1、黑曲霉产植酸酶发酵条件的研究摘要：研究培养基组成和培养条件对黑曲霉液体发酵产植酸酶的影响。以植酸酶活力为评价指标，利用单因素试验和 L9（3 4）正交试验考察摇瓶发酵条件下培养基组成，起始 pH 值、温度、接种量、装量、种龄、发酵时间对黑曲霉产植酸酶的影响。结果表明，最佳培养基组成为：麸皮 5，NH 4Cl0.13，MgSO 47H2O 0.1,MnSO 4H2O 0.07, FeSO 47H2O 0.01，KCl 0.05，KH 2PO40.01；最佳培养条件为：培养温度31，pH 6.0，接种量14，种龄72-84h，摇床转速为150r/min，发酵时间6d。在此条件下，植酸酶活力可达43
2、.712U/mL。关键词：植酸酶；黑曲霉；液体发酵；正交试验Studies on the fermentation conditions of producing phytase by Aspergillus niger Abstract：To investigate the liquid fermentation for phytase production by Aspergillus niger . The single factor tests and orthogonal experiment were employed to evaluate the optional fermen
3、tation conditions for phytase production experiment by liquid-state fermentation with the optimal conditions. The results showed that the optimal medium confent were as follows: wheat bran 5, NH 4Cl0.13, MgSO47H2O 0.1, MnSO 4H2O 0.07, FeSO 47H2O 0.01, KCl 0.05, KH 2PO40.01; the optimal fermentation
4、conditions for phytase production were:fermentation temperature 31, the initial pH6.0, the inoculm 14, seed age 72-84h, the shake speed 150r/min, the fermentation time 6d. Under those conditions, the phytase activity reached 43.712U/mL.Key words：phytase; Aspergillus niger; liquid fermentation; ortho
5、gonal experiment1 前言1.1 植酸及植酸酶植酸(Phytic acid)，又称肌醇六磷酸，是植物籽实中磷的主要贮存形式。在谷物、豆类、油料等作物的籽实中，磷的基本储存形式是植酸磷，其含量高达种子干重的13，约占植物中总磷的6080。但是以植酸磷形式存在的磷却因单胃动物体内缺乏能分解植酸(六磷酸肌醇)的酶而难以被吸收和利用，其利用率仅在040，从而造成了许多问题。首先，因为饲料中的磷源不能被有效利用，必须在饲料中另外添加无机磷(主要磷酸氢钙)以满足动物对磷的需求；其次，植物性饲料中85左右的磷没法被单胃动物吸收和利用，从而直接排出体外，粪便中大量的磷使水源和土壤遭受严重污染。再
6、次，植酸磷还是一种抗营养因子，它在动物胃肠道的消化过程中会与多种金属离子以及蛋白质螯合成相应的不溶性复合物，使一些消化酶的作用受到抑制，多种微量元素和氨基酸的利用率下降，降低了动物对以上营养物质的生物利用率。第四，目前饲料生产中用于生产磷酸氢钙的原料是磷矿、石灰和硫酸，全球磷矿的资源有限，且生产1t 磷酸氢钙成品就要排出约1t 以上的废物(磷石膏)，大型磷酸氢钙生产企业一天的产量在数百吨以上，每天排出的废物数量更大，企业附近磷石膏堆积成垃圾山，磷石膏容易下滑而成为附近的安全隐患，而硫酸也造成严重的空气、水源和土壤的污染；另一方面，饲料中添加无机磷将造成磷源的浪费，饲料成本增加 1,2。植酸酶是
