1、DNA分子遗传标记在中药中的应用,DNA分子遗传标记,广义的分子标记（molecular marker）是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。常用的是狭义的分子标记概念，即DNA分子标记。DNA分子标记主要分为以下三类 一、限制性片段长度多态性（RFLP）：是发展最早的分子标记技术，以分子杂交为核心技术。 二、DNA序列测定,三、基于PCR的分子标记：根据引物的选择可分为随机引物扩增和特定序列位点扩增。 随机扩增多态性DNA（Random amplified polymorphic DNA,RAPD）。随机引物扩增PCR（Arbitrary Primer-PCR,AP-PCR）,2、DNA
2、扩增产物指纹分析（DNA amplification fingerprinting,DAF）:与RAPD技术不同的是引物浓度更高，长度更短（58个bp），只有2个温度循环（在RAPD中是3个温度循环），一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳。 3、特征扩增区段测序（Sequence-characterized amplified regions，SCAR）：先做RAPD分析，然后克隆目标RAPD片段进行测序，根据RAPD片段两末端的序列设计特定引物（一般比RAPD引物长，24bp），再进行PCR扩增，可把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴定出来，可重复性高。,RFLP技术及其应用,RFLP(Restrict
3、ion Fragment Length Polymorphism，限制性内切酶切片段长度多态性)是70年代发展起来的DNA片段分析技术。该技术不仅在生物学、医学、农学的许多领域都有了成功的应用，而且在中药材品种基源及其地理品系、栽培品系的质量评价方面也有许多应用。,基本原理,生物在进化过程中，由于种种原因引起基因突变和DNA分子结构重排，造成了分子内核苷酸排列顺序的改变，当这种改变涉及到限制性酶切位点时，酶切后产生的DNA片段长度将发生变化，限制性片段的长度在不同个体间呈多态性现象，即称为限制性片段长度多态(Restriction Fragment Length Polymorphism,简称
4、RFLP),Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP),Enzymes cut DNA at specific sequences Restriction sites are often palindromes: 6-cutter GAATTC 4-cutter TCGACTTAAG AGCT,DNA多态性根据其产生的两种基本方式,碱基对突变类型(基因点突变),即限制性内切酶识别位点上发生了单个碱基替换(转换或颠换)，使原有切点消失或产生新的切点。 结构重排型，这是由DNA内部发生较大的顺序变化所引起的 。,RFLP与镰状细胞贫血,基本实验步
5、骤,靶DNA的准备 核酸探针的标记 杂交显示,RFLP的优点及局限性,优点：(1)普遍存在 (2)稳定性 (3)共显性 (4)探针与限制酶的组合数量无限 局限性：（1）用RFLP仅能检测出影响到限制性内切酶识别位点的突变 （2）步骤多，工作量大，而且接触的放射性污染也多（3）RFLP分析技术要求DNA无显著降解，因此只适用于新鲜的材料，难适用于干燥药材的鉴别 （4）限制性内切酶价格较贵,RFLP用于亲缘关系分析,“Ladder”,RFLP在中药材鉴别中的应用,（一）近缘种的鉴别如：海马的PCR-RFLP分析 （二）药用植物亲缘关系的研究如：羽扇豆属植物系统发育关系及与生 物碱分布的关系,RAP
6、D技术及其应用,RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)技术是1990年由杜邦公司Williams和Welsh两个研究小组同时发展起来的一项DNA多态检测技术。该技术高效、灵敏、简便、快速，一经出现就被普遍用于物种种属分类、亲缘关系分析、物种起源鉴定、目的基因筛选、农作物育种等研究领域。近年，RAPD技术又进入了中药材的鉴别研究领域，并得到广泛应用，已成为目前用于中药材鉴定报道最多的分子遗传标记技术。,RAPD技术基本原理,RAPD的核心技术是PCR反应，但又不同于经典的PCR。它是以任意序列的寡核苷酸为引物进行PCR扩增，Willia
7、ms称之为RAPD，引物通常为10个碱基；Welsh称之为AP-PCR(Arbitrary Primer PCR)，引物为2030个碱基。对于任一引物，如在一定范围内模板DNA上有与之互补的反向重复序列时，就可扩增出此范围的DNA片段。,RAPD: randomly amplified polymorphic DNA,基本实验步骤,模板DNA的制备 PCR扩增，通常RAPD扩增条件为：93预变性200s，开始如下循环：94变性lmin，36退火1min，72延伸2min；经过40个循环后，72延伸5min，循环结束后反应产物置于4保存。 扩增产物20l反应产物走凝胶电泳，经溴化乙锭染色检测扩增
8、的情况 RAPD图谱的数据处理,RAPD分析的优越性和不足,优越性：(1)无需预知被研究的生物基因组核苷酸顺序，也无需专门设计RAPD扩增反应的引物，引物随机合成或是任意选定的,长度一般为9-10个寡核苷酸；(2)扩增没有特异性；(3)退火温度较低，一般为36，这能保证短核苷酸引物与模板的稳定配对，同时也允许了适当的错误配对，以扩大引物在基因组DNA中配对的随机性。(4)简便易行，省力省时。（5）检测灵敏方便；（6）所需样品DNA量极少，仅为10ng,为RFLP的1/l000l/2000。（7）能自动化。,不足：（1）重复性不高。RAPD在扩增反应时使用的是低温复性(通常为36),特异性不高,
