1、蛋白质的空间结构和功能1构象(conformation)指的是，一个由多个碳原子组成的分子，因单键的旋转而形成的不同碳原子上各取代基或原子的空间排列，只需单键的旋转即可造成新的构象。多肽链主链在形式上都是单键。因此，可以设想一条多肽主链可能有无限多种构象。然而，一种蛋白质的多肽链在生物体正常的温度和 pH下只有一种或很少几种构象，并为生物功能所必需。这种天然的构象是什么样的因素促成的? 答：由于肽键因共振结构而使 CN 键具有部分双键的性质，不能自由旋转，因而使得一条多肽主链构象的数目受到了极大限制。与位于相邻刚性平面交线上的 C相连接的侧链基团的结构、大小和性质对于主链构象的形成及稳定有很大
2、的影响，使多肽链主链构象数目又受到很大的限制。因为 C与两个刚性平面连接的单键的旋转度不同程度受到侧链的限制。各种侧链基团相互作用所形成的各种力使蛋白质在热力学上达到了一种最稳定的构象2假若一条多肽链完全由丙氨酸构成，什么样的环境促使它很可能形成螺旋，是疏水环境还是亲水环境? 答；一条多肽链呈 -螺旋构象的推动力是所有肽键上的酰胺氢和羰基氧之间形成的链内氢键。在水环境中，肽键上的酰胺氢和羰基氧既能形成内部(-螺旋内)的氢键，也能与水分子形成氢键。如果后者发生，多肽链呈现类似变性蛋白质那样的伸展构象。疏水环境对于氢键的形成不能提供任何竞争，因此，更可能促进 - 螺旋结构的形成。3以 nm 为单位
3、计算 -角蛋白卷曲螺旋（ coiled coil）的长度。假定肽链是由 100 个残基构成。 答：-角蛋白的每条肽链呈 - 螺旋构象，而每个 -螺旋含 3.6 个残基。在 -角蛋白中，每轮螺旋的长度为 0.51nm。因此, -角蛋白卷曲螺旋（coiled coil）的长度是：（100 残基3.6 个残基/轮） 0.51/轮14.2nm4一种叫做 Schistosoma mansoni 寄生虫的幼虫能感染侵入人的皮肤。这种幼虫分泌出能裂解的-Gly-Pro-X-Y-（ X 和 Y 可能是几种氨基酸中的任何一种）顺序中的 X 和 Y 之间肽键的酶。为什么该酶活性对这种寄生虫侵入是重要的。答：-Gl
4、y-Pro-X-Y-顺序频繁出现在胶原蛋白分子中，在身体的各部位都存在，包括皮肤。由于该幼虫酶能催化胶原蛋白多肽链裂解，故该寄生虫能进入宿主皮肤而生存。5是 Trp 还是 Gln 更有可能出现在蛋白质分子表面？是 Ser 还是 Val 更有可能出现在蛋白质分子的内部？是 Leu 还是 Ile 更少可能出现在 -螺旋的中间？是 Cys 还是 Ser 更有可能出现在 - 折叠中？ 答：蛋白质氨基酸残基在蛋白质结构中出现的位置与这些氨基酸残基的亲水性或疏水性相关。亲水性残基（极性残基）通常位于蛋白质分子的表面，而疏水性残基（非极性残基）通常位于蛋白质分子疏水的内部。Gln 是亲水性残基，它比 Trp
5、 更有可能出现在蛋白质分子表面。Val 是非极性残基，它比 Ser 更有可能位于蛋白质分子的内部。 Ile 在它的 碳位上有分支，不利于 -螺旋的形成，因此它通常不出现在 - 螺旋中。侧链小的氨基酸残基常出现在 -折叠中，因为这有利于片层的形成。所以 Ser 更有可能出现在-折叠中。6下面的多肽哪种最有可能形成 -螺旋？哪种多肽最难以形成 - 折叠？ CRAGNRKIVLETY；SEDNFGAPKSILW；QKASVEMAVRNSG 答：多肽最有可能形成 -螺旋，因为它的三个带电荷的残基(Lys,Glu,Arg)在该螺旋的一侧相间排成一行。一个有邻近碱性残基(Arg 和 Lys)的多肽会使螺旋
