1、将克隆载体上的水稻DNA片段片段亚克隆到转化载体,第一部分：分子克隆技术,puc19,pu1301,PU1301+1.5KB外源,双酶切： BamHI+KpnI,质粒载体的抽提，外源DNA的准备琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量载体与外源DNA的限制性内切酶消化载体的去磷酸化载体与外源DNA的连接感受态细胞的制备连接子转化感受态细胞重组子筛选及鉴定,利用质粒克隆外源DNA片段的主要步骤,质粒的提取,掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。,实验目的,实验材料,携带pUC18（或pUC19）质粒载体的大肠杆菌菌液携带含有水稻DNA片段的某种载体的大肠杆菌菌液。,是一个复制子，载体在受体细胞中
2、能大量繁殖，其携带的外源基因才能在受体细胞中得到大量扩增有1到多个限制内切酶的单一识别 与切割位点，便于外源基因的插入具有选择性的遗传标记(如抗生素抗性标记等)以此知道它是否已进入受体细胞，并据此标记将携带载体的细胞从其他细胞中分离出来,载体必备条件,质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。,质粒是染色体之外的一种稳定的遗传因子，大小在120kb之间，是双链闭合环状DNA分子，具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它所携带的遗传信息。它可独立游离于细胞质中，也可整合到细菌染色体上。质粒在
3、细胞内的复制可分为严谨型（只在细胞周期的一定阶段进行复制，一个细胞内只有1至几个拷贝）和松弛型（细胞周期中随时可以复制，拷贝数较多，一般在细胞内有20个以上）,质粒的基本特点,质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的制备过程,从平板上挑取单菌落接种于含相应抗生素的培养基中，培养至对数生长后期即可(松驰型质粒)。严谨型质粒（拷贝数较低）可采用氯霉素扩增的办法来扩增质粒,细菌培养物的生长,通过离心收集菌体；细菌的裂解可采用离子型或非离子型去污剂、有机溶剂、碱处理或加热处理等方法。（具体采用何种方法取决于质粒的大
4、小、大肠杆菌菌株及裂解后纯化质粒的方法）,细菌的收集及裂解,Solution I:Tris.HCl （pH 7.5）50 mMEDTA 10 mMRNase A100 g/mlSolution II: NaOH 0.2 MSDS1 %Solution III: Final concentrationKAC 1.32 MUsing HAC to adjust pH to 4.8,碱裂解法 试剂,solution I 重悬细菌solution II，其中的SDS破坏细胞壁、膜，使细胞内容物释放出来，NaOH 使DNA变性、碱基对打开，使宿主染色体DNA双链分开，而闭合环状的质粒DNA处于拓扑缠绕状
5、态，两个环并不分开,碱裂解法,Solution III 中和后，宿主DNA由于很大，碱基还未来得及配对就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起沉淀下来，而质粒DNA由于很小且双链未分开，能够迅速配对重新形成超螺旋，处于溶解状态。,碱裂解法,质粒的沉淀：加2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟或两倍体积的无水（或95）乙醇混匀，冰上放置10分钟；质粒的纯化：一般采用苯酚/氯仿纯化质粒; 为满足较高要求，可采用氯化铯密度梯度离心,实验步骤,取含有相应载体的大肠杆菌菌液于含有相应抗生素的LA培养基上涂布或划线分离单菌落，37过夜培养）；用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有相应抗生素的
6、LB培养基中，37摇床250 r/min过夜培养（T-载体：氨苄青霉素抗性；PC1300：卡那霉素抗性）,吸取1.5 ml菌液，12000 g离心1分钟，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净；加入300l 溶液 I振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）； 加入300l 溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟（最好不超过2分钟）； 加入300l 溶液III颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀；,12000 g离心10分钟；吸取800l 上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一Eppendorf管中，加入2/3体积
