1、Chapter 3 Cell Disruption 第三章 细胞破碎,第三章 细胞的破碎和分离,3.1 分类 3.2 细胞破碎理论 3.3 细胞破碎技术 3.4 物理法和化学法的比较 3.5 破碎方法的选择 3.6 细胞破碎的评价 3.7 基因工程表达产物 3.8 包涵体,思考题,1.影响珠磨细胞破碎法的主要因素？ 2.珠磨法与高压匀浆细胞破碎方法有哪些区别？ 3. 细胞破碎的评价主要采用两种方法各有何优缺点 ？ 4.综述包涵体形成的原因，如何获得包涵体活性目标蛋白？ 5.简述基因工程产品人-干扰素分离过程。, 3.1 Cell Membranes 细胞膜, 3.0 Summary 概述, 3
2、.2 Chemical Methods 化学破碎方法, 3.3 mechanical disruption 机械破碎,生物分离的第一步是将生物机体从发酵液中分离，通常使用过滤和离心等方法，这在第二、三章中已有陈述。大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目标产物存在于在发酵液中。在上述过程中，需被分离的发酵液可被看作一种副产物来处理，以此分离和纯化产物。,有些目标产物不在发酵液中，而是存在于生物体中。尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质不会被分泌到发酵液中，而是在细胞内沉积。脂类物质和一些抗生素也是包含在生物体中。还有一些目标产物就是细胞本身，如面包酵母。还有，产物如类固醇不必通过细
3、胞破碎提取。大多数情况下，产物还是包裹在生物体内，属胞内产物。,. 使胞内产物释放出来一般需要破碎细胞壁，这也是这一章的主题。 细胞破碎的方法在生物化学领域中得到了很广泛的运用，但多数在小规模生产中，在大规模生产尤其是基因工程中应用极少。,3.1 分 类,3.1节回顾一下细胞壁的结构。从中可知，在大规模生产中，细胞破碎方法是十分有用的。我们很容易将这些方法划分为两大类，化学法和机械法。化学法我们将在后面作详细介绍，有渗透冲击法、表面活性剂增溶法或有机溶剂溶解法。这些化学法较温和，细胞破坏后产物也不会不可逆的变性，规模也容易放大：如果需要处理10倍量的生物有机体，只需要加入10倍的化学药品剂量。
4、,表 3.0-1. 细胞化学破碎法,表 3.0-1. 细胞物理破碎法,机械法主要有匀浆法和研磨法,这两种方法中，细胞通过高的机械剪切力被破坏。热量的产生是该法的一个缺点，而且不容易规模放大:如果一种方法可以在实验室规模下操作，我们并不知道这种方法是否在大规模生产中可行。所以，这部分内容仅作为实验的指导，而不是工程分析 。,细胞膜结构,现在所有的关于细胞膜结构的基本知识，并不能为细胞破碎方法提供基本的引导。也许将来可以。正因如此，对此进行提纲切领的介绍很有必要。主要强调的是革兰氏阴性原核生物。其细胞结构中没有细胞核：基因物质位于单链DNA上。典型的生物是大肠杆菌，是生物技术研究的主体。通过这种细
5、胞生产了很多细胞重组的产物。,革兰氏阴性细胞结构如图所示。有三层：最外层约8mm厚，酶大多数镶嵌在这层膜上。革兰氏阳性原核生物缺少最外层结构，但有第二层肽聚糖层和胞浆空间。 革兰氏阳性菌细胞壁较厚，约2080nm。含1550层肽聚糖片层，每层厚度1nm，约占细胞干重的50%80%。此外，尚有壁磷壁酸和膜磷壁酸。,革兰氏阴性菌细胞壁细胞壁较薄，有12层肽聚糖片，在肽聚糖层外尚有脂蛋白、脂质双层、脂多糖三部分。脂蛋白的功能是将外膜固定于肽聚糖层，脂类和蛋白质等在稳定细胞结构上非常重要，如果被抽提，细胞壁将变得很不牢固。,细胞壁组成,图2-1 细菌细胞壁的主要组分,藻类细胞壁的结构与组成,藻类的细胞
