1、04 菌种保藏的原理和方法,04 菌种保藏的原理和方法,一、菌种保藏的目的,保存、不退化,二、菌种保藏的原理,DNA复制时自发突变是造成菌种退化的原因，因此要创造代谢不活泼的状态 。,休眠态（孢子、芽孢） 代谢不活泼的状态 环境（干燥、低温、缺氧、缺营养）,斜面保藏法和穿刺保藏法 沙土管干燥保藏法 真空冷冻干燥保藏法 液氮保藏法 悬液保藏法 低温保藏法,三、菌种保藏的方法,一种良好的菌种保藏方法，首先应保持原菌优良性状长期稳定，同时还应该考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。具体的方法很多，现把多种方法按类排列后作一综合性表解，以便读后有一全面了解。,（1）斜面保藏法：是一种短期、过渡
2、的保藏法，用新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在4冰箱保存（过低，会结冰；太高，达不到保存目的）。保存期一般为36月。 注意点： （1）水分：用牛皮纸避免水分蒸发，或用橡皮塞 （2）培养基：专门设计的培养基，营养相对不太丰富 （3）微生物状态：孢子或芽孢长好后，再保藏，不易退化 （4）温度：4冰箱保存（过低，会结冰；太高，达不到保存目的） （2）穿刺保藏法： （略）,1、斜面保藏法和穿刺保藏法,2.沙土管干燥保藏法（略）,3.真空冷冻干燥保藏法,是目前常用的较理想的一种方法。其基本原理是在较低温度下，（-18），快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华
3、。在这样的环境中，微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异。一般可保存510年左右。,4.液氮保藏法,是适用范围最广的微生物保藏法，其保存期最长。因为液氮的温度 可达-196，远远低于菌种新陈代谢作用停止的温度（-130）， 故此时代谢活动已停止。保藏期一般为23年，长的可达9年之久。,5.悬液保藏法（略）,6.低温保藏法（略）,四、菌种保藏的共同注意点,1、严格的无菌操作； 2、用于保存的微生物在生长前必须处于它生长良好的状态； 3、保藏过程中要防止退化的发生（不同的保藏方法，分别有不同的保存时间。）,五、与菌种保藏相关的几个概念,1、活化：把微生物从保藏斜面转接到活化斜面上，使其活性得以
4、 恢复。相对而言活化斜面培养基中的营养丰富些。,保藏斜面 活化斜面,2、复壮：使微生物活性恢复的同时，恢复其优良的生产性能。,保藏斜面 平板分离（自然分离，剔除退化菌种） 活化斜面,六、菌种保藏机构,菌种保藏机构的任务是：在广泛收集生产和科研菌种、菌株的基础上，把它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、不乱和便于交换使用的目的。国际上很多国家都设立了菌种保藏机构。1979年7月在国家科学技术委员会领导下成立了中国微生物菌种保藏管理委员会（CCCCM，简称中国菌保会），并确定由有关单位组成菌种保藏管理中心（6个,1984 年增加1个，现在共7个）。它的任务是：促进我国微生物菌种保藏的合作、协调与发展，
5、以便更好地利用微生物资源，为我国的经济建设、科学研究和教育事业服务。各保藏管理中心从事应用于微生物学各学科的微生物,菌种的收集、保藏、管理、供应和交流工作。中国菌保会是国际认可的菌种保藏机构，下设7个全国性菌种保藏管理中心： （1）普通微生物菌种保藏管理中心； （2）农业微生物菌种保藏管理中心； （3）工业微生物菌种保藏管理中心；（4）医学微生物菌种保藏管理中心； （5）抗生素菌种保藏管理中心； （6）兽医微生物菌种保藏管理中心； （7）林业微生物菌种保藏管理中心。（1984 年增加）国内两个专利微生物保藏单位分别是：设立在北京的中国科学院微生物研究所的中国普通微生物保藏中心（CCGMC）；武
6、汉大学生命科学学院的中国典型培养物保藏中心（CCTCC）,国内举例： 中国微生物菌种保藏委员会（ CCCCM, China Committee for Culture Collection of Microorganisms）,中国典型培养物保藏中心（CCTCC） （地址：武汉大学生命科学学院）,国外举例： ATCC（美国菌种保藏所 / 美国典型菌种保藏中心，American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA）ATCC创立于1899年，是著名的微生物菌种保藏中心。它是一个实力很强的私立的非盈利性质的机构，现已成为世界上培养物最多
7、的保藏中心，是国际受托保存专利菌种的单位，是国际认可的保藏机构。目前仅采用两种最有效的保藏方法，即保藏期一般达515年的冷冻干燥保藏法和保藏期一般达20年以上的液氮保藏法，两者结合可达到既可最大限度减少不必要的传代次数，避免菌种退化，又不影响随时分发给全球用户，效果甚佳。而我国菌种保藏一般采用三种方法：斜面定期移植法；液体石蜡封藏法；冷冻干燥保藏法。对放线菌还另有沙土法，对丝状真菌另加麸皮法保藏。（周德庆教材：我国CCCCM的规模目前为亚洲第一（有1.4万株各种微生物），现在采用3种保藏法（斜面传代法、冷冻干燥保藏法和液氮保藏法）进行保藏。）,两种保藏法结合使用的原理是：当菌种保藏单位收到合适
8、的纯种时，先将原种制成若干管液氮菌种作为长期保藏用菌种，然后再制一批冷冻保藏菌种作为用户分发用。约经5年后，假定第一代（原种）的冷冻干燥保藏菌种已分发完毕，就再打开一支液氮保藏原种制备大量冷冻保藏菌种，这样下去，至少在20年内，凡获得该菌种的用户，至多只是原种的第二代，从而保证了保藏菌种与分发菌种的高质量标准。, I FO（发酵研究所，日本大阪. Institute for Fermentation, Osaka, Japan ） NCTC（国家典型菌种保藏中心,英国伦敦. National Collection of Type Culture. London, United Kingdom）
9、 NRRL（Northern Utilization Research and Development Division, U.S Department of Agriculture. Peoria, U.S.A. 美国农业部、北方开发利用研究部，美国皮奥里亚市）与ATCC同为美国有名的菌种保藏机构，收藏的微生物标本近2万株，以酵母最多，近1万株。 CBS（荷兰的霉菌中心保藏所, Centraalbureau Voor Schimmel Cultures, Baarn, holand）是世界上最著名的真菌保藏机构，保藏的各种菌株近2万种，其中霉菌达12000种以上，酵母3500株，另有少量细菌和放线菌。 ARS (美国农业部农业研究服务部, Agricultural Research Service, Northern Utilization Research and Development),1、微生物菌种保藏的基本原则是什么？常用的有哪些方法？以放线菌为例，详细说明此菌种保藏的基本操作过程。 2、比较大的菌种保藏机构有哪些？ 3、常用的菌种保藏方法有斜面冷冻法、菌丝速冻法、真空冷冻干燥保藏法、液氮超低温保藏法等，比较大的菌种保藏机构有美国典型菌种保藏中心（ATCC）、日本大阪发酵研究所（IFO）等。,思考题,