7、催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸的一类酶的总称，自然界存在很多能水解植酸盐的酶类，统称“植酸酶”。植酸酶广泛存在于动植物组织和微生物细胞中，在植物中主要存在于谷物和豆科植物的种子和花粉中，而在动物中主要存在于脊椎动物的红细胞和血浆以及哺乳动物的小肠内。产植酸酶的微生物有细菌、酵母和真菌等，饲料中使用的植酸酶主要来自真菌，比如黑曲霉( Aspergillus sp )，其生产的植酸酶被认为是活性最强的 3,4。 植酸酶按结构的不同主要可以分为三类霉菌及部分细菌来源的PhyA 与 PhyB、 Bacillus subtilis 来源的 PhyC、玉米植酸酶 2。3-植酸酶(EC.3.1.3.8)
8、PhyA 与6-植酸酶(EC.3.1.3.26) PhyB 属于同一酶家族，它们具有一个共同的活性部位保守序列 RHGXRXP，并且它们的酶活性不需要辅助因子(如：金属离子等)来维持 4。 PhyC 是 Kerovuo等 5从 Bacillus subtilis 中纯化出来的植酸酶，该分子的三维模型近似于有6个叶片螺旋的基本形式。 PhyC 没有通常植酸酶活性中心的保守序列 RHGXRXP，而且需要 Ca2+维持催化活性及稳定性 6。2008年2月，欧盟发出了磷资源的红色预警，我国专家称中国的磷资源也只能开采20年。世界能源危机加重，原料价格普遍上涨，环保压力日益昭显，这无疑为植酸酶的发展提供
9、良机，科技的发展将促使植酸酶生产与应用进入一个新的发展时期。如何从“植酸酶之困”转变为“植酸酶之盛”，是每个从业者应该思考的问题。1.2 植酸酶的分子改造和晶体分析1.2.1 植酸酶的分子改造 天然的植酸酶不可能在各个性质上都很优秀，所以对其进行基因工程改造，特别是对蛋白质中和活性相关的几个氨基酸的定点突变研究是有必要的。目前对影响植酸酶热稳定性、最适 pH、活性的氨基酸残基进行了大量的研究，并获得的多个性质优秀的基因工程改造的植酸酶。（1）植酸酶分子的糖基化修饰蛋白质的糖基化修饰有助于提高植酸酶的热稳定性。Han 等 7把 A.niger phyA 基因在 P.pastoris 中表达，重组
10、 phyA 的分子质量变为95 ku，比 A.niger 天然表达的phyA 的分子质量(80 ku)大19，在糖基化水平上略有提高，最适温度变为60，比原酶的最适温度提高2。通过一定的方法去糖基化后，酶分子质量减为55 ku，同时热稳定性也降低34。设计新的表达载体使 phyA 基因在 Saccharomyces cerevisiae 中表达，由于S cerevisiae 表达系统的高度糖基化作用，重组酶的分子质量达到120ku，比 A.niger 天然表达的 phyA 的分子量大50。重组酶的最适酶促反应温度5560，比原酶的范围更宽；未完全纯化的重组酶在55与80下分别作用15 min
11、之后，酶活分别保留95和75。而同样条件作用后的商品酶 PhyA 酶活保留分别为72和51。该重组phyA 经去糖基化后，酶活只降低了9，但酶的热稳定性大为降低，80加热15 min酶活损失40。去糖基化后的分子质量变为50 ku，与由其他宿主系统表达的基因相同但耐热性差的 -phyA 的分子质量相似。充分说明了糖基化程度对该酶热稳定性有重要影响。(2)植酸酶的定点突变对 phyA 的基因工程改造已经基本成熟。Tomschy 等 8通过比较分别来自 A niger 菌株 NRRL3135和 T213中不同活性的两个植酸酶，发现12个不同的氨基酸中第297号残基 Arg 突变为 Gln 的定点突