6、壁更为复杂，其主要结构成份，是纤丝状的多糖类物质。,M-甘露聚糠；P-磷酸二脂键；G-葡聚糠,酵母细胞壁的结构示意图,3.2 细胞破碎理论,1)、细胞破碎 A 压撞 B 剪切 Ca 渗透 Cb 冻胀 D 破壁破膜剪切力F: 假定细胞直径为d(in: m)，维持球体所需的综合维持力为(in: N/m)，则破碎细胞所需F(in: Pa)为 如利用流体剪切力(Pa)的作用，则在牛顿流体中 则破碎细胞所需的速度梯度为：,3.2 细胞破碎理论,意义：细胞直径，所需压力或剪切力，破碎难度。 渗透压法：渗透压差()为c=细胞内外小分子的浓度差，R=气体常数，T = 绝对温度。 2)、产物释放如细胞破碎速度与
7、未破碎细胞浓度成正比，则有,3.2 细胞破碎理论,如破碎cell产物释放的速度与cell内外的浓度差成正比，则有cm为产物的最大释放浓度，x0为起始细胞浓度，从上三式得 上式为两步释放的速度方程，如细胞破碎或产物释放的其中一步很快，则表现为一级动力学释放过程，此时方程为 破碎速度控制过程： 释放速度控制方程：,细胞壁的破碎,细胞破碎的方法很多，在诸多破碎方法中，机械法中的球磨机和高压匀浆机不仅在实验室而且在工业得到应用。其它的方法大多尚停留在实验室应用，工业化的应用还在探索之中。一、球磨法球磨机是破碎微生物细胞的常用设备，一般有立式或卧式两种，在磨腔中装入小玻璃球或小钢球，由电动机带动搅拌碟片
8、高速搅拌微生物细胞悬浮物和小磨球而产生剪切力，将细胞破碎。,3.3 细胞破碎技术 珠磨法,1)、固体剪切法(珠磨法, c最有效的物理破碎法) 操作简介,WSK卧式高效全能珠磨机,3. Crushing in ball mill 珠磨法,ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机,图2-5 Netzsch Molinex KE5搅拌磨 图2-6 Netzsh LM20砂磨机,3.3 细胞破碎技术,计算 破碎遵循一级动力学定律, 即对上述方程积分得对于n次连续搅拌研磨操作，则得蛋白质的物料平衡式：平均停留时间，V：磨腔的总体积，Q：发酵液的流量。,3.3 细胞破碎技术,影响因素 a) 转盘外缘速度(见下图)：适
9、合条件：圆盘外缘速度 20 m/s, 一般在 5-15 m/s。b) 珠粒添量和大小添量：(见上图，添量体积一般占总体积的80-90%)粒径：一般在0.2mm(实验室), 0.4 mm(工业)。最终由实验确定 磨球越小，细胞破碎速度越快。但磨球太小而漂浮，难以停留在磨腔中,3.3 细胞破碎技术,c) 温度：温度在5-40C范围内对破碎影响较小。但研磨产热，功率 ，温度 。如产物热不稳定，必须控温。 用NetzshLM20研磨和破碎酵母或细菌时，细胞浓度控制在40%左右（产生的热量随浓度的增大而提高）d) 细胞浓度x：最佳x由实验确定。一般产热量随细胞浓度的降低而下降，但单位细胞重量的能耗 。e
10、) 破碎效率：R：每kg成品细胞(如酵母)释放的蛋白量，Q：物料流量，P：珠磨机消耗的功率。f) 流量Q：破碎为一级反应。 Q, E，R； Q，E，R。,破碎率是选择细胞破碎设备的重要依据之一。,3.3 细胞破碎技术,f、不同流量和搅拌速度下的效率。-20，-50，-100 10-6 m3/s 流量；18， 210， 315， 420 m/s 外缘速度,g. 微生物特性,一般来说酵母比细菌细胞处理效果好。因为细菌细胞仅为酵母细胞的十分之一，而且细菌细胞的机械强度比酵母要高。一台20L球磨机在最适条件下，每小时可加工200kg面包酵母，而在同样条件下，处理细菌细胞仅为1020kg。,3.3 细胞