7、的异丙醇，室温下放置5分钟；12000 g 常温离心15分钟；倒尽上清，加75乙醇浸洗除盐，（放置片刻后倒去上清；或离心5分钟）加40l 灭菌超纯水或TE溶解；质粒的质量检测，-20保存。,Solution I:Tris.HCl （pH 7.5）50 mMEDTA 10 mMRNase A100 g/mlSolution II: NaOH 0.2 MSDS1 %Solution III: Final concentrationKAc 1.32 MUsing HAc to adjust pH to 4.8TE (pH 8.0) Tris.HCl （pH 8.0） 10 mM EDTA （pH 8
8、.0） 1 mM,氨苄青霉素（ampicillin）：其主要是通过抑制细胞壁的合成杀死正在生长的大肠杆菌。 氨苄青霉素抗性基因（ampr）：合成-内酰胺酶，在氨苄青霉素进入细胞之前将其水解(使用浓度100g/ml)卡那霉素（Kanamycin sulfate） ：核糖体结合抑制蛋白质的合成（使用浓度：50g/ml)RNaseA: C或U的3P与相邻的5OH处切开。 配制：一般以10mg/ml溶于TE中，然后在沸水中煮15分钟，分装成小份储存于20。,试验中用到的抗生素和酶,DNA纯度：吸光值检测：检测260nm、280nm吸光值，紫外分光光度计A260/A280=1.81.9； 1.8最佳，低
9、于1.8说明有蛋白质，大于1.8说明有RNA。质量检测：琼脂糖凝胶电泳：一般有三条带（超螺旋、开环、线型三种构型），点样孔附近无DNA带（无染色体DNA污染）。,质粒DNA质量检测,Hoechst33258:可与纳克级的DNA结合，而几乎没有RNA亲和性，激发波长365nm，发射波长460nm。0.1g/ml Hoechst33258适用于检测500ng/ml的DNA浓度，染料增加到1g/ml，分析范围可延至15g/ml，但会降低一定的灵敏度。 缺点：更易于结合AT丰富区，对DNA组成敏感。EB:与DNA组成无关，但不如Hoechst33258敏感，且能结合RNA，激发波长302nm，发射波长
10、590nm。,3. DNA的定量,（1）荧光检测仪,1 OD50 g/ml DS-DNA 或 1 OD 40 g/ml RNA or SSDNA,（2.）分光光度计,DNA的琼脂糖凝胶电泳,带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。,质粒DNA、植物总DNA或其它DNA 样品,实验目的：,掌握琼脂糖凝胶电泳的原理，了解影响琼脂糖凝胶电泳的因素，训练琼脂糖凝胶电泳的操作,实验材料：,在pH值为8.08.3时，核酸分子带负电，在电泳时由负极向正
11、极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构像不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。,实验原理：,影响DNA迁移速率的因素,DNA分子大小：迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子大小相等，电荷基本相等（DNA结构重复性）。分子越大，迁移越慢。琼脂糖浓度：logU=logU0-Kr 胶浓度，U为迁移率，U0 为DNA的自由电泳迁移率，为胶浓度，Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNA Agarose：0.5%： 1-30 kb
12、；0.7%： 0.8-12 kb 1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb.,DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状线状DNA或单链开环。当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm碱基组成与温度：4 -30 一般影响不大,嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加在电泳液中)电泳缓冲液的组成及其离子强度：影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1TAE，1TBE，1
13、TPE（均含EDTA pH8.0）,实验步骤：,将洗净、干燥的制胶板放入制胶槽中，水平放置在工作台上；调整好梳子的高度；称取0.24 g琼脂糖于30 ml 0.5TBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至温热时倒胶；凝胶凝固后，小心拔去梳子,将DNA样品与上样缓冲液混合后将样品依次加入点样孔中；将制胶板放入电泳槽中，加入电泳液，打开电泳仪，使核酸样品向正极泳动（注意点样孔在电泳槽的负极一端）；电泳完成后切断电源，取出凝胶，放入0.5 g/ml的溴化乙锭（EB）中浸泡1015 min，在紫外透射仪上观察电泳结果并照相记录。,电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophen
14、ol blue, Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。,1. 含甘油或蔗糖，利于DNA样品沉入点样孔中2. 含有电泳指示剂，以指示电泳的进程,上样缓冲液：,EB：溴化乙锭，可嵌入DNA分子中，受紫外光激发而发出荧光，利用它可检测DNA。是诱变剂，可引起插入突变，并有中度毒性，操作时应注意防护。操作时应戴手套，尽量减少台面污染。1000贮存液(0.5mg/mL )，使用时按1：1000稀释配制染色液。,质粒电泳检测：,一般有一至三条带（质粒DNA的三种构型）,超螺旋开环线型,质粒电泳检测,2005年春季20
15、02生技质粒图片,质粒载体的抽提，外源DNA的准备琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量载体与外源DNA的限制性内切酶消化(载体的去磷酸化)载体与外源DNA的连接感受态细胞的制备连接子转化感受态细胞重组子的转化及筛选、鉴定,利用质粒克隆外源DNA片段的主要步骤,载体及外源片段的限制酶消化: 限制性内切酶切出相互匹配的粘性末端（一种酶）或不相匹配的粘性末端（不同酶消化）或平端；载体的去磷酸化: 碱性磷酸酶去除载体的5P基团，以防载体自连；线状载体与外源片段的连接: 连接酶使双链DNA 5P与相邻的3OH之间形成新的共价键，若质粒载体的两条链都带有5磷酸基团， 则可形成4个新的磷酸二酯键，但如质粒已去磷酸
16、化，则只能形成2个新的磷酸二酯键，且产生的两个杂交分子带有2个单链切口，当杂合体导入到感受态细胞后可被修复。,不同末端克隆的要求及特点,限制性内切酶碱性磷酸酶连接酶,几种工具酶,有特定的识别序列 ，通常为46碱基的回文对称序列。切割位点位于识别序列内的固定位置上，切割后在5末端有磷酸基团，3末端有羟基。切割后形成粘性末端或平末端，前者又分为3突出端（如PstI）和5突出端(如EcoRI)两种其活性发挥只需Mg2作辅酶。,II类限制性内切酶的特点,限制酶的一个活性单位（1U）：原则上指在50l 反应体系中，37下，经过1小时的反应将1 g 的DNA完全分解所需要的酶量。限制酶的star活性：限制
17、酶在极端非标准条件下使用时对底物DNA的特异性可能降低，即可将与原来识别的特定DNA序列不同的碱基序列切断，这种现象叫限制酶的star活性。它的出现的频率与酶、底物及反应条件有关。,高浓度的甘油（5）；酶过量（100U/ug）；低离子强度（pH8.0)；有机溶剂（DMSO，乙醇，乙二醇，二甲基乙酰胺；用其他二价阳离子代替Mg2+(Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+)不同的酶对上述因素的敏感程度不同,引起星星活性的主要因素：,氯化镁、氯化钠/钾、Tris盐酸盐、巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）牛血清白蛋白（BSA）,典型的限制性内切酶作用的缓冲体系成分包括：,BamH I：GGATT CC C
18、TAAG,Kpn I:G GTACCCCATG G,含外源DNA片段的载体,（50 l反应体系，用1.5ml tube，冰上操作）,DNA35 lBamH I (10u/l) 1 lKpn I (10u/l) 1 l 10buffer5 lddH2O8 l,分别取5 l 酶切产物用0.81.2%凝胶检测酶切效果,50 l,Total,目的 载体,的限制性内切酶消化,造成DNA酶切不完全的主要原因有：,DNA不干净，反应体系中存在酶的抑制剂；操作不当，酶或DNA加至管壁上，反应体系没完全混合；反应条件不合适，用错了缓冲液或温度不合适；酶的活力不够,DNA样品中抑制酶活的污染物主要有：,DNA 样
19、品中的蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高浓度的盐等均能抑制酶切活性,解决办法：,增加酶作用的单位数（10-20U/g DNA)增大反应体积以稀释可能的抑制剂延长反应时间消化基因组DNA时，加入终浓度1-2.5m mol/L多聚阳离子亚精胺可改善酶切效果，其作用是结合带负电荷的污染物。纯化DNA,酶切反应的终止,加入终农度为12.5m mol/L的EDTA以鳌合镁离子而终止酶的反应多数酶在65C 10分钟可被不可逆灭活，少数65C不失活的酶在75 C 15分钟也能失活若酶对热具完全抗性，可通过酚抽提乙醇沉淀来纯化,酶切产物的纯化：,加入ddH2O 150 l （扩大体积），加入200l