9、引物与模板间有较高的错配率,结果容易受到多种因素的影响,不同的实验室这间有时不能重复；（2）对模板DNA质量要求高，操作要求严格，检验成本相对较高；（3）由于存在共迁移，分子量相同的片段可能不是同源的；另外一条带中可能含有不同的扩增产物；（4）RAPD标记难以区分开杂合子和纯合子基因型，不能有效的鉴定出杂合子。,M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516,不同Mg2+和dNTP浓度对RAPD带型的影响,1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112M,不同Taq和Primer浓度对RAPD带型的影响,M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13,M
10、 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25,不同循环量和模板DNA浓度对RAPD带型的影响,M 1 2 3 4 5 6 CK 7 8 9 10 11 12,不同复性温度对RAPD带型的影响,图4 不同复性温度对RAPD带型的影响 Fig 4 Effect on RAPD profiles in different annealing temperature,M 1 2 3 4 5 6 CK 7 8 9 10 11 12,不同复性温度对RAPD带型的影响,RAPD分析在中药研究中的应用,道地药材的评价 例：当归药材道地性的RAPD分析 野生与栽培种及不同农家品
11、种 亲缘关系分析例：人参及山参RAPD指纹 动物药的鉴定 例：蛇类药材分子遗传标记鉴别的研究,AFLP技术及其应用,扩增酶切片段多态性 (Amplified Restriction FragmentPolymorphism)是一种基于PCR的DNA指纹技术 ，AFLP是近几年来继RFLP、RAPD之后发展最快的DNA分子标记技术。被誉为新一代的分子标记技术，近年来已得到广泛的应用。,AFLP基本原理,AFLP的基本原理是对基因组DNA限制性酶切片段进行选择性扩增。 先将基因组DNA用限制性酶消化，产生粘性末端。然后使用人工合成的双链接头（artificial adapter）,与基因组DNA的
12、酶切片段相连接形成扩增反应的模板。接头和与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列作为引物的结合位点。AFLP反应的结果是主要扩增那些由上述两种酶共同酶切的片段。,基本实验步骤,模板的制备：即DNA酶切及人工接头的连接（Restriction of the DNA and ligation of oligonucleotide adapters） 限制性片段的选择性扩增（Selective amplification of sets of restriction fragments） 扩增产物凝胶电泳分析（Gel analysis of the amplified fragments）,AFLP的实验
13、过程,AFLP反应流程： AFLP反应程序主要包括模板DNA制备，酶切片段扩增及凝胶电泳分析这3个基本步骤。各步骤具体的过程有： 首先要制备高分子量(HMW)基因组DNA，选择6个碱基识别位点的限制性内切酶(通常是EcoRI或PstI或SacI)。 酶切后的限制性片段在T4连接酶的作用下与特定的接头相连接，形成带有接头的特异性片段。 DNA片段的预扩增。 在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的选择性扩增。 PCR产物变性后在含尿素的聚丙烯酰胺变性胶上电泳。 多态性比较分析，特异片段回收克隆分析。,为什么用双酶解?,适合PCR扩增的效率与变性胶的分辨率 减少PCR扩增的片段,从而减少使用选择性碱
14、基的数目 使标记单链成为可能 增加PCR扩增的灵活性 增加使用引物的灵活性,为什么要预扩增?,减少选择性碱基的错配 降低背景噪音,AFLPs,荧光标记全自动AFLP,For ABI 377 DNA Sequencer and AFLP Kits,AFLP技术特点,扩增效率高，多态性比例高 AFLP标记稳定可靠，不受基因组来源和复杂度的影响，没有种属特异性 AFLP技术较简便易行，不需要Southern杂交，不需要预先知道DNA的顺序信息，对模板浓度的变化不敏感，允许一定程度的共扩增，且只需要极少量的DNA材料 AFLP是一项专利技术，受专利权保护，其分析试剂盒价格偏高,AFLP的重复性问题,J
15、ones et al.（1997）同一实验在欧洲的8个实验室重复，172条带只有1条在一次实验中没有，重复率99.4%，与SSR的水平相当。（Jones, C. J. et al. 1997. Reproducibility testing of RAPD, AFLP and SSR markers in plants by a network of European laboratories. Mol. Breed. 3:381-390),AFLP在分子中药中的应用,AFLP技术可产生丰富而稳定的遗传标记，它可以用于药用植物遗传分析的各个方面，如分类、系统发育、品种鉴别、遗传图谱构建及目的基