11、破碎技术匀浆法,2)、液体剪切法(最常用的方法之一) 操作,JJ-2组织捣碎匀浆机,高压匀浆法是液体剪切破碎方法中的一种。它的主要设备是高压匀浆机，,高压匀浆法是液体剪切破碎方法中的一种。它的主要设备是高压匀浆机，它有一个高压位移泵和一个可调节进料速度的针形阀（见图）。当菌体悬浮液经过高压泵加压后，通过阀芯与阀座之间的通道时，悬浮液突然改变方向，向球撞击。在通过阀门时产生高剪应力，向环撞击时产生巨大的冲击力，将细胞破碎，然后排出,高压匀浆机的排出阀装置,3.3 细胞破碎技术,计算 服从一级反应定律 式中，R为pro释放量，Rm为pro最大释放量.影响因素 操作压力p：p, R ;相反, R 。
12、温度 2C /10MPa 。 破碎次数N：N，R 。 温度：比速度k与温度有关，温度25C，k1.5倍。 细胞抗破碎系数a：a酵母=2.9，a大肠杆菌 = 2.1。 细胞种类：影响k值。细胞浓度： Z：常数，p0：破碎所需的最低压力，：细胞浓度的参数。,3.3 细胞破碎技术,阀门底座：刃缘阀座，平边阀座优点 A、在大规模cell破碎中，高压匀浆机和珠磨机用得最多; B、高压匀浆机最适合于酵母和细菌; C、珠磨机可用于酵母和细菌，但对真菌菌丝和藻类更合适.,3.3 细胞破碎技术撞击破碎法,3) 撞击破碎法 操作：细胞喷雾高速冻结300 m/s氮气流优点： A、细胞破碎仅发生在撞击的一瞬间，破碎程
13、度均匀，避免反复和过度破碎； B、破碎的程度可无级调节，避免细胞内部结构的破坏，特别适合于细胞器的回收； C、实验室和工业规模均可应用，细胞浓度在10-20%，实验室规模的间歇处理能力在50-500 mL/h，工业规模的连续处理在 10,000 mL/h 以上。,3.3 细胞破碎技术-超声破碎法,4) 超声破碎法(1525kHz),2. Ultrasonication 超声波,超声波破碎仪,3.3 细胞破碎技术-超声破碎法,机理在超声作用下产生的空穴化作用(cavitation)，空穴的形成和闭合产生极大的冲击波和剪切力。优点：适合于多种细胞的破碎缺点：A、影响因素多，如振幅、黏度、表面张力、
14、液体体积和流速、探头材料和形状；B、超声产生超氧离子毒害作用；C、有效能量的利用率低；D、产热大，需控温；E、不易放大，仅应用于实验室规模的细胞破碎。,3.3 细胞破碎技术化学破碎法,5) 化学破碎法 酶溶法、酸碱法、有机溶剂胞溶法、表面活性剂法酶溶法：利用酶分解细胞壁上特出的化学键，使细胞壁破碎。优点： A、产品释放的选择性； B、提取速度和收效高； C、产品的破坏小； D、对外界环境，如pH和温度等要求低； E、不残留细胞碎片。,3.4 物理法和化学法的比较,物理破碎法缺点： A、高能、高温、高噪音、高剪切力(四高)，易使产品变性失活； B、非专一性，胞内产物均释放，分离纯化困难； C、细
15、胞碎片大小不一，难分离。化学破碎法缺点： A、费用高； B、引起新的污染，尤其是其他化学方法； C、一般只有有限的破碎，常需与其他物理法连用。,3.5 破碎方法的选择,选择的一般原则 A、提取产物在细胞质内，用机械法破碎 B、提取产物在细胞膜附近，用化学法 C、提取产物与细胞膜和细胞壁结合，可采用化学法和机械法结合的方法 破碎技术杂交研究应注意的问题 A、杂交技术可产生很大优势。如 B、破碎技术对下游分离技术的影响。破碎颗粒清除，产物的分离纯化 C、在发酵阶段，考虑到发酵过程和环境对破碎难易程度的影响 D、菌种的培育，胞内产物 胞外产物,3.6 细胞破碎的评价-直接计数法,破碎率定义N0：原细
16、胞数，N：破碎后残存的正常细胞。N0和N的可通过直接计数和间接计数法得到。直接计数法 方法：样本稀释 - 染色 - 上样 计数。 计算：同上。 优点：方法简单。 缺点： A、计数时间长，B、只有活细胞才被计数，误差大，C、细胞聚集时，不利计数，D、染色误差。,3.6 细胞破碎的评价-间接计数法,间接计数法 方法：样本离心 - 取上清液 - 测特定蛋白质或酶 - 与理论的最大值比较。 计算：Rm：理论最大值，R：实验测得值。优点：A、方法客观可靠，尤其对蛋白质和酶，B、有多种选择的指标，胞内位置(如胞膜、胞壁、近胞膜蛋白等)，灵活性大。 缺点：影响因素多，如温度、pH值、剪切力、溶液的稀释等。