12、变导致了植酸酶与底物结合能力下降，从而引起了活性的降低。Tomschy 等 9对 A.fumigatus 中与最适 pH 相关的多个极性氨基酸残基(Gln27、Serl40、Aspl41、Gly277、Tyr282)进行了研究，初步确定了其在 pH 和活性方面的作用。Mullaney 等 10将来源于 A niger 的 phyA 进行 Glu300Lys 点突变。获得了 pH4.0和37下活性提高了56的植酸酶。彭日荷等 11以烟曲霉中耐高温植酸酶基因 phyA 为基础，通过定点突变将部分密码子替换成毕赤酵母的偏爱密码，得到的重组子经过高密度发酵。其表达量比原始基因提高13倍，并有很好的耐热
13、性。谷维娜等 12对 A.fumigatus 来源植酸酶的Q23L 和 Q23L G272E 进行突变研究，结果发现突变酶 Q23L 在 pH5.5的比活性由51 U/mg 提高到109 U/mg，突变酶 Q23L G272E 在pH3.04.5和 pH 6.57.0时的稳定性比 Q23L 有所提高。近年来，对细菌植酸酶的改造也有了系统的研究，现在对细菌植酸酶的改造大多针对 E coli 的 appA。Rodriguez 等 13将 appA 和其三个多位点突变的突变体在 Pichiapastoris 表达，发现突变体Cys200Asn/Asp207Asn/Ser211Asn 虽然糖基化没有增
14、强，但其植酸酶活性在多个方面得到了提高。(3)植酸酶的同序概念同序概念是对一组同源蛋白质的氨基酸序列进行比较，以一定的标准程序计算出各氨基酸序列的共有序列。人工合成同序列基因后重组表达。Lehmann 等 14，15 把同序概念这种方法应用在真菌植酸酶家族含13种不同子囊菌类的序列，进行同序比较计算，设计合成了同序植酸酶基因 fcp，构建表达载体 pFP，在H.polymorpha 中表达出同序植酸酶-1。同序植酸酶-1的最适温度为71，而亲代植酸酶的最适温度为4555，增加了1626，同序植酸酶-1Tm 为78，比亲代植酸酶增加了1522。而催化性质与大多数亲本植酸酶相似。经定点突变发现在同
15、序植酸酶-1中有5个氨基酸 Y31、P225、M342、F346、Y372，表现增加同序植酸酶的热稳定性，两种残基 F296、A384不稳定。Lehmann 等 16在上述研究的基础上，通过增加更多的真菌植酸酶序列到组合中去。这些组合用于计算出两种同序植酸酶氨基酸序列，即同序植酸酶-10和同序植酸酶-l1。同序植酸酶-10比同序植酸酶-1Tm 和最适温度分别表现7.4和9.0增加。通过定点突变检测，8个位点氨基酸残基的替换(E35A、D174N、E244D、R268I、R306H、S341T、A356K、G381A)，和l1个位点氨基酸残基的替换(E35A、D46K、D174N、T191L、E
16、199T、E244D、R268I、R306H、S341T、A356K、G381A) 可增加植酸酶的热稳定性，将这些突变分别增加到同序植酸酶-1中，产生同序植酸酶-1-thereto(8)和同序植酸酶-1-thermo(11)。同序植酸-1-thereto(8)Q27T 和同序植酸酶-1-thereto(11)Q27T 比同序植酸酶-1Tm 增加6.7和10.5。Q27T 突变对植酸酶的热稳定性几乎没有影响。(4)杂合植酸酶用杂合酶的方法可将同源植酸酶的相同部位的二级结构单元进行交换，产生杂合植酸酶，提高植酸酶的热稳定性。Jermutus 等 17根据 A.niger 植酸酶晶体结构，在 A.t
17、erreus 植酸酶的表而 螺旋(6682区域)被相应 A.niger 植酸酶置换，导致杂合酶蛋白 A(phyA)热稳定性改善，与 A.niger 相似，而酶活性未变。其原因在于两个不同来源的植酸酶在分子表面仅螺旋中氨基酸改变S58Y、T70L、A78V 导致疏水相互作用，增加热稳定性。同源蛋白稳定性的不同是由于许多在进化中分散在整个序列中单点突变引起的。通过用更稳定或较不稳定相互作用的同源片段改变具很小稳定性或更多不稳定的相互作用的元素能引起稳定性的改善。(5)结构延伸突变结构延伸突变是在蛋白质的 C 端上连接一段随机肽段。从而改变蛋白质的结构，达到改善酶性质的目的。吴琦等18在植酸酶 C
