1、1、概述 2、DNA分子标记的种类与特点 3、DNA分子标记的优点 4、几种DNA分子标记的原理 5、分子标记在果树上的应用,第十一章 DNA分子标记,一、概述,1、遗传标记的概念：是指与目标性状紧密连锁、同该性状共分离且可遗传的等位基因变异。是指能明确反映遗传多态性的生物特征。孟德尔的实验材料豌豆高茎或矮茎、红花或白花、黄色圆粒或绿色皱粒等。摩尔根的实验材料白眼雄果蝇和红眼雌果蝇。,2、特点 多态性不同物种或同一物种不同类群或个体之间，在某个遗传标记上存在明显差异。稳定性（可遗传）遗传标记能稳定地从亲代传递给子代并且表现出来。共显性每一世代中无论是纯合还是杂合状态，某一性状的遗传标记均能将它
2、们区分开来。易观察肉眼或通过简单的检测能将性状的差异显示出来。,可识别与可遗传,3、遗传标记的作用用来研究生物的遗传与变异规律。主要应用于连锁分析、基因定位、遗传作图及基因转移等。在现代分子育种研究中，遗传标记的应用已成为基因定位和辅助选择的主要手段。,A、形态标记(Morphological Markers) ：指能够明确显示遗传多态性的外观性状，如果实大小、颜色、形状、叶片形状等相对差异（典型的形态标记能用肉眼即可识别和观察）。广义的形态标记：生理特性、生殖特性、抗病虫性等。（必须借助简单的测试）,4、遗传标记的发展,形态标记 细胞学标记 生化标记 分子标记,形态标记仍然是应用最广的遗传标
3、记之一，特别是在作物选育种过程中；另外，有关植物分类学研究也应用的特别多。,形态标记的不足：A. 标记数量少，可鉴别的基因有限;B. 形态标记还受到环境、生育期等因素的影响，使之在应用时受到限制。,核 型,B、细胞学标记(Cytological Markers ) ：能显示遗传多态性的细胞学特性。主要有：染色体的核型和带型。,核型：染色体的长度、数量、着丝粒位置和随体的有无等。,带型：染色体经特殊染色显带后，带的颜色深浅、宽窄和位置顺序等，如C带、N带、G带等。,带 型,细胞学标记的优势：克服了形态标记易受环境影响的缺点。 不足:需要花费大量的人力物力。,C、生化标记(Biochemical
4、Markers )许多生物大分子或生物化合物如血型、血清蛋白及同工酶都具有作为遗传标记的潜力。酚类化合物、黄酮类化合物、花色素苷及糖苷类分子曾被用作分子标记（Mckee,1973）。,酶作为遗传标记是在Markert and Moller(1959)提出了同工酶 的概念后迅速发展起来的。同工酶（isozyme）：具有相同的催化功能而结构及理化性 质又不同的一类酶。等位酶(allozyme)：同一基因位点上不同等位酶基因编码的 同种酶的不同分子形式。,同工酶的应用比较广泛，动植物的居群遗传学和进化研究，栽 培植物种质资源的研究、开发和利用等方面。,同工酶酶谱,蛋白质标记是基因表达的产物，受环境的
5、影响较小，能更好的反映遗传多样性。蛋白质标记的不足：数量较少，尽管至今发展了57种酶系统，大约可以鉴定100个左右的基因座位，针对特定的作物来讲，仅有1020种同工酶可用。每一种同工酶的染色方法不同。有组织表达和时空表达特异性。,花粉粒的大小、形状，萌发孔的数量、形状；花粉外壁的饰纹，包括：条瘠隆起程度、走向、多少等，穿孔的大小、多少、形状等。均可作为遗传标记应用于各个方面。,D、孢粉学标记（palynology Markers）花粉的形态特征受植物基因型控制而不受外界条件影响,是探讨植物起源、演化及亲缘关系的重要特征之一。,A, B: The polar view of pollen gra
6、in in Shatangju (CK) (A) and Wuzishatangju (B) showing 4- colpate-lobed circular (2000); C, D: The equatorial view of pollen grain in Shatangju (CK) (C) and Wuzishatangju (D) showing aperture and colporate (2000);,萌发孔的形状,花粉外壁的饰纹，包括：条瘠隆起程度、走向、多少等,The ornamentation of pollen exine in Shatangju (CK) (E
7、) and Wuzishatangju (F) showing smooth pollen exine (7000),5、 理想的遗传标记的特点1）多态性高-表现出差异的特征较多；2）客观-受主观因素和环境因素的影响要小；3）便于检测-即差异比较明显或通过简单的仪器；4）可比性-所得到的数据在不同实验室中能交流。,二、DNA分子标记的种类与特点,1953年，Watson和Crick提出了DNA分子结构的双螺旋模型，圆满解释了DNA就是基因的有机化学实体，宣布了分子遗传学时代的到来。,DNA分子双螺旋结构,分子标记：能反映生物个体或群体间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组间的差异
8、。1980年，人类遗传学家Bostein等首先提出了DNA限制性酶切片段长度多态性（RFLP）作为遗传标记的思想。,1985年，PCR技术的出现，大大促进了DNA分子标记的发展。Mullis等发展的一种聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR），实质是体外合成特异性DNA片段。分成三步：变性、退火、延伸。PCR产物以指数方式即2n递增。如：经过3035个循环，可将2kb的DNA片段从原来的1pg扩增到0.51g（100万倍）,1990年，RAPD（Random amplified length polymorphism）:随机扩增的多态性 1993年，AFL