17、解决办法：筛选相对稳定和恒定的指标。,3.7 基因工程表达产物,基因工程取得的成果A、基因工程的一般过程 B、抗虫棉、天然彩色棉 C、高附加值的药品：白细胞介素-II、-(or - or -)干扰素、humulin、牛生长素、anti-thrombin-III 、IgG、GM-CSF、TPA等 D、基因牛,3.7 基因工程表达产物,存在的问题 A、包含体 B、N-端多一个蛋氨酸残基、表达产物未糖基化（大肠杆菌） C、表达产物过度糖基化，目标产物变成抗原（酵母） D、大肠杆菌的内毒素包含体的解决方法（一般步骤） A、包含体的分离 B、包含体溶解、变性、还原，一般用尿素、盐酸胍、SDS C、变形蛋
18、白质的复性和重新氧化 D、一般的分离纯化,3.7 基因工程表达产物- 人-干扰素的后处理,例：人-干扰素的后处理工艺 发酵液离心(发酵液冷却至10C以下，4000r/min离心10min) 菌体细胞破碎(1倍体积细胞+10倍体积PBS buffer, 冰浴超声破碎5次, 30s/次, 4000r/min离心30min)，洗涤(0.1% Triton X-100溶液，1000r/min离心20min，重复三次) 包含体提取变性(包含体+8M 尿素 pH 8.0 50mM Tris-HCl buffer 0.2 mM EDTA, 10mM DTT室温搅拌2h, 离心(15000r/min, 30m
19、in),3.7 基因工程表达产物,变性液稀释(取1份变形液+99份上述buffer(不含DTT)，使尿素浓度小于0.1M，4C下搅拌24h） 复性液浓缩(用截留10000D的超滤器浓缩100倍)，透析后离心(15000r/min离心30min) 浓缩上清液Sephacryl s-200柱层析分离层析柱2100cm，pH 8.0 50mM Tris-HCl buffer 平衡洗脱 收集主峰、冻干、终产物 (纯度可达100%，DNA及热源合格),3.8 包涵体简介,利用DNA重组技术，把重组体DNA引入宿主细胞，使其在细胞内表达，便可得到一定的蛋白质。目前已成功的利用大肠杆菌发酵生产胰岛素，人的生
20、长激素，人胸腺激素1，、干扰素，牛生长激素，乙型肝炎病毒抗原和口啼疫病毒抗原等。外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成。所谓包涵体是指蛋白质分子本身及与其周围的杂蛋白、核酸等形成不溶性的，无活性的聚集体，其中大部分是克隆表达的目标产物蛋白。这些目标产物蛋白在一级结构上是正确的，但在立体结构上却是错误的，因此没有生物活性。在利用大肠杆菌生产蛋白的过程中，重组蛋白大多数情况是以包涵体形式存在。要从包涵体中分离出具有生物活性的产物，通常的处理步骤为：收集菌体细胞细胞破碎离心分离包涵体的洗涤目标蛋白的变性溶解目标蛋白的复性。,3.8 包涵体形成原因,一、包涵体的形成形成包涵体的因素主要有以下
21、几个方面：重组蛋白的表达率过高，超过了细菌的正常代谢，由于细菌的蛋白水解能力达到饱和，导致重组蛋白在细胞内沉淀下来；由于合成速度太快，以致没有足够时间进行肽链折叠，二硫键不能正确配对，导致重组蛋白溶解度变小；与重组蛋白的氨基酸组成有关，一般说含硫氨基酸越高越易形成包涵体；重组蛋白是宿主菌的异源蛋白，大量生成后，缺乏后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶及分子伴侣等，导致中间体大量积累导致沉淀； 与重组蛋白的本身的溶解性有关；在细菌分泌的某个阶段，蛋白质间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体形成。,3.8 包涵体-分离及洗涤,由于重组蛋白形成包涵体，包涵体又位于细胞质中，因此可选择破碎细胞