16、因的定位等 例：AFLP法构建人参、西洋参基因组 DNA指纹图谱,微卫星标记分析（SSR）,微卫星中重复单位的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列有可能不完全相同，因而造成多个位点的多态性。如果能够将这些变异揭示出来，就能发现不同的SSR在不同的种甚至不同个体间的多态性。 SSR标记又称为sequence tagged microsatellite site,简写为STMS，是目前最常用的微卫星标记之一。由于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，因而可以将微卫星侧翼的DNA片段克隆、测序，然后根据微卫星的侧翼序列就可以人工合成引
17、物进行PCR扩增，从而将单个微卫星位点扩增出来。由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异，个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性，这一多态性称为简单序列重复长度多态性(SSLP)，每一扩增位点就代表了这一位点的一对等位基因。由于SSR重复数目变化很大，所以SSR标记能揭示比RFLP高得多的多态性。,SSR位点标记的优点,约50%呈多态性 共显性 数目多且在基因组中均匀分布 多数位点呈选择中性，符合群体遗传学了理论 技术上适合用PCR分析半自动化，结果可靠 部分降解的DNA样品也可用 适合于等位酶变异小的居群水平的研究,SSR位点标记的缺点,可用的位点数目少 设计引物的费用高，耗时长 物
18、种专一性 在说明群体分化和物种分化时可能产生错误,SSR标记的应用领域,遗传图谱的构建 连锁分析特殊的基因（如感病基因） 姻亲分析样品鉴定（如父本分析、血缘分析、等号样品分析、杂种分析） 物种和居群的遗传多样性 群体遗传学分析（如有效群体大小、群体遗传结构、群体分化、迁移与基因流动） 传粉生物学与散布生物学（如花粉和种子的散布、交配系统） 保护生物学,Comparison among genetic markers,由微卫星衍生的微卫星标记,微卫星引物PCR(MP-PCR) 也叫单引物扩增RCP(single amplification PCR,简写为SPAR) 该方法是利用单个微卫星的人工合
19、成寡核苷酸片段为引物进行PCR扩增。可以想象，如果两个反向排列的微卫星出现于同一可扩增的范围内，这两个反向排列的微卫星间的序列就可扩增出来，因而该方法称为微卫星引物PCR。 用此方法扩增出来的是两个反向排列的微卫星之间的序列，并非微卫星位点本身。实践证明，用该方法对三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸重复的微卫星位点的扩增效果较好，而对二核苷酸位点重复的扩增效果较差。,ISSR(Intersimple sequence repeat) 这是Zietkiewitcz等(1994)发展起来的又一种微卫星基础上的分子标记。 与SSR标记相反，该法是直接利用同位素标记的SSR序列为引物，用PCR的方法扩增两个
20、SSR之间的单拷贝序列。 为增加特异性，设计引物时在引物的5端和3端分别引入12个选择性碱基，引物长度1618bp，扩增产物通过放射自显影显现，这样其扩增物就是MP-PCR扩增产物中的一部分，提高了实验结果的可重复性。 ISSR引物的开发不象SSR引物一样需测序获得SSR两测的单拷贝序列，开发费用降低。与SSR标记相比，ISSR引物可以在不同的物种间通用，不象SSR标记一样具有较强的种特异性；与RAPD和RFLP相比，ISSR揭示的多态性较高，可获得几倍于RAPD的信息量，精确度几乎可与RFLP相媲美，检测非常方便，因而是一种非常有发展前途的分子标记，已用于遗传作图、品种鉴定等研究。,DNA测
21、序技术及其应用,DNA测序原理 及方法 优点及不足 优点：DNA测序技术重现性好、结果准确清楚，而且可以利用已测物种的DNA序列建立“对照序列”文库 ，避免设立对照品。新测定的DNA序列也可加入此对照文库中，供他人参考；不足：操作相对复杂，成本高，不易普及,在中药研究中用于测序的基因,叶绿体基因组 线粒体基因组 核糖体基因,DNA分子遗传标记在中药鉴定中的应用,1在植物进化、分类、鉴定中的应用应用分子遗传标记技术来研究种间、属间的DNA变异情况，从而揭示物种的亲缘关系，为物种鉴定及系统学研究提供依据。,采用RAPD分子标记方法比较4种甘草属植物光果甘草、乌拉尔甘草、刺甘草和刺果甘草的遗传关系。
22、 通过DNA扩增的RAPD指纹图谱分析，结果发现富含甘草甜素的光果甘草和乌拉尔甘草之间遗传关系非常相近。,这两者与不含甘草甜素或含量极低的刺甘草和刺果甘草的遗传关系则较远，与植物分类学研究相吻合。,2在中药材鉴别中的应用 通常PCR扩增的模板DNA都来自新鲜的动植物组织材料，因DNA分子遗传标记方法用于生药鉴别中，首先要解决的问题是能否从干的或陈旧的生药样品中提得生药本身的DNA，并能用于PCR扩增，这方面已有成功的报道。,用RAPD方法对人参、三七及4种人参伪品的DNA进行PCR扩增，所得DNA指纹图谱可用于区别人参属的3种生药及伪品。,3在道地生药鉴定中的应用 一个物种的种内多样性是道地药材品质形成的生物学基础。 道地生药与非道地生药的本质区别是作用物质基础有效成分的差异，其形成主要受遗传因子和环境因子的影响。,应用DNA遗传标记技术，比较道地生药与非道地生药的基因差异，将有助于阐明道地生药的成因。,