18、端增加了来源于表达载体序列的13个氨基酸残基，使融合表达植酸酶其最适反应温度高达75，比出发菌株植酸酶的高15，比非融合表达植酸酶的高25；其耐热性也显著提高。90处理10 min 后的残留酶活性为37时的75.7。陈惠等 19将来源于黑曲霉 N25的植酸酶基因 PCR 扩增获得结构延伸突变植酸酶基因 phyA，将重组表达载体在 GS115酵母中表达。纯化的突变酶与野生型酶相比，最适反应温度上升了3。75处理10 min。热稳定性提高21 ，比活力略有提高；最适反应 pH 值为5.6，有效 pH 值为4.66.6，比未突变酶扩大了0.4个单位。(6)植酸酶的定向进化定向进化是在试管中模拟达尔文
19、进化过程，通过随机突变和重组，人为制造大量的突变，按照特定的需要和目的给予选择压力，筛选出具有期望特征的酶，实现分子水平的模拟进化。这是目前改善酶性能最有前途的方法。该方法是在不需事先了解酶的空间结构和催化机制的条件下，通过各种突变方法向编码酶的基因中引入突变，突变的基因可以通过 DNA 改组等方法进行重新组装，提高基因进化的效率，获得一些性能改变的突变酶。胡光星 20对来自黑曲霉( A.niger)的植酸酶基因经过四轮改组后筛选到酶活性比原始植酸酶提高12倍的改组基因，克隆到毕赤酵母后在50L 发酵罐上高密度发酵，酶活单位由原来的6.810 4IU/mL 提高到80l0 5IU/mL。魏威等
20、 21通过随机突变的方法，对来源于 A.niger 的植酸酶基因 phyA 进行了改造，将其导人大肠杆菌 BL21(DE3)中，构建工程菌株 BL21-PET21a(+)-phyA。结果植酸酶基因在工程菌株中得到了高效表达，表达量达到菌体蛋白的30以上生物活性达到1500U/mg，并且复性蛋白质具有较好的热稳定性；经过75 95，30 min 的热处理后，仍然保持了生物活性，同时有明显的热激活现象，热激活后最高生物活性达到5000U/mg。Garrett 等 22从植酸酶 appA 的19个氨基酸残基中32个可能与耐热相关的密码子中筛选耐热突变体。获得了在62下1h有完全酶活，而在85下10
21、min 仍有27的活性的耐热菌株，并且在胃中的稳定性也提高3.5倍。1.2.2植酸酶的晶体结构分析通过测定的植酸酶的晶体结构，可以进一步了解植酸酶结构与功能之间的关系。最近的研究同样是在重点分析耐热植酸酶的特点和植酸酶在不同 pH 值下的构相变化。Xiang 等 23测定了来源于A.fumigatus 的耐热植酸酶晶体结构，发现该酶 Glu35-Ser42中由更多酸性氨基酸而产生的氢键以及 Gly163-Arg168和 Arg248-Ser254的环状结构中由精氨酸形成的盐键使酶更稳定；其 C 端螺旋帽结构能使其在高温作用后重折叠成活性形式；其活性中心的 His59的磷酸化也促进了其稳定。Li
22、u 等 24分析了 A fumigatus 植酸酶在 pH7.5和5.5下天然和与底物结合后的构象，确定 His59在不同 pH 条件下的质子化的不同对酶活的关键性影响；从与 E.coli 植酸酶的比较发现E.coli 植酸酶催化位点的口袋更小，以及催化位点右下方的正电荷分别有利于其催化的专一性和活性。1.3 植酸酶的转基因研究1.3.1 转基因微生物 现在植酸酶生产都采用微生物发酵的方法，而选择好的生产菌株无疑是重点。研究表明，以真菌作为生产菌株在产量，热稳定性，抗蛋白酶降解等方面都明显优于细菌。这可能与真核表达系统中的糖基化有关。（1）转基因细菌在原核表达中多是源于细菌的植酸酶基因，最多的
23、是 appA。Dharmsthiti 等 25将 appA 基因克隆到 pBBRT 质粒中，并转入 Pseudomonas putida 表达。获得最适条件在55，pH4.0，但对胰蛋白酶敏感，不适合喂养。Gerlach 等 26在 appA 基因前加上了一双精氨酸信号肽，使其能在 Bacillus subtilis 中胞外分泌表达。这使生产后加工过程得到一定程度的简化。（2）转基因真菌真核微生物表达系统的植酸酶来源较为多样。由不同的表达体系得到的植酸酶，其性质也有不同，而在同一种菌株中也会因翻译后修饰不同而有所差异。Lee 等 27将 E coli 中的appA2分别在 Saccharomy