20、氯仿/异戊醇（24:1），颠倒混匀后离心10 min； 吸出上清，加1/10体积3M NaAc和两倍体积乙醇，-20放置15分钟以上；12000 rpm 4冷冻离心15分钟；倒去上清，用75乙醇浸洗沉淀，风干后BAC DNA溶于10 l ddH2O，pUC18 DNA溶于20 l ddH2O（1.5ml tube中）；,氯仿对眼睛、皮肤、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌剂并可损伤肝脏和肾脏，操作时需戴手套、安全镜并在通风橱中进行。苯酚是强腐蚀剂，能引起严重烧伤。操作时应戴手套、安全镜、穿防护服，并在通风橱中进行。,注意,当一个体系中有多种DNA分子，而我们只需要其中的某种DNA 时或者反应体
21、系中含有目的DNA 子以外的其它分子如各种工具酶、dNTPs、引物及矿物油等时，可以利用凝胶电泳分离各种DNA，然后挖胶回收目的DNA 带。回收方法主要有： 1. 低熔点琼脂糖 2.透析带电洗脱法 3.glass milk 纯化 4. 柱回收试剂盒,DNA的回收纯化：,制1的琼脂糖凝胶上样2-4V/cm的电压下电泳至目的DNA带与引物二聚体及其他DNA带分离开紫外灯下切下目的DNA带（50100l）放入1.5ml试管中加23倍体积6M的NaI溶液 (150l，浸没凝胶块即可)55C保温 5-10min（不时上下颠倒试管以促进凝胶融化）加2l Glass milk 55C放置510min1200
22、0g离心30秒1分钟弃上清，加300l washing buffer，重悬打匀12000g离心30秒1分钟重复910步弃上清，空气干燥10分钟左右10l灭菌超纯水溶解DNA（5l用于连接反应，5l用于检测回收效率）,利用Glass milk 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段,晶美DNA 回收试剂盒从凝胶中回收DNA,制1的琼脂糖凝胶（1TAE或1TBE），上样2-4V/cm的电压下电泳至目的DNA带与引物二聚体及其他DNA带分离开紫外灯下切下目的DNA带（50100mg,）放入1.5ml试管中加3体积的Binding solution (若用TBE胶，加1/2体积的TBE conversion b
23、uffer 和4.5 体积的Binding solution）55C 5分钟（其间摇动管子并快速放回水浴锅）使凝胶溶化加入Silica Power Suspension（5l)， 混匀，55C 5 -10分钟离心5秒，上清转至另一离心管中备暂时保留（回收效率分析）,用500l冰冷的Prepared Wash Buffer重悬沉淀，用移液器或振荡器混匀，离心3-5秒，去上清（若DNA 片段5kb,用振荡器振荡易打断DNA）重复洗涤沉淀2次用水或TE（5l)重悬Silica Power/DNA ， 55C 5分钟，离心30秒，小心将上清吸取到一新离心管中(不要吸到沉淀）重复2次，合并上清检测回收产
24、物,注意,切胶时尽量减少凝胶暴露在紫外灯下的时间以避免嘧啶二聚体的形成胶的体积：1g 约等于1ml第5步若胶溶化不好： 胶尽量切薄一点（2mm) 时间可延长至胶溶化4. 2l的Silica Power Suspension 可以结合1g DNA, 0.1-2.5 g DNA 用5l足够了，DNA 多于2.5 g 时，每多1 g 再多加2l的Silica Power Suspension,柱式DNA胶回收试剂盒,操作步骤：,1. 通过琼脂糖凝胶将目的DNA 带与载体带分开；2.紫外灯下用干净的刀片切下含目的DNA 带的胶块放入1.5ml离心管中；（注意：不含DNA 的胶尽可能切除，在长波长的紫外
25、灯下切胶，并尽量缩短DNA 暴露在紫外光下的时间）3. 按400l/100mg 胶的比例加入Binding Buffer II , 50-60C 水浴中10分钟，使胶融化，每2-3分钟混匀一次；（注意若胶的浓度较大需增加Binding Buffer II 的比例、增加融胶的时间，若胶块体积较大也需增加融胶的时间）4. 将融化的胶溶液转移到套放在2ml收集管内的UNIQ-10 柱中，放置2分钟，8000rpm离心1分钟；,5. 取下UNIQ-10 柱，倒掉收集管内的废液，将UNIQ-10 柱放入同一个收集管内，加入500l Wash Solution ,8000rpm 室温离心1分钟；6. 重复
26、5步一次，7.取下UNIQ-10 柱，倒掉收集管内的废液，将UNIQ-10 柱放入同一个收集管内，12000rpm 室温离心15秒；8.将UNIQ-10 柱放入一个新的1.5ml 离心管内，在柱子膜中央加40l Elution Buffer 或水（pH7.0），室温或37C 放置2分钟；（提高洗脱温度到55C-80C有利于提高DNA 的洗脱效率）9. 12000rpm室温离心1分钟，离心管中的溶液即为回收的DNA 片段,注意,1. 首次使用前，必须在Wash Solution 中加入4倍体积的无水乙醇，充分摇匀后使用，每次使用后将瓶盖拧紧，以保持Wash Solution 中的乙醇含量。2.