6、去稳定。多肽含有 Gly 和 Pro，这两种氨基酸是螺旋的强破坏者。Gly 和Pro 的存在也会阻止 -折叠的形成。所以多肽最难以形成 -折叠。7胰岛素是由 A、B 两条链组成的，两条肽通过二硫键连接。在变性条件下使二硫键还原，胰岛索的活性完全丧失。当巯基被重新氧化后，胰岛素恢复的活性不到天然活性的 10%请予以解释。 答：胰岛素是以前体的形式合成的。前体分于是一条单一的肽链。在前体合成及折叠后，切除前体分子的一部分(包括连接肽 C 肽)，留下由二硫键连接的 A 和 B 两条肽链。这样，天然的胰岛素由于缺少 C 肽，因而也就缺乏指导肽链折叠的某些所必需的信息。所以当胰岛素变性和还原，随之复性，
7、二硫键的形成是随机的。在这种情况下是不能完全恢复到天然活性的。这并不与氨基酸顺序指导蛋白质折叠的基本原则相矛盾。 8对于密度均一的球状蛋白质来说，随着蛋白质分子增大，其表面积体积(A V) 的比例是增大还是减小？随着蛋白质分子增大，其亲水侧链氨基酸残基与疏水侧链氨基酸残基的比例是增大还是减小? 答：对于密度均一的球状蛋白质来说，随着分子量(即分子大小)增大，其半径(r)也增大。由于表面积4r 2，体积=4/3r 3，因此 从这个表达式来看，随着蛋白质分子量的增大，它的表面积体积的比例减小了。即随着蛋白质分子的增大，体积的增大比表面积增大更快。 由于极性基团的亲水性，大多数分布在球状分子的表面，
8、非极性侧链基团的疏水性，大多数聚集在球状分子的内部由于随着分子量增大而体积增大，内部空间也增大。因此内部就可以容纳更多的具疏水侧链基团的氨基酸残基。所以随着球状蛋白质分子量的增大，亲水侧链氮基酸残基与疏水侧链氨基酸残基的比例将减小。9胎儿血红蛋白（Hb F）在相当于成年人血红蛋白（Hb A） 链 143 残基位置含有Ser，而成年人 链的这个位置是具阳离子的 His 残基。残基 143 面向 亚基之间的中央空隙。为什么 2,3-二磷酸甘油酸（ 2,3-BPG）同脱氧 Hb A 的结合比同脱氧 Hb F 更紧？Hb F 对 2,3-BPG 的低亲和力如何影响到 Hb F 对氧的亲和力？Hb F
9、的 P50 是 18 托(torr)，Hb A 的 P50 是 26 托。基于这两个数值如何解释氧从母亲血液有效转运到胎儿。 答：由于 2,3-BPG 是同脱氧 Hb A 中心空隙带正电荷的侧链结合，而脱氧 Hb F 缺少带正电荷的侧链（ 链 143 位的 His 残基） ，因此 2,3-BPG 是同脱氧 Hb A 的结合比同脱氧Hb F 的结合更紧。2,3-BPG 稳定血红蛋白的脱氧形式，增高脱氧血红蛋白的份数。由于Hb F 同 2,3-BPG 亲和力比 Hb A 低，Hb F 受血液中 2,3-BPG 影响小，分子的氧合形式的份数较大，因此 Hb F 在任何氧分压下对氧的亲和力都比 Hb
10、A 大。在 2040 氧分压下，Hb F 对氧的亲和力比 Hb A 大，亲和力的这种差别允许氧从母亲血向胎儿有效转移。10在生理条件下，多聚赖氨酸呈随机卷曲的构象。在什么条件下它可以形成 -螺旋？ 答：在生理条件下，赖氨酸残基的带增电荷的侧链彼此排斥，不能形成 -螺旋。当它所处环境的 pH 上升超过它的侧链可界离基团的 pK（10.5）时才能形成 -螺旋。 11某蛋白质用凝胶过滤法测定的表观分子量是 90kD；用 SDS-PAGE 测定时，它的表观分子量是 60kD，无论 2-巯基乙醇是否存在。哪种测定方法更准确？为什么？ 答：蛋白质的分子形状影响它在凝胶过滤时的行为。分子形状较长的蛋白质在凝