24、ces cerevisiae(pYES2)，Schizosaccharomyces pombe(pDS472a)，和 Pichia pastoris(pPICZ alphaA)中诱导表达和 P pastoris(pGAPZalphaA)中组成性表达。四种都获得了表观分子质量在51.5-56 ku 的胞外活性的 appA2。在诱导型 Pichia 系统中获得的植酸酶产量最高，而 Schizo pombe 中的最低，但其有较高的耐热性。四种重组植酸酶最适条件都在55，pH3.5，并且有相同的植酸酶活性。Ullah 和 Sethumadhavan28将 Aspergillus ficuum 和 Pe
25、niophora lycii 分别转化到 Aspergillus niger 和 Aspergillus oryzae 的工程菌株中获得的 Aspergillus ficuum 植酸酶抗逆性较高，但活性不如 Peniophora lycii。1.3.2转基因植物 Ulah 等 29将来自 Aspergillus fumigatus 的植酸酶 phyA 基因转入苜蓿，在苜蓿叶子中表达了稳定的植酸酶，其最适 pH 由5.5变为5.0，并且使叶中植酸含量下降了 l6。Chiera 等 30将大豆的植酸酶于种子中特异表达，从而改善种子中植酸磷的含量，使植酸含量降低至对照组的50。可见，对植酸酶转基因的
26、研究已经不在仅仅停留在模式植物，开始进入应用开发阶段，而且取得了一定的成效。基因来源也更加广泛，不仅是微生物，植物来源的也开始受到重视。1.3.3转基因动物 Golovan 等 31将来自大肠杆菌的植酸酶基因 appA 在小鼠唾液腺特异表达，获得了分子质量为55 ku 的糖基化的有活性的植酸酶，并且粪便中磷的排出量减少了11。Golovan 等 36又将 appA 导入猪的唾液腺，获得了在胃蛋白酶和 pH 为2.5的条件下稳定的植酸酶，其分子质量也在55 ku 左右，而且粪便中磷的排出量减少了75。国内也有植酸酶的转基因动物研究，但都还只处于研究阶段，离应用还有很大的距离。1.4 展望植酸酶作
27、为饲料添加剂，是当今解决畜禽粪便中磷污染的最佳途径，有着良好的应用前景。虽然现在有大量产植酸酶的微生物被报道，但是嗜热、耐酸、高活性并能够催化多种底物反应的植酸酶仍然没有出现。由于目前植酸酶的产量低、成本高，还无法广泛应用于市场但是，随着不同微生物表达系统的完善，植酸酶的成本会越来越低，所以有很大的发展空间。对于植酸酶的性质的改变，主要方向是热稳定性、活性的提高，现今的报道无法在本质上对植酸酶的耐热性和活性进行改造。随着晶体结构研究的发展，植酸酶的功能与结构之间的关系被进一步阐明，为今后植酸酶的改造提供了大量的证据，再加上极端环境下微生物的发展也为植酸酶的研究提供了一个新的窗口，尤其是对高温嗜
28、热古菌研究的不断完善，给新的植酸酶的发现带来了巨大的希望。2 材料与方法2.1 试验材料2.1.1菌种供试菌种: 黑曲霉( Aspergillus niger)由湖南农业大学生物科学技术学院微生物学实验室提供。2.1.2仪器和试剂仪器：Ss-325高压蒸汽灭菌锅（Nerima-Ku，Tokyo，Japan）；QYC 2112立式恒温摇床（上海福玛实验设备有限公司）；DHG-9076A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；250B 恒温生化培养箱（常州市华普达教学仪器有限公司）；SW-CJ-IB(U) 单人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）；UV-9100紫外分光光度计（北京瑞利