27、Elution Buffer 为2.0mmol/L Tris-HCl, pH8.5. 4C保存。也可用PH8.0 的TE 或PH7.0 的水代替。,载体去磷酸化,细菌碱性磷酸酶（BAP）,牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）以及小虾碱性磷酸酶（SAP）都能催化磷酸单脂键的水解（包括DNA、RNA、dNTP和NTP上的5磷酸残基） ，不能催化磷酸三脂的水解。比较而言，CIAP的活性比BAP的高1020倍,CIAP经加热处理，容易失活但不能完全失活,若要使酶完全失活，不论是BAP还是CIAP还需要经苯酚处理。而SAP经65C 加热15分钟就可完全失活。活性定义：在37 C 、pH9.8的条件下，1分钟内水
28、解对硝基苯磷酸盐（-nitrophenyl phosphate)生成1M的对硝基苯(-nitrophenol)所需的酶量定义为1个活性单位（U）.,碱性磷酸酶,载体去磷酸化反应体系：,DNA20 lCIAP（TaKaRa）0.5 l10 buffer4.0 lddH2O15.5 l,37 或50反应30 min 以上,Total 40 l,去磷酸化载体的纯化,加0.4 l 0.5M的EDTA（终浓度5mM)，75水浴10 min, 使CIAP失活； 加入ddH2O 150 l （扩大体积），加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），颠倒混匀后离心10 min； 吸出上清，加1/10体积3
29、M NaAc和两倍体积乙醇，-20放置15分钟以上；12000 rpm 4冷冻离心15分钟；倒去上清，用75乙醇浸洗沉淀，风干后溶于10 l ddH2O（0.5ml tube中）,载体与外源DNA片段的连接,连接酶使双链DNA 5P与相邻的3OH之间形成新的共价键，若质粒载体的两条链都带有5磷酸基团， 则可形成4个新的磷酸二酯键，但如质粒已去磷酸化，则只能形成2个新的磷酸二酯键，且产生的两个杂交分子带有2个单链切口，当杂合体导入到感受态细胞后可被修复。,大肠杆菌连接酶T4噬菌体连接酶。,连接酶,各种连接酶特性的比较：,DNA4 lpUC184 l10 buffer1 lT4 ligase (1
30、U/l)1 l,连接反应体系：,16 C 水浴保温过夜,Total 10 l,感受态细胞的制备及质粒的转化,转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。,外源片段与载体的连接产物；大肠杆菌感受态细胞,实验目的,掌握热激法或电转化方法 转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定方法,实验材料,感受态细胞的制备,体外连接的DNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。为了提高受体菌摄取外源DNA的能力，提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采
31、用电转化法和CaCl2法将外源DNA导入受体细胞中，因此需要相应地制备电转化感受态细胞和CaCl2感受态细胞。,将外源DNA导入大肠杆菌主要有两种方法：,CaCl2法：利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。106 107转化子/g DNA。电转化法：利用瞬间高压在细胞上打孔。因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。1091010 转化子/g DNA；,所有操作均应在无菌条件和冰上进行；所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率。,操作注意事项,电转化
32、感受态细胞的制备（一）,前夜接种受体菌（DH5），挑取单菌落于LB培养基中37摇床培养过夜（约16小时）；取1ml过夜培养物于100ml LB培养基中，在37摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（300rpm）；将菌液迅速置于冰上，同时10%的甘油置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；4下3000g低温离心5-10分钟；,电转化感受态细胞的制备（二）,弃去上清，加入1500l预冷的10的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；4下3000g低温离心5-10分钟；弃去上清，加入750l预冷预冷的10的甘油，用移液器