22、的方法，得到包涵体。 例如人干扰素的提取中，先把发酵液冷却至10以下，离心（4000r/min）分离，除去上层清液，得到菌体，将细胞悬浮于10倍体积PBS缓冲溶液中，于冰浴下进行超声破碎，反复5次，每次5s，离心（4000r/min）分离后，用0.1%TritonX-100的溶液充分搅拌均匀，进行洗涤。洗涤三次后，离心（10000r/min20分钟），可得到包涵体。细胞破碎后离心分离的包涵体沉淀物中，除目标蛋白质外，还有其他蛋白质、核酸等的存在，经过洗涤，可以除去吸附在包涵体表面的不溶性杂蛋白、膜碎片等，达到纯化包涵体的目的。洗涤多采用较温和的表面活性剂（如TritonX-100）或低浓度的弱
23、变性剂（如尿素）等。洗涤剂的浓度非常重要，通常不要太高，以免包涵体也发生溶解。,3.8 包涵体-变性溶解,二、包涵体的变性溶解包涵体中不溶性的活性蛋白产物必须溶解到液相中，才能采用各种手段使其得到进一步纯化。一般的水溶液很难将其溶解，只有采用蛋白质变性的方法才能使其形成可溶性的形式。常用的变性增溶剂有十二烷磺酸钠（SDS）、尿素、有机溶剂（乙腈、丙酮）、pH9.0的碱溶液或盐酸胍等。十二烷基磺酸钠（SDS）是曾经广泛使用的变性剂。它可在低浓度下溶解包涵体，主要是破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用。但是结合在蛋白质上的SDS分子难以除去。一般SDS的使用浓度为1%2%（w/v）。,3.8 包涵体-变
24、性溶解,尿素和盐酸胍可打断包涵体内的化学键和氢键。 用（810）mol/L 的尿素溶解包涵体，其溶解速度较慢，溶解度为70%90%。在复性后除去尿素不会造成蛋白质的严重损失，同时还可选用多种层析方法对提取到的包涵体进行纯化。但用尿素溶解对蛋白质很难恢复活性。盐酸胍对包涵体的溶解效率很高，达95%以上，溶解速度快。缺点在于成本较高，且除去盐酸胍时，蛋白质会有较大的损失，而且盐酸胍对后期离子交换提纯有干扰作用。对于含有半胱氨酸的蛋白质，其包涵体形式通常含有链间形成错配的无活性的二硫键，因此还要加入还原剂使二硫键处于可逆断裂状态。常用的还原剂有二巯基乙醇（2-ME）、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓
25、糖醇、半胱胺酸等。对于目标蛋白无二硫键的包涵体加入还原剂也有增溶作用，可能是含有二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。,包涵体-蛋白质的复性,由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物活性，加上剧烈的处理条件，使蛋白质的高级结构破坏，因此蛋白质的复性特别重要。所谓复性是指变性的包涵体蛋白质在适当条件下使伸展的肽键形成特定三维结构，使无活性的分子成为具有特定生物学功能的蛋白质。其操作方法是用透析法或超滤法，缓慢除去变性液中多余的变性剂和还原剂，使伸展的肽链恢复到正常折叠状态，错误的二硫键进行正常链接。也可采用稀释复性的方法，直接加入水或与变性液相同的、不含还原剂的缓冲溶液，改变蛋白质分子周围溶剂的性质，促进肽链正常折叠和二硫键重新组合。人-干扰素的复性操作中，就是将变性溶液用50mmol/L的Tris-HCl缓冲溶液稀释100倍，使尿素浓度小于0.1mol/L,在4下搅拌24小时，即可完成蛋白质的重折叠过程。复性过程是一个十分复杂的过程，迄今为止包涵体形成和复性过程中发生聚集的机理尚不清楚，已建立的高效复性方法是在反复实验和优化的基础上建立的，因此具体操作中要不断探索最适用的条件。,Thank you for your join,
