； 适用于化学发光
34、，荧光和显色反应为原理的WB 适用于NC，PVDF膜 室温稳定储存，即开即用操作简单,第三步：封闭,Pierce封闭液 无生物素，无血清蛋白 无交叉反应 115分钟封闭时间 1020：1的信噪比，背景更干净 封闭条件优化 时间 温度 去污剂,建议：Pierce封闭液选择,New! Protein-Free Blocking Buffers (37570, 37572) and Protein-Free T20 Blocking Buffers (37571, 37573) contain 0.05% Tween-20,第四步:漂洗,第五步：抗体孵育,一抗和二抗的选择： 一抗：特异性，灵敏度（单
35、抗，多抗，片断） 二抗：HRP活性，耦联效率，浓度 HRP，AP，未标记，生物素，荧光素，罗丹明标记，F(ab)2 通用”二抗：HRP标记蛋白A,G,A/G,L以及SA-HRP 酶标二抗活性的保持(1) ethylene glycol：20可保存2年(2) SuperFreez HRP二抗稳定剂：1：1稀释 20可溶液保存1年(3) Guardin HRP二抗稳定/稀释保存剂 1：1000或1：100，000倍稀释，4可保存1年，室温6个月 稀释倍数优化（点杂交）,建议一：最佳抗体稀释倍数（点杂交）,1. 25ul不同稀释梯度的样品于NC，自然干燥1030min 2. 室温封闭1h 3. 加入
36、一抗 4. TBS或PBS洗膜46X5min 5. 加入二抗,室温孵育1h 6. TBS或PBS洗膜46X5min 7. 底物孵育8cm2/mL 8. 曝光时间：3060 Sec,建议二：,MiserTM抗体节约缓冲液 节约抗体可达1/3-1/100 操作简单，仅需10分钟 适用于发光、显色/HRP和AP检测 适用于NC膜 Pro#32110,32105使用更灵敏的底物,第六步：底物孵育,底物选择原则： 样品丰度 检测灵敏度 抗体珍稀度 经济成本 实验条件方便否来选择最恰当的底物发光底物：HRP 和AP底物系统 显色底物：HRP 和 AP底物系统,Pierce Western Blotting
37、底物一览,SuperSignal Western 化学发光底物,Western Pico底物和Kit Pierce ECL Western Dura增强底物和Kit Western Femto 超高灵敏型底物Kit Lumi Phos碱性磷酸酶化学发光底物,Twice the flash. Half the Cash,SuperSignal 化学发光底物发光原理和特点,高灵敏度：比显色法高103-106倍 多种灵敏度选择：10-12-10-15 节约抗体:其它底物用量1/101/1000 强信号，长发光，824小时 底物稳定，常温保存 检测快速：1-5分钟 高特异性，高信/噪比 检测方便： X
38、光片或CCD检测 多次曝光：选择满意的信号强度 反复检测：用不同抗体，对同一蛋白的不同决定簇进行反复检测分析,SuperSignal Pico化学发光底物性价比最高的底物,10-12检测灵敏度 ： 要求较高抗体稀释倍数 底物稳定性高 ： 底物常温下稳定保存至少1年 工作液常温下至少保持24小时 发光持续时间长 ： 8小时发光时间，可反复曝光 更节约宝贵的抗体: 一抗稀释倍数是10005000倍二抗稀释倍数是20000100000倍 与同类产品比，价格低注意：抗体的稀释倍数是由底物和待检测蛋白质的丰度决定的，为了获得最佳实验结果，强烈推荐进行点杂交预实验，以确定具体的实验参数,SuperSign
39、al与ECL花费比较,如何选择合适的Pico底物或Kit,底物（50ml，100ml，500ml，1L） 标准检测Kit：500ml底物2ml山羊抗鼠，兔二抗 完整检测Kit： 500ml底物2ml山羊抗鼠兔二抗1L封闭液4包洗脱液,2. Pierce ECL Western Blotting Substrate,同样的灵敏度， 一半的价钱 无须优化任何条件 Pro#:32106(500mL); 32209 (250mL)；32109 (50mL),New,3. SuperSignal Dura-化学发光底物发光时间最长的底物,24小时发光时间：比任何其它改良的HRP化学发光底物要长10倍；
40、10-14克级灵敏度 节省抗体：抗体稀释度达一抗1000-50,000和二抗50,000 -250,000倍，同样抗体可做25-50个WB 立即产生强烈信号，特别适合CCD仪器检测 工作液稳定24小时；常温保存一年,如何选择合适的Duro底物Kit,底物Kit：20ml 标准检测Kit：100ml底物1ml山羊抗鼠 1ml山羊抗兔二抗200ml底物1ml山羊抗鼠 1ml山羊抗兔二抗 产品：37071；34075；34076,4. SuperSignal Femto化学发光底物最灵敏的化学发光底物,最灵敏的化学发光底物： 10-15克 一抗稀释度：1/5000-100,000 二抗1/100,0
41、00-500,000 用于极端微量样品的检测 抗体珍稀样品的检测 稳定：4一年，室温半年 免费Pierce高质量二抗,如何选择合适的Femto底物Kit,底物Kit：20ml 标准检测Kit：100ml底物1ml山羊抗鼠 1ml山羊抗兔二抗200ml底物1ml山羊抗鼠 1ml山羊抗兔二抗、 产品：34094；34095；34096；,5. 碱性磷酸酶化学发光底物：Pro#:34150,6. PIERCE HRP化学显色底物,7. AP化学显色底物,底物与膜孵育 X- 光片 曝光时间的掌握 显影和定影液 信号增强剂,第七步：曝光,特别推荐：不需反复作WB的选择一 选择抗体剥离buffer,无须反
42、复电泳和转膜，节省宝贵时间 节省珍贵的样品 温和的无气味配方，对娇嫩的蛋白质丝毫无损 一份样品，一次电泳，一次转膜，多次印迹，更多数据,不需反复作WB的选择二：X光片背景去除试剂,用于各种X光片的背景处理，例如常规的Western、Northern、Southern、EMSA等。特点/优点： 去除不需要的背景，包括过度曝光、抗体浓度过高，封闭差，抗体/酶沉淀形成的高背景、阴影、杂点等 不需要费时的重复曝光 不需要重复优化各种实验参数 浓缩液可制备3升工作液 操作简单,过度曝光,抗体浓度过高,抗体/酶沉淀形成的 阴影、杂点,Show 一下，哈哈,选择Eraser it底片背景去除剂：无须反复曝光
43、即可获得背景干净的X光片,特别推荐三： Qentix信号增强剂,15分钟内使信号强度增强3-10倍； 适用于化学发光，荧光和显色反应为原理的WB 适用于NC，PVDF膜 室温稳定储存，即开即用操作简单,Pierce免疫印迹手册一切问题尽在掌握!,特别推荐四：,常见问题分析,比较均一的高背景 斑点、发泡式或闪烁式的高背景 信号弱或者无信号 非特异性条带 弥散型条带 白色条带、黑点或信号下降太快,比较均一的高背景,比较均一的高背景续表,斑点或发泡式或闪烁式的高背景,斑点或发泡式或闪烁式的高背景续表,信号弱或者无信号,信号弱或者无信号续表,非特异性条带,弥散型条带,白色条带/黑点/信号下降太快,谢谢！,