33、轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；4下3000g低温离心5-10分钟；弃去上清，加入20l预冷预冷的10的甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮超低温冷冻贮存备用（70）。,使用的培养基最好用NaCl减半的LB培养基；密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5菌株OD600为0.5时细胞密度是5107/ml）；制备感受态细胞及配制试剂所用的水应达到18 M,即使用超纯水；化学试剂应是分子生物学级；所使用的枪头和器皿都应是新的，干净无菌的；无菌操作；低温（冰上）进行。,操作注意事项 特别控制盐离子的残留,电转化的步骤（一）,制备选择性培养
34、基平板：在融化的250 ml LA培养基中250 l Amp，250 l X-gal，25 l IPTG，混匀后倒入灭菌培养皿中；取出3管制备好的感受态细胞，放在冰上融化；每管感受态细胞中加入约20ng质粒DNA，3管分别加连接产物、标准超螺旋质粒DNA（阳性对照）及不加入任何DNA（阴性对照），用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置1分钟；,电转化仪输出电压选择1800V（1mm转化杯)，电击时间5毫秒；将要转化的混合物加入预冷的1mm转化杯中，将转化杯插好，立即按下按钮电击；立即加入1ml SOC或LB 培养基于转化杯中重悬细胞；将细胞转入合适的培养管中37 培养1小时；吸取合适体积的菌液涂布已
35、倒好的选择培养基平板上；37 培养过夜，观察结果。,电转化的步骤（二）,影响电转化效率的因素,细胞的生长状态非常重要，快速生长的细胞最适于制备感受态细胞；细胞转化效率与所加电场的强度和脉冲持续时间有关。细胞上穿孔的数目和孔径大小随着所加电场的强度和脉冲持续时间的增加而增加，但超过了一定的限度，就会对细胞造成伤害。不同的细胞最适的电压不同，从450v/cm（昆虫细胞）到高于12.5 kv/ cm（细菌细胞），同时也与所使用的电转化杯有关，对于大肠杆菌而言，0.1cm的杯子使用1.8 kv（18 12.5 kv/ cm），0.2cm的杯子使用2.5kv （12.5 kv/ cm) 。时间一般设置为
36、5毫秒,外源分子的纯度。杂质在转化过程中会转入细胞造成不可预知的影响，且常常增加细胞的死亡率；制备感受态细胞所用的水应达到18M即使用MilliQ级的超纯水，化学试剂应是分子生物学级；同样原因，所使用的枪头和器皿都应是新的，干净的;电转化杯的质量非常重要，随着使用次数的增加，转化效率会下降，这主要是因为铝的氧化会增加电路的电阻从而改变电场条件，另外若反复使用的转化杯没有洗干净，污染的DNA转入细胞从而造成假阳性克隆的生长。,7.电击后，由于电解作用，细胞处于非常不利的环境中，必须尽可能快的稀释转入合适培养基中让细胞复苏（30秒）。8.利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时，用转化细胞 铺平板的密度要低
37、（90mm平板上不得超过105个菌落），同时37 培养不应超过20小时，具氨苄青霉素抗性的转化体可将内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围的抗生素，从而导致对氨苄青霉素敏感的卫星菌落的出现。,提高转化效率,感受态细胞的状态质粒的质量和浓度 一定范围内，转化效率与质粒 DNA的浓度呈正比,感受态细胞的转化效率：1ng DNA转化100 l 感受态细胞，加900 l SOC培养基复苏（1ng DNA/ml），然后取100 l 菌液涂平板(0.1ng DNA)，假设每个平板上平均长出100个克隆，则其转化效率为：100 cfu 0.1ng = 1000cfu /ng DNA= 1106cfu /
38、g DNA,-peptide when combined with the carboxyl terminus of b-galactosiase can make a functional b-galactosiase,蓝色菌落：载体自连,白色菌落：含外源片段,无菌落长出 转化方面的问题，感受态细胞效率低,长出菌落很多，但白色菌落很少,感受态细胞转化效率较高，但连接反应有问题，大多数是载体自连产生的蓝色菌落,长出菌落很少，且白色菌落少,外源片段与载体的量都太少，连接子很少外源片段与载体的比例不合适连接缓冲液稀释倍数不对连接时间不够长体系中有抑制因子导致连接失败外源片段插入了载体，但没有打破LacZ的阅读框，产生的菌落仍为蓝色,现象,原因,