11、胶过滤时具有类似于分子较大的蛋白的行为。用 SDS-PAGE 测定的蛋白质分子量应该是比较准确的，因为变形后的蛋白质的迁移速度只取决于它的分子大小。 12请根据下面的信息确定蛋白质的亚基组成： 用凝胶过滤测定，分子量是200kD；用 SDS-PAGE 测定，分子量是 100kD；在 2-巯基乙醇存在下用 SDS-PAGE测定，分子量是 40kD 和 60kD。 答：凝胶过滤分离的蛋白质是处在未变性的状态，如果被测定的蛋白质的分子形状是相同的或者是相似的，所测定的分子量应该是较准确的。SDS-PAGE 测定蛋白质的分子量只是根据它们的大小。但这种方法能破坏寡聚蛋白质亚基间的非共价作用力，使亚基解
12、离。在这种情况下，所测定的是亚基的分子量。如果有 2-巯基乙醇存在，则能破坏肽链内或肽链间的二硫键。在这种情况下进行 SDS-PAGE，所测定的分子量是亚基的分子量（如果亚基间没有二硫键）或者是肽链的分子量（如果亚基是由二硫键连接的几个肽链组成） 。根据题中给出的信息，该蛋白质的分子量是 200kD，由两个大小相同的亚基（100kD ）组成，每个亚基由两条肽链（40kD 和 60kD）借二硫键连接而成。 13每分子人细胞色素 c 含有 18 分子的赖氨酸。100 克细胞色素 c 完全水解得到 187 克的赖氨酸。求细胞色 c 的分子量。答: 根据组分的百分含量求蛋白质的最低分子量可按下式计算：
13、细胞色素 c 的真实分子量=最小分子量某氨基酸数=6841812300. 这一结果与用物理方法测定的结果很接近。3-14有一种混合液含有五种多肽(P 1、P 2、P 3、P 4 和 P5)，在 pH8.5 的条 件下进行电泳分离，染色后揭示出如图 26a 的迁移图谱。已知 这五种多肽的 pI 是：P1 为 9.0，P 2 为 5.5，P 3 为 10.2，P 4 为 8.2， P5 为 7.2。并且已知它们的分子量都接近 1200。请在 图上鉴定出每条带相应的多肽；现有一种 pI 为 10.2 的多肽(P 6)，它的分子量大约为 600。该肽若与上述五肽一起在 pH8.5 下电泳，请你指出它的
14、位置。 图 26 几种蛋白质的电泳迁移图（a）和它们迁移的相对位置（b）答：根据它们的等电点以及它们在 pH8.5 条件下所带净电荷的多少，很容易鉴定出它们在电泳图谱上的位置(图 2-6b)。 P 6 与 P3 具有相同的 pI，即是说，在 pH85 的条件下，它们带有等量的净电荷。但 P6 的分子量仅是 P3 的一半，它的迁移率是 P3 的 2 倍，电泳后它在支持物上位置应比 P3 更接近于负极(如图 2-6b 所示 )。 (在一定粘度的介质中，在恒压下，带电颗粒的迁移率由电荷与颗粒大小的比例决定，即：（迁移率）（Q（电荷）/r（大小）。为了在 Qr 基础上估计出相对迁移率，可用物质的分子量
15、去除 pIpH ，pIpH 视为 Q 值的一种量度。) 15一种纯净的蛋白质样品用普通的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)在 pH8.2条件下进行分析鉴定，得到如图 27(A)的结果。该蛋白质样品在用 SDS 处理后，接着用 SDS-PAGE 进行分析，得到如图 27(B)的结果。通过对上述两种电泳结果的比较，关于该蛋白质的结构你将得出什么样的结论？该蛋白质的等电点是低于 pH8.2 还是高于 pH8.2？ 答：普通聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质时主要是根据各组分的 pI 的差别。图 2-7(A)的结果只呈现单一的带，表明该蛋白质是纯净的。由于 SDS 是一种带负电荷的阴离子去垢剂，并且具有长长的疏