29、分析仪器公司）；MC-12810132恒温水浴锅（上海德兆仪器仪表有限公司）；KF-3102电子天平（浙江凯丰集团有限公司）。试剂：玉米淀粉；麸皮；大米粉(市场购得，无霉变和虫蛀)；蔗糖；葡萄糖（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；豆饼粉；蛋白胨；酵母粉；氯化铵（分析纯，河南焦作市化工三厂）；硝酸铵（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；硫酸铵（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；MgSO 47H2O（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；KH 2PO4（分析纯，上海山浦化工有限公司）；KCl（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；MnSO 4 H2O（分析纯，中国金山区兴塔美兴化工厂）；FeSO
30、47H2O（分析纯，中国医药集团上海化学试剂有限公司）；钼酸铵（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；硫酸（分析纯，衡阳市凯信化工试剂有限公司）；三氯乙酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；植酸钠（生化试剂，合肥博美生物科技有限责任有限公司）；植酸钙（生化试剂，上海梯希爱化成工业发展有限公司）。2.1.3培养基 斜面培养基:PDA( 马铃薯-葡萄糖-琼脂) 培养基。液体种子培养基(%)：淀粉 3，葡萄糖 2，NH 4NO3 0.15, MgSO47H2O 0.05，KCl 0.05，FeSO 47H2O 0.01，pH 6.0。液体发酵培养基(%)：淀粉 5，NH 4NO30.1， MgSO
31、47H2O 0.01,MnSO4H2O 0.05, KCl 0.05，KH 2PO40.01, FeSO47H2O 0.01，pH 6.0。2.2 试验方法2.2.1培养方法（1）斜面培养斜面接种后, 28 培养2d, 待长出均匀、较厚的一层绿色孢子后, 贮存于冰箱中备用。（2）种子摇瓶培养取新鲜的斜面种子一管,用接种环挑起一环孢子接入装有100 mL 液体种子培养基的三角瓶(250 mL) 中, 然后将三角瓶置30恒温摇床上, 150 r/min 振荡培养72h。（3）发酵培养按10%（V/V）的接种量将液体种子接入装有100 mL 发酵培养基的三角瓶(250 mL)中, 然后将三角瓶置30
32、恒温摇床上, 以150 r/min 振荡培养4d, 测植酸酶活力。2.2.2发酵条件的研究培养方法同2.2.1，改变基础发酵培养基的配方和发酵条件，如，碳源种类及碳源含量、氮源种类及含量、MgSO 47H2O 含量、MnSO4H2O 含量、培养温度、起始 pH 值、接种量、装量、种龄、发酵时间等，考察其对植酸酶活力的影响。2.2.3 培养基的优化根据单因素单因子试验结果，选取麸皮、NH 4Cl、MgSO 47H2O 和MnSO4H20进行正交优化试验，见表1。表1 因素水平表Table1 Table of facter and level因素 水平A 麸皮（）B NH4Cl（）CMgSO47H2O（）D MnSO4H2O（）1 4 0.10 0.05 0.062 5 0.13 0.10 0.073 6 0.16 0.15 0.082.2.4 酶活力测定方法在37的条件下，1min 内从植酸钠中分解出1g 的无机磷定义为一个酶活单位（U） 。（1）标准曲线的制作KH 2PO4标准溶液的配制称取于110干燥2h 的 KH2PO4（0.21960.0001）g 用水溶解后转移至500 mL 容量瓶中定容至标线并混匀，即得100g/mL 的磷标准溶液。标准曲线的制作 按表2分别加入下列试剂，在50恒温水浴锅内水浴20min，冷却至室温后用紫外分光光度计在660nm 处测其光密度值。