9、P (Amplified fragment length polymorphism):扩增片段长度多态性 1993, SSR (simple sequence repeats):微卫星DNA又叫简单重复序列 1994年，ISSR (Inter SSR)、AP-PCR, DAF, SCAR, SNP (single nucleotide polymorphism)2000年， TRAP（target region amplified polymorphism ）、SRAP（sequence related amplified polymorphism ）等。,依据对DNA多态性的检测手段，DNA
10、分子标记可以分为四大类：基于分子杂交。该标记技术是利用限制性内切酶酶切及凝胶电泳分离不同的DNA分子，然后与标记的特异DNA探针进行杂交，通过放射自显影或荧光显色技术来揭示DNA的多态性。（RFLP）：基于PCR的DNA标记。利用随机（特异）引物在未知的DNA序列上进行扩增而获得的多态性。RAPD、ISSR（随机引物），SSR（特异引物）、SRAP、TRAP。,：基于PCR与限制性酶切技术结合。（1）先酶切再选扩，如AFLP；（2）先选扩DNA片段，再利用相关内切酶酶切，如CAPS（cleaved amplified polymorphic sequence, 酶切扩增多态性序列 ）：基于单核
11、苷酸多态性的DNA标记。如SNP标记，多用DNA芯片技术进行分析。,RAPD,AFLP,三、DNA分子标记的优点,和以前的遗传标记相比，DNA分子标记有以下的优点：1、准确可靠；2、巨大的信息量；3、受环境影响小；4、检测手段简单快捷，易于实现自动化。,四、几种DNA分子标记基本原理,RFLP,酶切电泳图,基 本 步 骤,用DNA限制性内切酶消化,Southern杂交,放射性自显影或酶学检测,DNA提取,凝胶电泳分离，转移到滤膜上,RFLP的特点 A.无表型效应，RFLP标记的检测不受环境条件和发育阶段的影响。 B.RFLP标记在等位基因之间是共显性的，因此在配制杂交组合时不受杂交方式的影响。
12、 C.在非等位的RFLP标记之间不存在上位效应，因而互不干扰。 D.RFLP标记起源于基因组DNA的自身变异，在数量上几乎不受限。 E.DNA需要量大（5-10g），检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。 在植物分子标记辅助育种中需要将RFLP转换成以PCR为基础的标记。,RAPD,RAPD电泳图,RAPD标记的主要特点有：（1）不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息；（2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子；（3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；（4）DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；（5）实验重复性差，结果可靠性低。,SSR,SSR标记的主要特
13、点有：（1）数量丰富，广泛分布于整个基因（2）具有较多的等位性变异；（3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；（4）实验重复性好，结果可靠；（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。,ISSR,ISSR标记的主要特点有：（1）不需DNA探针，使用通用引物，无须知道序列信息；（2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子；（3）技术简便，基于PCR技术的分子标记；（4）DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；（5）实验重复性较差，结果可靠性较低。,AFLP,酶切与连接,预扩增,选择性扩增,EcoR接头,AFLP标记的主要特点有： （1）由
14、于AFLP分析可以采用的限制性内切酶及选择性碱基种类、数目很多，所以该技术所产生的标记数目是无限多的； （2）典型的AFLP分析，每次反应产物的谱带在50-100条之间，所以一次分析可以同时检测到多个座位，且多态性极高； （3）表现显性或共显性，呈典型孟德尔式遗传； （4）分辩率高，结果可靠； （5）目前该技术受专利保护，用于分析的试剂盒昂贵，实验条件要求较高。但也存在假阳性带出现频繁、技术复杂、成本高等缺点。,几种常用的分子标记比较RFLP RAPD 小卫星 SSR ISSR AFLP遗传特性 共显性 显性 共显性 共显性 显性 显性多态性水平 低 中等 中等 高 高 高检测位点数 14 1
15、10 10-100 1 40100 20-150重现性 高 低 高 高 中等 高DNA质量要求 高 低 高 低 低 高DNA用量 510g 50ng 5-10g 50ng 50ng 250ng-5g技术要求 高 低 高 高 低 高耗时 多 少 多 少 少 中成本 高 低 中等 高 中 高,五、DNA分子标记在果树上的应用,1、为果树分类学提供新的证据,2、果树种质资源的鉴定与亲缘关系的研究；,3、系谱关系的确定；,4、果树遗传图谱的构建；,5、目标基因的标记和标记辅助育种；,6、杂种、体细胞杂种、突变体、珠心苗与合子苗的鉴定。,同物异名品种鉴别,芽变品系鉴别,品种分类研究RAPD分析,品种分类研究树状图,父本系谱关系的鉴别,树状图中的系谱关系,f m,M04,分离位点的获得,连锁图谱构建,连锁群之一,荔枝焦核突变体的鉴定,分子标记是一种有效的工具，但要善于掌握与利用。用得好，事半功倍，用不好，步入谬误。 分子标记技术应结合常规育种技术，才能有更强的生命力。 如果分子标记的研究结果与传统研究结果相矛盾，怎么办？ 研究工作中的严谨精神至关重要，必须克服模糊的东西，获取最可靠的数据。,小结（体会）,The end！,