16、水性碳氢链。它的这种性质不仅使寡聚蛋白质的亚基拆离，而且还能拆开肽链的折叠结构，并且沿伸展的肽链吸附在上面。这样，吸附在肽链上的带负电荷的 SDS 分子使肽链带净负电荷，并且吸附的 SDS 的量与肽链的大小成正比。结果是，不同大小的肽链将含有相同或几乎相同的 Qr 值。由于聚丙烯酰胺凝胶基质具有筛分效应，所以，分子较小的肽链将比较大的、但具有相同的 Qr 值的肽链迁移得更快。若蛋白质是由单一肽链或共价交联的几条肽链构成，那么在用 SDS 处理后进行 SDS-PAGE，其结果仍是单一的一条带。若蛋白质是由几条肽链非共价结合在一起，在用 SDS 处理后进行 SDS-PAGE，则可能出现两种情况：一
17、种仍是一条带，但其位置发生了变化(迁移得更快)，表明该蛋白质是由几条相同的肽链构成，另一种可能出现几条带，则可以认为该蛋白质是由大小不同的几条肽链构成 图 27 蛋白质的鉴定 图 2-7(B)的结果表明该蛋白质是由两种大小不同的肽链借非共价键结合在一起的寡聚体蛋白质。从图 27 的电泳结果我们可以断定该蛋白质的等电点低于 pH8.2。16一个蛋白质混合物含有下面几种不同的组分： a Mr12，000 pI=10； b Mr=62，000 pI=4 c Mr28，000 pI=7； d Mr=9，000 pI5 不考虑其他因素，分别指出在下述情况下被洗脱的顺序。 该混合物用 DEAE-纤维素柱层
18、折时，以逐渐增高洗脱液的盐浓度方式进行洗脱。 该混合物用 SephadexG-50 凝胶柱层析分析。 答：DEAE-纤维素是一种常用于蛋白质分离的阴离子交换剂。在分离蛋白质样品之前，DEAE-纤维素先用较低的离子强度和 pH 为 8 的缓冲液平衡，蛋白质样品也溶于同样的缓冲液中。在这样的条件下，DEAE-纤维素大部分解离，并且带固定的正电荷。在这种 pH 下，蛋白质样品中各组分带净正电荷（但有差异，或带相反性质的电荷），这些带不同电荷的组分与DEAE-纤维素的结合力不同。洗脱液的离子强度影响带电颗粒与交换剂间的结合力。当升高洗脱液的离子强度时，会降低交换剂与被分离组分的静电吸引力。由上所述，该
19、蛋白质混合物各组分被洗脱下来的先后顺序是:acdb。 Sephadex 是葡聚糖凝胶，它是具有不同交联度的网状结构，其颗粒内部的孔径大小可以通过控制交联剂与葡聚糖的比例来达到因此它具有筛分效应用它作为填充料制成层析柱，可以根据被分离物质的大小进行分离。已有不同型号的葡聚糖凝胶用于不同物质的分离。当蛋白质混合样品随洗脱液向下流动时，比凝胶颗粒孔径大的蛋白质分子不能进入凝胶网格内，被排阻在凝胶颗粒的外部；比凝胶颗粒孔径小的蛋白质分子则能进入到网格内部。其结果是，分子大的蛋白质则随着洗脱液直接从柱上流出，分子比较小的蛋白质则因走了许多弯路”而被后洗脱下来。分子愈小，“弯路”走得愈多，洗出的速度愈慢。根据这一原则，上述蛋白质混合物从SephadexG50 洗脱出的顺序是：bcad。 3-17一种分子量为 24,000、pI 为 5.5 的酶被一种分子量类似、但 pI 为7.0 的蛋白质和另外一种分子量为 100,000、pI 为 5.4 的蛋白质污染。提出一种纯化该酶的方案。 答：用凝胶过滤(即分子排阻层析)法先除去分子量为 100,000、p I 为 5.4 的蛋白质，余留下来的低分子量的含酶的混合物再用离子交换层析法分离，于是就能获得所需要的纯酶。
